CN103013878B

CN103013878B - 防治番茄黄化曲叶病毒病的生防菌株1bqn14 及其应用

Info

Publication number: CN103013878B
Application number: CN201210549296.3A
Authority: CN
Inventors: 刘红霞; 郭坚华; 丁雪玲
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-12-17
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-12-17
Also published as: CN103013878A

Abstract

本发明属于蔬菜病害防控技术领域，涉及防治番茄黄化曲叶病毒病的生防菌株1BQN14及其应用。一种防治番茄黄化曲叶病毒病的生防菌株1BQN14，于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.5803。该菌株可在制备防治番茄黄化曲叶病毒病的药物中应用。该菌株的生防菌剂稀释至1×10⁷-1×10⁸CFU/ml浓度时使用，对番茄黄化曲叶病毒病的防效为50.11-55.38％，病田增产效果为14.56％-19.26％。

Description

防治番茄黄化曲叶病毒病的生防菌株1BQN14 及其应用

技术领域

本发明属于蔬菜病害防控技术领域，涉及防治番茄黄化曲叶病毒病的生防菌株1BQN14及其应用。

技术背景

番茄黄化曲叶病毒病现在已成为限制我国番茄生产的重要病害之一，被称为植物病害的“癌症”。该病害是由双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）引起的，并通过烟粉虱传播。与其他病毒病相比，番茄黄化曲叶病毒病具有爆发突然、发病凶猛、扩展迅速、危害性强、治疗难度大的特点，发病后没有很好的药剂防治。

番茄是我国重要的经济作物，20世纪90年代，番茄黄化曲叶病毒病在我国广西、云南、海南和台湾等地区零星发生。近年来，该病在我国已逐步由南向北急速蔓延。现在除湖南，青海，黑龙江，甘肃等少数省份没有发现该病毒病外，其余各地均有发生，给当地番茄生产造成了极其严重的损失。据不完全统计，目前我国番茄黄化曲叶病毒病的年发生面积超过6.7万hm²，经济损失超过20亿元。

目前市面上的化学药剂对该病毒病均没有较好的防治效果，同时大量使用化学药剂往往会造成环境污染、农药残留等问题。培育抗病品虽然是防治番茄黄化曲叶病毒病的最好途径，但是由于番茄黄化曲叶病毒病的抗性遗传较复杂，抗源材料不同，其抗性遗传规律也不同，有的抗源材料的抗性属于不完全显性的单基因控制，有的属于数量性状，有的属于显性单基因。不同抗性材料之间进行组合，其基因互作效应不同，有正协同、负协同效应或无效应。因此鉴于遗传机理和背景的复杂性，很难选育出抗性稳定的育种品系。

综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物制剂控制番茄黄化曲叶病毒病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全及可持续发展的需要，符合社会发展需求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中没有对番茄黄化曲叶病毒病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治番茄黄化曲叶病毒病的单一生防菌菌株及其菌剂。

本发明的另一目的是提供该菌株的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治番茄黄化曲叶病毒病的生防菌株1BQN14，分类命名为Enterobacter asburiae，于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.5803。

生防菌株1BQN14用于制备生防菌剂的方法为：将阿氏肠杆菌1BQN14的种子菌液以1∶500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、180rpm培养48h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

所述的保藏号为CGMCC NO.5803的阿氏肠杆菌1BQN14种子菌液制备方法为：将保藏号为CGMCC NO.5803的阿氏肠杆菌1BQN14菌株接种到LB培养液中28℃培养180rpm振荡培养至600nm处的OD值为0.8时结束培养。

所述的保藏号为CGMCC NO.5803的生防菌株1BQN14在制备防治番茄黄化曲叶病毒病的药物中的应用。

所述的生防菌剂在防治番茄黄化曲叶病毒病中的应用。

所述的生防菌剂稀释100-1000倍后在番茄移栽时进行灌根和喷雾处理，15天为一个间隔周期共处理2次，发病时开始统计病情。阿氏肠杆菌1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的防效为50.11-55.38％。

有益效果：

本发明是专门针对番茄黄化曲叶病毒病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于蔬菜的出口。

温室实验表明：该阿氏肠杆菌1BQN14（CGMCC NO.5803）能显著降低番茄黄化曲叶病毒病的发生。利用该菌制备的生防菌剂稀释100倍在移栽时进行灌根和喷雾处理，在温室条件下对番茄黄化曲叶病毒病的生防效果可以达55.38%。

生物样品保藏信息

一种阿氏肠杆菌1BQN14，分类命名为Enterobacter asburiae，于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5803。

具体实施方式

实施例1

筛选方法：阿氏肠杆菌1BQN14（CGMCC NO.5803）由江苏省连云港市沙河镇番茄大棚内的番茄根围分离到的。将番茄根组织切成1cm的小片，用1%的次氯酸钠浸泡5min，70%酒精浸泡1-2min，无菌水清洗3次（取最后一次清洗的溶液100μl涂于R2A固体培养基上培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌）。取3g消毒好的样品置于菌研钵中，加入27ml无菌的0.85%NaCl，浸软组织，研磨，用无菌的0.85%NaCl梯度稀释。取10^-1、10^-2、10^-3三个梯度的稀释液各100μl涂于R2A上，28°C培养48h。挑取最大的单菌落接种到新鲜R2A固体培养基，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用40%甘油保存于-70°C超低温冰箱中。

鉴定方法：通过形态特征，生理生化实验和16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定。

形态学特征：杆状，周鞭毛，菌落光滑，成淡黄色。

生理生化特征：

1BQN14菌株生理生化特征

16S rRNA基因扩增和序列分析:

将该菌株在R2A培养基中28℃培养至对数期,以12000r/min离心5min收集菌体,采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rRNA扩增通用引物U8-27(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)、L1494-1514(5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’)从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定16S rRNA基因序列进行同源性比较。

1BQN14菌株的测序比对结果

实施例21BQN14生防菌剂的制备

将阿氏肠杆菌1BQN14（CGMCC NO.5803）菌株接种到LB培养液中28℃180rpm振荡培养16h后，每隔2h在超净工作台中取样测其在600nm处的OD值，当OD值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1∶500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、180rpm培养48h，然后6000rpm离心10min，取沉淀即得所述的生防菌剂1BQN14。所得生防菌剂中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

实施例3温室试验测定1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的防效

番茄4叶期时进行移栽，移栽同时进行灌根和喷雾处理。实施例2制备的1BQN14（CGMCCNO.5803）菌剂灌根浓度为1×10⁸CFU/mL，每棵苗用量为20ml。喷雾浓度为1×10⁷CFU/mL，喷雾标准是每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准，每个地方都需要喷施到生防菌剂处理后第5天接种番茄黄化曲叶病毒。第1次处理15天后进行第2次相同处理。用只接种病毒不进行生防菌的处理作为对照处理。每个处理组24株番茄，三次重复。将番茄置于温度为28℃，光照为12h/12h温室条件下培养，待发病时调查病级数，计算病害严重度和防效。

按照M Jos′e D′iez和Fernando Nuez 1997年提出的病情分级标准，计算病害严重度和防效。番茄黄化曲叶病毒病病情分级标准为：

0级：无症状。

1级：顶部叶片轻度黄化，叶边缘轻度卷曲。花期花轻度脱落。

2级：顶部叶片中度黄化，叶边缘中度卷曲褶皱。花期花轻度脱落，结果期产量轻度减产。

3级：叶片严重黄化，卷曲，褶皱。花期花中度脱落，结果期产量中度减产。

4级：大面积叶片严重畸形缩小，植株生长缓慢，明显矮化。花期花严度脱落，结果期产量严重减产或绝产。

病害严重度％=[∑(发病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)]×100％，

生物防治效果％=[(对照病害严重度-处理病害严重度)/对照病害严重度]×100％

在生防菌剂1BQN14第1次处理35天后的调查结果显示，生防菌剂1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的生物防治效果（以下简称防效）达到55.38％（表1）。

表1生防菌剂1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的生防效果

注：此结果为1BQN14处理35天（对照组发病20天）后的防效统计结果。

实施例4日光大棚田间验证生防菌剂1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的防效

实验地点：连云港市赣榆县沙河镇番茄日光大棚

番茄品种为“格瑞斯”。大田试验共设2个处理组，分别为实施例2制备的1BQN14（CGMCCNO.5803）生防菌剂处理和清水对照处理。每处理设3个小区，每个小区40棵苗，各小区随机区组排列，小区之间以保护行隔离。第1次处理15天后进行第2次相同处理。施药方法为同时采用喷雾和灌根处理。喷雾标准是：每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准，每个地方都需要喷施到。喷雾浓度为1×10⁷CFU/mL，灌根时生防菌剂随定根水一同浇下去。

数据显示，番茄移栽40天后生防菌剂1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的防效达到50.11％（表2）。

表2生防菌剂1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的生防效果

注：此结果为1BQN14处理40天（对照组发病20天）后的防效统计结果。

同时，我们进行了产量的统计。结果显示，与对照相比生防菌剂1BQN14对番茄的增产效果为14.56％（表3）。

表3生防菌剂1BQN14对番茄产量的影响

实验地点：扬州市高邮市高邮镇番茄日光大棚

番茄品种为“格瑞斯”。试验共设2个处理，分别为实施例2制备的1BQN14（CGMCCNO.5803）生防菌剂处理和清水对照处理。每个处理设3个小区，每个小区50棵苗，各小区随机区组排列，小区之间以保护行隔离。第1次处理15天后进行第2次相同处理。施药方法为同时采用喷雾和灌根处理。喷雾标准是：每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准，每个地方都需要喷施到。喷雾浓度为1×10⁷CFU/mL，灌根时生防菌剂随定根水一同浇下去。

数据显示，番茄移栽45天后生防菌剂1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的防效达到51.60％（表4）。

表4生防菌剂1BQN14对番茄黄化曲叶病毒病的生防效果

注：此结果为1BQN14处理45天（对照组发病20天）后的防效统计结果。

同时，我们对番茄产量进行了统计。结果显示，与对照处理相比生防菌剂1BQN14处理对番茄的增产效果为19.26％（表5）。

表5生防菌剂1BQN14对番茄产量的影响

Claims

1.一种防治番茄黄化曲叶病毒病生防菌株1BQN14，分类命名为阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae），2012年 2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.5803。

2．用权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5803的生防菌株1BQN14制备的生防菌剂。

3．用权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5803的生防菌株1BQN14制备生防菌剂的方法，其特征在于：将权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5803的生防菌株1BQN14在LB培养液28℃ 180 rpm振荡培养48 h，然后6000 rpm离心10 min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，成品菌剂中活菌总浓度为1×10⁹ -1×10¹⁰ CFU/mL。

4．权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5803的生防菌株1BQN14在制备防治番茄黄化曲叶病毒病的药物中的应用。

5. 权利要求2所述的生防菌剂在防治番茄黄化曲叶病毒病中的应用。