CN102876584A

CN102876584A - 炭角菌菌株及其用途

Info

Publication number: CN102876584A
Application number: CN2012101049976A
Authority: CN
Inventors: 章初龙; 林福呈; 冯晓晓; 李颖
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-04-11
Also published as: CN102876584B

Abstract

本发明公开了一种炭角菌菌株，保藏名称为：Xylaria striata RK1-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2012101。该菌株RK1-1属于真菌界(Fungi)，双核亚界(Dikarya)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariomyceta)，炭角菌目(Xylariomycetidae)，炭角菌科(Xylariales)，炭角菌属(Xylariaceae)。该菌株RK1-1能用于促进植物生长或增加生物量。

Description

炭角菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是一种内生真菌炭角菌菌株及其对促进植物生长等的影响作用。

背景技术

内生真菌广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响，对植物生长发育、抵抗病虫害等具有广泛的生物学作用，同时在一些植物及农作物的广泛应用具有重要意义。随着环境问题的持续恶化，植物资源经受着严峻的考验，而内生真菌对植物的影响是多方面的，已经成为当今国内外研究的热点问题之一。在农业生产、生态保护、中药资源开发、医药卫生的发展都有重要的现实意义。近年来，人们发现在植物体存在有益的内生细菌和内生真菌，内源性菌株对植物病害的防治作用及生物开发应用已引起科学家的广泛关注。植物内生真菌主要分布于植物的种子、花、茎、叶和根系中，与植物的关系是互惠共生的，而且植物内生真菌可以提供光合产物及矿物质，内生真菌代谢产物能够刺激寄主植物的生长发育，提高寄主植物的生物应激和非生物胁迫抗性能力，即两者之间存在物质与能量的循环交流，植物内生真菌对寄主植物的积极地促生效应，部分是通过植物内生真菌分泌的活性物质或者次级代谢产物对植物的生长作用的结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型的炭角菌及其用途，该菌株能促进植物，尤其是栽培水稻，栽培烟草以及栽培黄瓜的生长。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种炭角菌菌株：保藏名称为：Xylaria striataRK1-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2012101。

本发明还同时提供了上述炭角菌菌株的用途，其特征是：用于促进植物生长或增加生物量。

作为本发明的炭角菌菌株的用途的改进：植物为水稻、烟草或黄瓜。

本发明的炭角菌菌株RK1-1(即Xylaria striata RK1-1CCTCC NO：M2012101)具有如下特性：菌种在PDA培养基上的适宜生长温度为25℃；菌落白色，培养3天后直径2厘米，培养10天后直径9厘米，呈辐射状蔓延，之后生长减缓，并从菌落中心处开始出现黑色炭化菌丝。

本发明的菌株是从植物疣粒野生稻中分离得到的，它属于真菌界(Fungi)，双核亚界(Dikarya)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariomyceta)，炭角菌目(Xylariomycetidae)，炭角菌科(Xylariales)，炭角菌属(Xylariaceae)。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为炭角菌RK1-1在培养基上的形态图；

左图为正面形态图，右图为背面形态图；

图2为炭角菌RK1-1对水稻的促生作用图；

图3为炭角菌RK1-1对烟草的促生作用图；

图4为RK1-1对烟草叶片和根系个数的影响图；

图5为RK1-1对烟草叶片和根系长度的影响图；

图6为RK1-1对烟草叶片鲜重和干重的影响图；

图7为炭角菌RK1-1对黄瓜的促生作用图；

图8为炭角菌RK1-1处理黄瓜促生作用的根部长度比较图；

图9为RK1-1对黄瓜叶片生物量的影响柱状图；

图10为RK1-1对黄瓜根部生长影响柱状图。

具体实施方式

实施例1、炭角菌(Xylaria striata)菌株的分离培养与鉴定：

2％麦芽汁琼脂培养基(malt extract agar，MEA)：在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(11个大气压，121℃下灭菌20min)。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)：在马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(11个大气压，121℃下灭菌20min)。

在实验室中按下列条件分离培养，即可获得本发明所述的炭角菌。

从我国云南西双版纳自然保护区采集野生稻(Oryza granulata)，将采集的野生稻用自来水漂洗干净，野生稻根茎在75％(v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1％(v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无菌水漂洗3次。用无菌刀片将根切成约0.6cm长的片段，置于含50μg·ml^-1氨苄青霉素和50μg·ml^-1链霉素的2％麦芽汁琼脂培养基(MEA)平皿上，25℃暗培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基；分离得到菌落白色，培养3天后直径2厘米，培养10天后直径9厘米，呈辐射状蔓延，之后生长减缓，并从菌落中心处开始出现黑色炭化菌丝的菌株，25℃暗培养，在PDA培养基上连续三次接种，确认为单菌落，没有其他真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养，命名为RK1-1。

该菌剂为炭角菌菌株，进行了如下保藏：保藏名称为：Xylaria striata RK1-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2012101。

实施例2、菌株RK1-1的鉴定：

本发明的炭角菌菌株RK1-1(即Xylaria striata RK1-1CCTCC NO：M2012101)具有如下特性：菌种在PDA培养基上的适宜生长温度为25℃；菌落白色，培养3天后直径2厘米，培养10天后直径9厘米，呈辐射状蔓延，之后生长减缓，并从菌落中心处开始出现黑色炭化菌丝。形态图如图1所示。

实施例3、炭角菌RK1-1对水稻的促生作用：

首先需要对水稻进行无菌苗的培养：

(1)无菌环境下育种：将水稻种子去壳，将种子放置在灭过菌的玻璃瓶中，先用无菌水冲洗2次，用75％(体积浓度)乙醇浸泡10min，随后用1％(质量浓度)的NaCl0表面消毒10min(充分摇匀)，最后用无菌水清洗4次后备用。

(2)配制MS培养基，配方如下表1(为常规技术)：

表1、MS培养基配方

(3)种子萌发培养基为1/2MS培养基：将上述种子均匀平铺在预先准备的1/2MS培养基，完毕后用Parafilm封口膜封住平皿，在25℃恒温培养箱培养(16h光照，光照强度100μmol m^-2.s^-1/8h黑暗)。4～5d后种子开始露白，种子边缘处长微生物的则表明污染，将其剔除掉。

其次进行炭角菌真菌RK1-1与水稻无菌苗共培养：

(1)上述无菌水稻种子在1/2MS培养基上生长4～5d后，即可选取生长一致的幼苗转入方形无菌培养皿(13cm×13cm)中。方形无菌培养皿中同样需要事先倒入1/2MS培养基，并在培养基冷凝之后，切掉1/3体积(位于上方)的培养基，目的是防止根因为向上生长而减少了与下方的内生真菌(炭角菌RK1-1)及其代谢产物的接触。

(2)采取根部接种，无菌水稻苗的种子部位放置在靠近切割线位置的培养基上，每个培养皿中摆放8棵水稻苗，根部朝有培养基的方向，轻按种子使其不会掉落。在方形无菌培养皿中下部接上炭角菌RK1-1的菌块4块，并设对照组为不含菌株RK1-1的1/2MS培养基。接种过程都需要在超净工作台上进行严格无菌操作，使用的培养皿、锥形瓶、培养基、无菌水等都需要在灭菌锅中高压灭菌。

(3)将方形培养皿竖直放置于16h:8h(光照：黑暗)25℃恒温光照培养箱中培养，光照强度100μmol m^-2.s^-1。

(4)定期观察水稻的生长情况。

(5)拍照。统计炭角菌RK1-1对水稻的生长效应，观察促生情况。

结果表明：用RK1-1处理过的水稻在叶片和根部无明显表现，但是用RK1-1处理过的水稻的茎比对照粗壮，如图2所示，说明RK1-1对水稻有促进生长的作用。

实施例4、炭角菌RK1-1对烟草的促生作用

首先是烟草无菌苗的培养：

(1)将烟草种子用无菌水预浸泡48h，然后用70％(体积浓度)的酒精灭菌1min，2％的(质量浓度)次氯酸钠灭菌10min，无菌水冲洗多次后备用。

(2)置于MS培养基上(25℃，16h光照，光照强度100μmol m^-2.s^-1/22℃，8h暗培养；相对湿度RH 60％)萌发10天左右。

其次是炭角菌RK1-1与烟草无菌苗共培养：

(1)将MS培养基，倒入方形无菌培养皿中(13cm×13cm)，冷凝后，切掉1/3体积的培养基。

(2)无菌烟草种子萌发10d后，选取生长一致的烟草幼苗转入上述方形无菌培养皿中。

(3)根部接种RK1-1，烟草苗放置在靠近切割线位置的培养基上，每个培养皿中摆放一个RK1-1菌块和6株烟草苗，烟草幼苗根部朝有培养基的方向。并设置对照组(为不含菌株RK1-1的MS培养基)。

(4)将方形培养皿竖直放置于16h:8h(光照：黑暗)，25℃恒温光照培养箱中培养；光照强度100μmol m^-2.s^-1。

(5)定期观察，14d后，拍照。

以上实验重复三次，得到炭角菌RK1-1与烟草共培养(图3)实验结果，为炭角菌RK1-1明显促进烟草的生长，主要表现为叶片显著增大。

尽管接种RK1-1对烟草叶片个数没有影响，但其他生物指标与对照组相比均有显著差异(表1)。实验技术人员测量了接种了RK1-1的烟草和没有接种RK1-1的烟草(对照组)的烟草叶片纵向长度，横向长度，根系个数和最长根长等数据，具体如图4～图6及表2所示。

表2、RK1-1对烟草生物量的影响

结果表明在99％置信区间时，接种RK1-1的烟草叶片纵向长度、横向长度、根系个数和最长根长均与对照有极显著差异(p＜0.01)，地上部鲜重和干重与对照有显著差异(p＜0.05)，证明RK1-1对烟草的生长有显著的促进作用。

实施例5、RK1-1对黄瓜促生作用的盆栽实验

实验方法是首先将黄瓜种子播种在小盆中生长10天，每盆中栽1棵黄瓜苗。重复三次处理，以不加RK1-1为对照组，分别在苗期第10天的当天(0天)，3天，5天，7天，10天灌根接种RK1-1，移苗30天后观察黄瓜苗的生长情况。上述培育条件同常规黄瓜的培育条件。如图7所示，处理过的黄瓜长势良好，叶片大，高度也高，根须长度明显也比未处理过的(即对照组)要长，根毛组织要茂盛，如图8所示。盆栽实验结果表明RK1-1对黄瓜有明显的促生作用。

实验技术人员还对其他生物指标进行了测量，包括接种了RK1-1的黄瓜和没有接种RK1-1的黄瓜(对照组)的黄瓜叶片纵向长度，横向长度，根系个数和最长根长等数据，具体如图9～图10及表3～表4所示。

表3、RK1-1对黄瓜叶片生物量的影响数据表

表4、RK1-1对黄瓜根部生长影响数据表(最长根长)

	第一盆(cm)	第二盆(cm)	第三盆(cm)
				CK	10	14	12
0天	28	35	40
				3天	40	42	50
5天	42	43	45
				7天	45	46	40

10天

60

50

51

结果表明，接种RK1-1的黄瓜叶片纵向长度、横向长度、最长根长均与对照有极显著差异，从而说明RK1-1对黄瓜有明显的促生作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.炭角菌菌株，其特征是：保藏名称为：Xylaria striata RK1-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2012101。

2.根据权利要求1所述的炭角菌菌株，其特征是：所述菌株RK1-1属于真菌界(Fungi)，双核亚界(Dikarya)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariomyceta)，炭角菌目(Xylariomycetidae)，炭角菌科(Xylariales)，炭角菌属(Xylariaceae)。

3.根据权利要求2所述的炭角菌菌株，其特征是：菌株RK1-1在PDA培养基上的适宜生长温度为25℃；菌落白色，培养3天后直径2厘米，培养10天后直径9厘米，呈辐射状蔓延，之后生长减缓，并从菌落中心处开始出现黑色炭化菌丝。

4.如权利要求1～3中任一炭角菌菌株的用途，其特征是：用于促进植物生长或增加生物量。

5.根据权利要求4所述的炭角菌菌株的用途，其特征是：所述植物为水稻、烟草或黄瓜。