CN105112304A

CN105112304A - 一种防治蔬菜根部病害的多孔烟管菌高氏15号及其制剂

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Publication number: CN105112304A
Application number: CN201510564715.4A
Authority: CN
Inventors: 汪华
Original assignee: Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: CN105112304B

Abstract

一种多孔烟管菌(Bjerkandera？sp.)高氏15号，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M2015351和所述的多孔烟管菌高氏15号制成的菌剂以及所述的菌剂为颗粒性菌剂或可湿性粉菌剂。本发明提供的多孔烟管菌(Bjerkandera？sp.)高氏15号制成的菌剂对镰刀菌、齐整小核菌、立枯丝核菌和青枯假单胞菌具有明显的抑菌活性，该菌株制备的颗粒性菌剂或可湿性粉可用于番茄根腐病、番茄立枯病、番茄青枯病、魔芋根腐病、魔芋白绢病、青椒根腐病、青椒青枯病、青椒立枯病、西瓜根腐病、西瓜青枯病和西瓜立枯病的防治。

Description

一种防治蔬菜根部病害的多孔烟管菌高氏15号及其制剂

技术领域

本发明涉及一种多孔烟管菌(Bjerkanderasp.)和利用该多孔烟管菌生产的菌剂以及防治蔬菜根部病害的应用。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2015351，菌株名为多孔烟管菌(Bjerkanderasp.)高氏15号，属于生物技术领域。

背景技术

随着全球对资源和环境的广泛关注，以及农业无害化的发展，近年来利用活体生物作为药剂的趋势越来越高，世界各发达国家均在积极寻找可以开发利用的微生物资源。镰刀菌、立枯丝核菌、齐整小核菌和青枯假单胞菌引起蔬菜根部病害，尤其是青枯病是我国蔬菜生产上危害最重的根部病害，在我国湖南、湖北、河南、河北、山东、江苏及其它蔬菜主产区均有大面积发生，一般田块减产10-30％，重病田块减产50％以上，少数田块甚至颗粒无收。近年来提倡的保护性耕作制度进一步加重了蔬菜根部病害的发生和危害，在一些设施蔬菜区已成为生产上的突出问题。抗病品种的种植是防治病害最经济有效的方法，然而目前尚无防治土传根部病害的抗病品种。施用化学药剂是当前防治这些病害的最主要方法，然而化学农药污染大，与环境不友好，容易使病原菌产生抗药性等诸多问题。开发新型的微生物抑制剂是解决蔬菜根部病害的重要技术途径之一。

镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。

立枯丝核菌在分类系统中属于真菌界，半知菌门，丝孢纲，无孢目，无孢科。在自然界中可引起水稻纹枯病，西瓜立枯病，青椒立枯病，马铃薯茎基腐病，花生立枯病，油菜立枯病，芝麻立枯病，大豆镰刀菌根腐病、大豆立枯病，白菜褐腐病、白菜叶腐病、白菜类蔬菜褐腐病、白菜立枯病，番茄基腐病、番茄立枯病，茄子茎基腐病、茄子立枯病，豌豆根腐病，柑桔立枯病，甘蔗虎斑病，烟草立枯病，小麦纹枯病等病害。

齐整小核菌属半知菌亚门，无孢菌群，小菌核属。引起魔芋、花生、小麦、树木等作物发病形成白绢病。白绢病病菌发育的最适温度为30℃，最高约40℃，最低为10℃，在酸性至中性的土壤和沙质土壤中易发病；土壤湿度大有利于病害发生，特别是在连续干旱后遇雨可促进菌核萌发，增加对寄主侵染的机会；连作地由于土壤中病菌积累多，作物也易发病；在粘土地、排水不良、肥力不足、作物生长纤弱或密度过大的园区发病重。

青枯假单胞菌属细菌，是引起番茄、茄子、辣椒、马铃薯、西瓜等植株发生青枯病的主要病源，受害植株维管束被侵染，一般至成株期才显症状。初期叶片呈失水状，或出现黄色斑块、网纹状褪色斑等,重病株叶片相继脱落,最终全株枯死。有的病株明显矮化。主要特征是维管束变黄褐色或褐色，挤压维管束横断面有乳白色粘液渗出。各地普遍发生，保护地、露地均可发生。发病严重时造成植株青枯死亡，导致严重减产甚至绝收。

多孔烟管菌，子实体较小，一年生，无柄，软革质，以后变硬，菌盖半圆形，宽2-7cm，厚0.1-0.6cm，表面淡黄色、灰色到浅灰色，有绒毛，以后脱浇，表面近光滑或稍有稀薄，环纹不明显，管孔面烟色，后变灰色或白色，孔口圆形近多角形，每毫米4-6个，医学上报道有抗癌作用，容易引起木材产生白色腐朽。目前未见有多孔烟管菌抑制作物病原菌的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种多孔烟管菌(Bjerkanderasp.)高氏15号及其制备方法，以及利用所述多孔烟管菌高氏15号制成的菌剂，以及所述多孔烟管菌高氏15号在土传根部病害中的应用。

已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2015351。

为解决本发明的技术问题，所提供的技术方案为：

提供一种多孔烟管菌高氏15号，已于2015年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期是：2015年6月3日，保藏号为：CCTCCNO：M2015351。

所述的多孔烟管菌(Bjerkanderasp.)高氏15号是从湖北省咸宁市“星星竹海”景区竹林腐败竹节霉变组织中分离筛选而来的一种担子菌。该菌菌体能明显抑制蔬菜根部病害，如：根腐病菌、白绢病菌、青枯病菌和立枯病菌。

多孔烟管菌高氏15号的制备过程如下：

(1)制备菌组织稀释液：将采回的腐败竹节，称取10克，用70％酒精表面消毒60秒、次氯酸钠消毒120秒后，在超净工作台上剪碎后放入灭过菌的研钵，在充分研磨后，加入10毫升无菌水，继续研磨2分钟，将研磨液分别转入2支5毫升EP管中，10000转/分种的离心速度离心10分钟，吸取上清液，用无菌水分别稀释成10^-2、10^-3、10^-4和10^-5等四个浓度梯度液。

(2)涂液分离：吸取各浓度稀释液1毫升，加入高氏培养基(1克KNO₃，0.5克K₂HPO₄，0.5克MgSO₄·7H₂O，0.5g克NaCl，0.01g克FeSO₄·7H₂O，20克琼脂或13克琼脂粉，pH＝7.4-7.6)平板中，用灭菌棉签涂匀，45℃和5℃恒温箱内分别培养36小时。

(3)挑菌：待平板长出菌落后，根据形态挑取单菌落于30毫升的高氏液体培养基内，180转/分种，30℃恒温振荡36小时。

(4)纯化：在高氏固体平板上，采用平板划线法对培养液进行单一划线，至获得纯培养。菌株命名为高氏15号。

(5)菌株保存：将纯化菌株加入灭菌的盛有甘油的试管，甘油的终浓度为15％，-20℃保存。

多孔烟管菌高氏15号菌株的特征：

(1)形态学特征：将高氏15号菌株在高氏培养基平板上划线，30℃培养48小时后观察形态。在高氏液体培养基中振荡培养48小时后，观察菌体形态、大小、是否产芽孢和鞭毛着生方式。

观察结果：在高氏培养基上形成不透明乳白色放射状菌落，表面稀薄，分布不均。菌丝体稀薄，短小，宜断裂。

(2)生物学特征

高氏培养基，PH值6.5-7.5之间，生长温度25-40℃，35℃生长最快，4天菌落直径可达50-60毫米。

(3)分子鉴定特征：

该菌株菌体在高氏培养基(1克KNO₃，0.5克K₂HPO₄，0.5克MgSO₄·7H₂O，0.5克NaCl，0.01克FeSO₄·7H₂O，20克琼脂或13克琼脂粉，pH＝7.4-7.6)上形成白色菌丝，菌丝稀薄，通过ITS正反向基因测序结果，与NCBI网站公布序列进行比对，高氏15号菌株与已知同源性最高菌株的基因同源性为97％，同源性最高菌株NCBI登录号为KP050680.1，为多孔烟管菌(Bjerkanderasp)。

由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司对高氏15号的DNA基因测序，测序引物为：ITS1，获得长度为266bp的基因片段。

将该基因序列在NCBI网站(www.ncbi..nlm.nih)上与已公布的基因序列进行比对结果显示，该菌株与已知的多孔烟管菌(Bjerkanderaadusta)的同源性>97％。

结果见序列表：

AGCATTCCGGGAGGTCATTATCGAGTTTTGATGGGTTGTCTGCTGGCTCGCAAGGGCATGTGCACGCCTGTCTCATCCACTCTCAACTTCTGTGCACTTTTCATAGGCCGGCTTGTGGGTGCGTTCGCGCACTTGTAGGTGTCGGGCTTATGCTTTACTACAAACGATTCAGTTTTAGAATGTCATACTTTGCTATAACGCAATTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATA

一种根据权利要求1所述的多孔烟管菌高氏15号制成的菌剂。

作为优选，所述的菌剂为颗粒性菌剂或可湿性粉菌剂。应用方式为，蔬菜育苗盘均匀撒施和蔬菜育苗移栽过程中定点穴施。

一种根据权利要求1所述的多孔烟管菌高氏15号在蔬菜根部病害防治中的应用，所述蔬菜根部病害为：由镰刀菌(Fusariumspp.)、齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc)、立枯丝核菌(RhizoctoniacerealisVanderHoeven)和青枯假单胞菌(PseudomanassolanacearumSmith)所引起的蔬菜根部病害。

作为优选，所述蔬菜根部病害为：番茄根腐病、番茄立枯病、番茄青枯病、魔芋根腐病、魔芋白绢病、青椒根腐病、青椒青枯病、青椒立枯病、西瓜根腐病、西瓜青枯病和西瓜立枯病。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的多孔烟管菌(Bjerkanderasp.)高氏15号制成的菌剂对镰刀菌、齐整小核菌、立枯丝核菌和青枯假单胞菌具有明显的抑菌活性，该菌株制备的颗粒性菌剂或可湿性粉可用于番茄根腐病、番茄立枯病、番茄青枯病、魔芋根腐病、魔芋白绢病、青椒根腐病、青椒青枯病、青椒立枯病、西瓜根腐病、西瓜青枯病和西瓜立枯病的防治。

2、本发明的菌剂使用简便、污染小、成本低，具有广泛的农业应用前景和良好的生物开发价值。

3、本发明所述菌株培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合本发明的实施例，进一步来说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：高氏15号菌株发酵液的制备

(1)培养基：

高氏培养基：1克KNO₃，0.5克K₂HPO₄，0.5克MgSO₄·7H₂O，0.5克NaCl，0.01克FeSO₄·7H₂O，20克琼脂或13g琼脂粉，pH＝7.4-7.6，1000毫升水。

(2)菌种培养：

从保存的菌种表面刮取少量菌液在高氏培养基平板上划线，30℃培养24小时,挑取单菌落到2毫升高氏培养基中，200转/分，30℃培养24小时，再按10％的比例接入培养基装填量为80毫升的250毫升的三角瓶中，200转/分，30℃培养48小时。

(3)扩大发酵：

以0.5％接种比例将菌种液接种于50升发酵罐中，在50升全自动发酵罐中投料35升发酵培养料，发酵条件为：温度30℃，120转/分钟，初始pH值7.0，发酵3天。

实施例2：菌株鉴定与保藏

2.1形态特征

形态学鉴定：将高氏15号菌株在高氏培养基平板上划线，30℃培养48小时后观察形态。在高氏液体培养基中振荡培养48小时后，观察菌体形态、大小、是否产芽孢和鞭毛着生方式。

2.2鉴定与保藏

分子鉴定：由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司对高氏15号的DNA基因测序，测序引物为：ITS1，获得长度为266bp的基因片段。

2.3菌株生物学特征

实施例3：高氏15号可湿性粉菌剂的制备流程

将发酵好的发酵体按照如下方法加工成可湿性粉剂：首先进行菌体的古体发酵培养(同扩大发酵)。然后经板框过滤、干燥、粉碎，制成可湿性粉剂。具体制作过程如下:

板框过滤：用10公斤/平方厘米的压力，将物料由储罐压入板框，通过3号纱布过滤，压力应随时调节，使菌体中的含量菌不超过0.2亿/毫升。

干燥：在温度60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量5-8％。

粉碎：粉碎时出料温度不能超过70℃，以防菌体失活。

成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标注(Q/KWL02-2003)进行，含菌量3.6×10⁹CFU/g，其余各项指标均符合标准。

实施例4：高氏15号颗粒菌剂的制备流程

将发酵好的发酵体按照如下方法加工成颗粒菌剂：先将菌株发酵体与蔗糖按照4：1(毫升/克)比例混合均匀，得混合物1；再把混合物1、聚乙苯吡咯烷酮K30、酒石酸和碳酸氢钠，按照12：1：1：2重量比(W/W)混合，得混合物2；将混合物2在造粒机上过16目筛造粒，再用60℃汽液烘干，实时测定水份含量，使水分控制在3-5％之间，烘4小时，得高氏15号菌株活菌的颗粒剂，所述的活菌总浓度为5×10⁸CFU/g。

实施例5：高氏15号菌体对蔬菜根部病害如镰刀菌、齐整小核菌、立枯丝核菌和青枯假单胞菌的抑菌活性测定

(1)平皿拮抗筛选试验

指示菌：镰刀菌(Fusariumspp.)、齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)和立枯丝核菌(RhizoctoniacerealisVanderHoeven)。

在PDA平板中心接种多孔烟管菌菌块，在半径2.5厘米左右的圆周上，等距离接种3点等量不同病原菌，将每三种不同的病原菌作为一组，共有三组，每组设三个重复。用记号笔做好标记菌株编号，以备观察记录。将接种好的培养皿放于25℃的培养箱中培养3-5天左右。

隔日对所做的实验进行拍照，测量病原菌指向多孔烟管菌的半径。记录高氏15号菌与病原菌之间的形态特征。病菌与多孔烟管菌交接后，观察病原菌对高氏15号菌落的包围、抑制、侵入和占领其营养空间的过程。筛选多孔烟管菌，依据以下原则进行：(1)生长速度明显高于病原菌的菌株，能够与病原菌争夺营养，从而显著抑制病原菌的生长；(2)与病原菌之间有0.2cm左右空隙，即产生了抑菌带，说明多孔烟管菌在代谢过程中产生了某种抗生物质。

表1高氏15号菌株对3种病原菌抑制活性测定

备注:菌体对病原菌的生长抑制作用，由强到弱，分为+++、++、+、-四个等级(抑菌效果通过抑菌带大小表示：2mm≤+≤4mm；4mm＜++＜6mm；+++≥6mm)。

(2)平皿抑菌试验

指示菌：青枯假单胞菌(PseudomanassolanacearumSmith)。

青枯假单胞菌(PseudomanassolanacearumSmith)容易引起青枯病。将青枯假单胞菌(PseudomanassolanacearumSmith)以1：30比例加入到冷却至45摄氏度左右的NA培养基中混匀，制成含菌平板。在距离中央2cm处，呈“十”字形分布的四个接种点，放上直径3mm的滤纸圆片，取待测得高氏15号菌株菌液在滤纸片中央，对照不接种测试菌，每个菌株设置3个重复，平板放入28摄氏度培养箱中培养，2-3d后观察并记录抑菌圈直径，计算抑菌率。

实验结果表明，高氏15号菌株菌液对青枯假单胞菌的抑菌效果明显，抑菌圈直径达到32mm，抑制率达到72.66％。

实施例6：盆栽法测定高氏15号菌剂对青椒根部病害的防治效果

1)试验方法：将青椒种子室内17℃催芽2天，将高氏15号菌剂与水按照质量体积比1/2配制成稀释液，将催芽后的种子用稀释液浸种12小时，然后摆播于灭过菌的富含基质的口径30厘米花钵，每钵30粒，在摆播的种子表面撒上一层事先备好的镰刀菌或立枯丝核菌菌饼，每钵100克，然后盖上无菌土，置于18±1℃光照培养箱内培养。设用无菌水浸泡发芽种子的处理为空白对照。每个处理3次重复。

(2)试验调查：于接种培养30天后，对所有苗进行洗根调查，调查总株数，发病株数和严重度，计算防治效果。

试验结果，高氏15号菌剂浸泡发芽种子，对青椒根腐病具有64.3％的防效，对青椒立枯病具有66.7％的防效。

表2高氏15号菌剂处理青椒种子防治根腐病盆栽试验

表3高氏15号菌剂处理青椒种子防治立枯病盆栽试验

实施例7：盆栽法测定高氏15号菌剂对番茄根部病害的防治效果

1)试验方法：将番茄种子室内17℃催芽2天，将高氏15号菌剂与水按照质量体积比1/2配制成稀释液，将催芽后的种子用稀释液浸种12小时，然后摆播于灭过菌的富含基质的口径30厘米花钵，每钵30粒，在摆播的种子表面撒上一层事先备好的镰刀菌或立枯丝核菌菌饼，每钵100克，然后盖上无菌土，置于18±1℃光照培养箱内培养。设用无菌水浸泡发芽种子的处理为空白对照。每个处理3次重复。

试验结果，高氏15号菌剂浸泡发芽种子，对番茄根腐病具有69.3％的防效，对番茄立枯病具有70.1％的防效。

表4高氏15号菌剂处理番茄种子防治根腐病盆栽试验

表5高氏15号菌剂处理番茄种子防治立枯病盆栽试验

实施例8：盆栽法测定高氏15号菌剂对西瓜根部病害的防治效果

1)试验方法：将西瓜种子室内17℃催芽2天，将高氏15号菌剂与水按照质量体积比1/2配制成稀释液，将催芽后的种子用稀释液浸种12小时，然后摆播于灭过菌的富含基质的口径30厘米花钵，每钵30粒，在摆播的种子表面撒上一层事先备好的镰刀菌或立枯丝核菌菌饼，每钵100克，然后盖上无菌土，置于18±1℃光照培养箱内培养。设用无菌水浸泡发芽种子的处理为空白对照。每个处理3次重复。

试验结果，高氏15号菌剂浸泡发芽种子，对西瓜根腐病具有69.1％的防效，对西瓜立枯病具有68.4％的防效。

表6高氏15号菌剂处理西瓜种子防治根腐病盆栽试验

表7高氏15号菌剂处理西瓜种子防治立枯病盆栽试验

实施例9：盆栽法测定高氏15号菌剂对魔芋根部病害的防治效果

(1)试验方法：将高氏15号菌剂与水按照质量体积比1/2配制成稀释液，将一代魔芋种子用稀释液浸种12小时，然后摆播于灭过菌的富含基质的口径90厘米花钵，每钵20粒，在摆播的种子表面撒上一层事先备好的镰刀菌或齐整小核菌菌饼，每钵200克，然后盖上无菌土，置于18±1℃光照培养箱内培养。设用无菌水浸泡发芽种子的处理为空白对照。每个处理3次重复。

试验结果，高氏15号菌剂浸泡发芽种子，对魔芋根腐病具有76.4％的防效，对魔芋白绢病具有72.5％的防效。

表8高氏15号菌剂处理一代魔芋种子防治根腐病盆栽试验

表9高氏15号菌剂处理一代魔芋种子防治白绢病盆栽试验

实施例10：高氏15号颗粒菌剂防治番茄土传根部病害田间小区试验

(1)试验处理和方法：共设三个处理：(1)撒高氏15号颗粒菌剂(10kg/mu)；(2)对照药剂苯醚甲环唑药剂拌种(15g/mu)；(3)对照药剂戊唑醇药剂拌种(12g/mu)；(4)清水对照。每个处理3次重复，小区面积40m²。。

(2)调查方法：按农药田间药效试验准则，在土传根部病害发生后期对番茄土传根腐病、番茄土传青枯病、番茄土传立枯病进行一次性调查，计算防治效果。

试验结果，高氏15号颗粒菌剂对番茄根腐病、番茄青枯病和番茄立枯病的防效分别达79.1％、63.6％和75.7％的效果，对照药剂戊唑醇12g/mu对番茄根腐病、番茄青枯病和番茄立枯病的防效分别达66.8％、56.6％和75％的效果，对照药剂苯醚甲环唑对番茄根腐病、番茄青枯病和番茄立枯病的防效分别达76.3％、60.3％和74.3％的效果；其中对番茄根腐病和番茄青枯病的防效高于对照药剂戊唑醇12g/mu的效果，和苯醚甲环唑15g/mu处理上述病害的效果相当。

表10、高氏15号颗粒菌剂田间防治番茄根部病害试验

还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种多孔烟管菌(Bjerkanderasp.)高氏15号，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015351。

2.一种根据权利要求1所述的多孔烟管菌高氏15号制成的菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述的菌剂为颗粒性菌剂或可湿性粉菌剂。

4.一种根据权利要求1所述的多孔烟管菌高氏15号在蔬菜根部病害防治中的应用，其特征在于，所述蔬菜根部病害为：由镰刀菌(Fusariumspp.)、齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc)、立枯丝核菌(RhizoctoniacerealisVanderHoeven)和青枯假单胞菌(PseudomanassolanacearumSmith)所引起的蔬菜根部病害。

5.根据权利要求4所述的多孔烟管菌高氏15号在蔬菜根部病害防治中的应用，其特征在于，所述蔬菜根部病害为：番茄根腐病、番茄立枯病、番茄青枯病、魔芋根腐病、魔芋白绢病、青椒根腐病、青椒青枯病、青椒立枯病、西瓜根腐病、西瓜青枯病和西瓜立枯病。