CN102899266B

CN102899266B - 魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7及其应用

Info

Publication number: CN102899266B
Application number: CN201210241051.4A
Authority: CN
Inventors: 姬广海; 魏兰芳; 王永吉; 何月秋; 李成云
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN102899266A

Abstract

本发明涉及一种魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7及其应用，属生物技术领域。本发明的成团泛菌（Pantoea agglomerans）1-7已于2012年5月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.6160。本发明的魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7，用于大田防治魔芋细菌性软腐病和十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中。本发明具有高效、无毒、安全无残留，1-7菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点，其成团泛生菌（Pantoea agglomerans）1-7能够用于制备大田防治十字花科蔬菜根肿病的制剂中。

Description

魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7及其应用

技术领域：

本发明涉及一种魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7及其应用，属植保技术领域。

背景技术：

魔芋属天南星科魔芋属的多年生草本植物，可大量提取葡甘露聚糖的植物，魔芋大田种植产量高，有很好的经济效益，我国西南诸省大面积栽培，并已成为该地区的主要经济作物，也是该地区调整农业结构、农民脱贫致富、振兴地方经济的有效途径之一。魔芋细菌性软腐病在全世界范围内发病都很严重，在大田生长期和储藏期周年发生为害，魔芋植株感染软腐病后叶片或球茎变软，发黑腐烂，并有恶臭味，从病部流出带菌汁液又侵染新的植株，使之发病，严重时引起成片倒苗。

魔芋软腐病主要由胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora，Pcc）引起的细菌性病害，广泛分布在我国大部分魔芋种植地区。随着魔芋种植面积的逐年扩大，魔芋软腐病的发生也不断加剧，造成的损失一般在30%-50%，严重者可达80%甚至绝收，严重影响芋农种植魔芋的积极性，防碍了西南地区地方经济的发展。　

魔芋细菌性软腐病属于土传病害，防治十分困难，主要采用玉米和魔芋间栽种植，以及实行轮作、建立无病种薯基地来控制等农业栽培措施进行防治软腐病的发生。化学防治由于缺少高效防治软腐病的药剂，土壤消毒剂不易降解，高残留、对人畜极不安全；破坏土壤结构、造成土壤酸化等，加之没有魔芋软腐病抗病品种，生物防治魔芋软腐病显得极其重要，国内许多学者从多种作物根际筛选根际细菌，用于温室和田间防治魔芋细菌性软腐病，主要生防细菌有芽孢杆菌、溶杆菌、放线菌等，但生防效果不尽理想。从魔芋植株体内分离内生细菌，针对细菌性软腐病开展室内抑菌、促生和田间防效试验，筛选到一株对魔芋细菌性软腐病和十字花科蔬菜根肿病具有较好效果的生防菌株。

十字花科作物包括油菜和大宗蔬菜，如大白菜、甘蓝、花椰菜、苤蓝、茎芥菜、芥菜、萝卜、小白菜、瘤芥菜（榨菜）及特种作物板蓝根和山葵等，每年发生根肿病面积达2000多万亩（次），特别是一旦发生，病害逐年加重，十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌 (Plasmodiophora brassicae woron．)侵染引起。十字花科根肿病对蔬菜产量影响极大，十字花科作物，最严重的可能会导致减产70%—80%，甚至让菜农颗粒无收，不能在同地块种植十字花科作物。由于近些年来，种子和蔬菜种苗大范围、远距离调运，根肿病发生范围逐年扩大，西自新疆的霍尔果斯、西藏的察隅，东至台湾，北自黑龙江，南至海南岛全国各省区均有分布。特别是大棚温室育苗和漂浮育苗更加快了病害流行速度，致使新的病区只能种植一年，第二年就无法种植。病菌能在土壤中存活10年以上，且可以通过侵染杂草而得到繁殖，导致轮作不能很好地起到防病作用，水旱轮作导致病菌均匀扩散，还会加重病害。

目前，防治上述病害的措施主要有检疫，农业栽培措施，抗病品种、化学防治措施，但其防治效果不理想。

经文献检索，尚未见利用魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7制备生物制剂，并应用于大田防治魔芋细菌性软腐病和十字花科蔬菜根肿病的公开报道。

发明内容:

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种高效、无毒、安全无残留的魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7及其应用。

本发明的成团泛菌（Pantoea agglomerans）1-7菌株已经保藏。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北晨西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年5月28日；保藏号CGMCC N0：6160。

成团泛菌（Pantoea agglomerans）1-7菌株，系本发明人于2010年从从魔芋植株体内分离的内生细菌，国内未见报道，经形态学、培养性状、常规生理生化、Biolog全自动鉴定系统测定和16S rDNA序列测定及其系统发育学分析，该生产菌株成团泛生菌（Pantoea agglomerans）1-7是一个新菌株。

本发明的成团泛菌（Pantoea agglomerans）1-7菌株用于大田防治十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中。即：通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物；通过常规的液体发酵生产，加入填充剂、板框过滤、打浆、干燥、粉碎，制成可湿性粉剂。

本发明具有高效、无毒、安全无残留，生防细菌1-7菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点；生产菌株成团泛生菌（Pantoea agglomerans）1-7能够用于制备大田十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中。

具体实施方式：

本发明的成团泛菌（Pantoea agglomerans）1-7菌株已经保藏。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北晨西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年5月28日；保藏号CGMCC N0：6160。

上述生防菌剂在防治魔芋细菌性软腐病方面的应用方法：为每亩4升1-7菌剂，稀释100倍，进行魔芋浸种和灌根处理。对十字花科根肿病主要采用每亩用1-7菌株制剂3升，稀释50或100倍进行灌根处理。

试验证明，该菌剂能显著降低魔芋软腐病的发生，并兼有促进魔芋植株生长；该菌剂可以稀释100倍后在魔芋播种时浸种处理，结合发病初期灌根使用，或者与有机肥在魔芋播种时同时伴种施入，对魔芋软腐病的防效在70%以上。

对十字花科蔬菜根肿病，生防菌剂1-7 大白菜种子经浸种处理、结合生长前期灌根使用，能有效地防治十字花科蔬菜根肿病，同时对大白菜促生效果明显，

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：生防菌剂1-7 对魔芋细菌性软腐病的抑制活性

(一)生防菌株的离体抑菌试验

1.供试材料：

1.1供试菌剂：成团泛菌（Pantoea agglomerans）1-7 。

1.2 供试病原菌

植物病原细菌（魔芋细菌性软腐病菌、大白菜软腐病、马蹄莲软腐病、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌），病原真菌（辣椒疫霉菌、三七根腐病菌、烟草黑胫病菌）详见表1，均由云南农业大学生物多样性与病害控制国家工程中心细菌研究室提供。

1.3 供试试剂和培养基

NA培养基（蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂17g，水1000mL，pH7.0）；PDA培养基（马铃薯200g，琼脂15g，葡萄糖15g，水1000mL）。

2. 试验方法

拮抗试验采用平板对峙

1)菌悬液的制备：将得到的芽孢杆菌和病原细菌分别接入装有50 ml的NA液体培养基的三角瓶中，置于28 oC、160 r/min摇床上培养48 h。将菌悬液用无菌水适当稀释，摇均匀后，用600 nm波长、1 cm比色皿测定OD值。测定时用无菌 NA培养基作空白对照。用无菌水稀释使得菌悬液的为OD值0.5，待用。

2) 对病原细菌抑菌作用的测定：取上步所得病原细菌菌悬液200 μl加入培养皿中，将冷却至45 oC左右的NA培养基倒入已加过病原细菌菌悬液的培养皿中，混匀。等完全凝固后，放置牛筋环于培养基表面，取所得成团泛菌菌悬液200 μl加入牛筋环，28 oC中培养48-72 h。观察、记录试验结果。

3) 对病原真菌抑菌作用的测定：在PDA平板中心接种植物病原菌菌盘(直径5 mm)，两侧2 cm处接种成团泛菌菌株。置28 ℃培养箱中培养，观察抑菌情况。

试验结果表明：成团泛菌1-7不同致病力的软腐病菌拮抗效果不同，最大抑菌圈直径2.23 cm ，同时还对大白菜软腐病、马蹄莲软腐病细菌有拮抗活性（一般生防菌拮抗病原菌的抑菌圈> 1.0cm，即可为较强的抑菌能力），以及水稻、烟草、辣椒等病原细菌和真菌有抑菌活性。因此，成团泛菌1-7具有成为高效生防菌的巨大潜力。

表1 生防菌剂 1-7抑菌谱测定

实施例二：生防菌剂1-7对魔芋的促生作用效果

1-7生物菌剂的制备：

生防细菌菌株1-7 在NB培养液，28℃ 150 rpm 振荡培养36 h-48 h ,然后 10000 rpm 离心5-10 min ，弃去上清液，保留菌体，加入菌体稀释液，按质量比为1:40 配成菌剂，菌剂成品活菌数5X10⁹ cfu/ml，菌体稀释液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，含有浓度0.01%（V/V）的CMC(羧甲基纤维素) 溶液（成膜剂）和0.001mol/L Tween 20（非离子型表面活性剂）。

1-7 生防菌剂处理魔芋种球：

取健康的魔芋种球，大小为50g/个，用生防菌剂1-7 100 mL（约10 ⁸CFU/mL）浸种处理魔芋种球，50个/处理，浸种时间为1h，捞出，每个种球摆放在吸水纸上，48 h后，按常规方法播种在盆钵中，另外，用生防菌株M3，M2，按菌株1-7的生物菌剂制备和浸种处理种球方法处理种球（方法同上），另设阴性对照，用清水浸种处理魔芋种球，按上述同样方法处理。

播种出苗后，待魔芋叶片完全展开后，调查出苗率、分别测量株高、叶围、茎围等生理指标。

调查结果显示（表2）：生防菌剂1-7处理过的魔芋植株各生物量高于空白对照，在出苗率方面，用内生菌1-7、M3、M2处理过的魔芋种球的出苗率分别达到了100%、96%、92%；在株高方面与对照相比，分别增加47.78%、22.25%、20.47%；且差异显著；在叶围方面与对照相比，分别增加64.13%、37.23%、25.27%；在茎围方面与对照相比，分别增加52.6%、47.4%、18.51%；且差异显著。说明生防菌剂1-7在生物量的各方面都有显著的促生优势。

表2 生防菌剂1-7对魔芋的促生作用

实施例三：生防菌剂1-7对魔芋软腐病的防治效果

1.1、供试生防菌剂：生防菌剂1-7

1.2、供试作物：富源花魔芋

1.3、防治对象：魔芋细菌性软腐病

1.4．试验地点：云南省富源县魔芋种植基地，肥力中等，小区为一畦4行区，面积30平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按高产、优质栽培措施规范化管理。

试验设生防菌剂处理、清水对照、农药对照3个处理，。施药的方法采用灌根法，每棵魔芋根部浇药液100 mL，发病初期前施第一次药，间隔期为一周，施3次药，最后一次施药15 d后调查数据。

1.5调查方法及病害分级

根据赵家君等人的研究，结合实际情况，为更准确的反映病害发生严重情况，我们将魔芋软腐病分级标准修订为：

根据发病严重程度将魔芋软腐病分为0-4级：

0级：植株生长正常，叶片无非生理性发黄、无水浸状病斑；

l级：叶片（或叶柄）一侧有小型水浸状病斑，病斑面积（或长）占总叶面积（叶柄总长度）的10%以下；或者叶片轻度黄化面积小于10%；

2级: 叶片（或叶柄）的水浸状病斑或者黄化面积占总叶面积10%—40%，茎基部或茎有水浸状病斑，但植株正立。

3级：叶片（或叶柄）的水浸状病斑或者黄化面积占总叶面积40%—90%，茎基部有明显软腐症状或茎一侧叶柄全部软腐，植株歪斜。

4级：叶片（或叶柄）的水浸状病斑或者黄化面积占总叶面积90%以上或全叶枯黄、植株倒伏腐烂。

田间防效试验结果证明（见表3），生防细菌1-7与对照相比，无论是平均发病率、平均病情指数都有所降低，对魔芋细菌性软腐病的防效在70%以上，防效比农药噻枯唑高出两个百分点，但并未达到显著差异水平，是一株极具潜力的内生拮抗菌。

表3 生防菌剂1-7 对魔芋细菌性软腐病的防效

实施例四：生防菌剂1-7对大白菜根肿病控病试验

1、实验材料与方法

1.1、供试药剂：生防菌剂1-7

1.2、供试作物：大白菜，品种为成杂5号

1.3、防治对象：大白菜根肿病

1.4．实验地点：云南省楚雄州禄丰县南雄村委会，肥力中等，小区为一畦为6行区，面积30平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按高产、优质蔬菜栽培措施规范化管理。

1.5 生防菌剂处理：

生防菌剂的制备：

防治魔芋细菌性软腐病和十字花科蔬菜根肿病的内生菌剂1-7 在NB培养液，28℃ 150 rpm 振荡培养36 h-48 h ,然后 10000 rpm 离心5-10 min ，弃去上清液，保留菌体，加入菌体稀释液，按质量比为1:40 配成菌剂，菌剂成品活菌数10⁹ cfu/ml，菌体稀释液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，含有浓度0.01%（V/V）的CMC(羧甲基纤维素) 溶液（成膜剂）和0.001mol/L Tween 20（非离子型表面活性剂）。

按前述液体菌剂的发酵、经过滤、加入硅澡土、打浆、粉碎和生产制备方法获得固体制剂。经成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准（Q/KWL02-2003）进行，含菌量50-100亿/克，供试验用。

田间试验方法：

生防菌剂1-7液体或固体制剂，分别用水稀释100倍后，采用浸种处理大白菜种子3小时，自然阴干，播种于田中，然后采用浇根法进行处理，在播种后7 d、14 d和21 d将制备好的生防菌株1-7的菌悬液灌根，每株大白菜苗灌菌100mL。

对照杀菌剂氰霜唑2000倍稀释液，采用上述同样的方法浇根，施药次数为3次，每株大白菜苗灌菌100mL。

空白对照：施用清水，采用同样方式浸种，按上述同样的方法浇根，施用次数为3次，每株大白菜苗灌清水100mL。

试验设5个处理，3次重复，共15个小区，小区面积30 平方米，随机排列。

试验进行中，于病害发生高峰期进行采样，每次采样100株，调查并记录株高、叶面积、植株鲜重等生理指标和发病等级，统计根肿病发生率及病情指数，分析结果。

温室浸种处理，将制备好的生防菌菌悬液稀释10倍（浓度为3×10⁸每CFU/ml）浸种1h后，将种子自然晾干。温室处理，生防菌剂 10ml/苗。

温室壳聚糖包衣：取1g壳聚糖分散于100ml 1%乙酸溶液中（或1g壳聚糖乙酸盐溶于100ml水中），加1g甘油（增塑剂），再用NaOH溶液调节pH到5.6。包衣：生防菌在KB培养基中，28℃培养48h，用含有生防菌的壳聚糖溶液包埋白菜种子。温室处理，生防菌剂 10ml/苗。

生防菌 1-7 代谢产物粗提物的制备

在装400mL已灭菌的NB液体培养基的1000mL 锥形瓶中接种生防菌株，在28℃条件下培养2天终止发酵。将发酵液离心20min（12,000 rpm/min）收集上清液，于上清液中加入等体积乙酸乙酯萃取3次。有机溶媒层用5%NaHCO₃和水洗，再用无水Na₂SO₄脱水，减压浓缩，获得代谢产物粗提物。用水溶解后，代谢粗提物按10ml/苗。

于播种后40d左右进行调查，将同一株大白菜苗的带回室内、测量株高、鲜重等生理指标，计算并分析结果。

大白菜根肿病的病情分级标准和调查方法按以下公式进行：

接种后45 d开始调查, 病情分级标准:

０级：根部无肿瘤；

１级：侧根有小肿瘤；

３级：主根肿大，其直径小于2 倍茎基部；

５级：主根肿大，其直径是茎基部的2～3倍；

７级：主根肿大，其直径是茎基部的3～4 倍；

９级：主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部出现变黑。

发病率=（发病株数/调查总株数）×100

相对防效=（对照病情指数－处理病情指数）×100／对照病情指数

2.试验结果与分析

从下表知，生防菌和药剂处理过的田块发病率和病情指数相对于对照都有明显的降低，病情指数的差异达到显著性水平。在收获期调查对大白菜根肿病的防治效果，生防菌剂1-7对大白菜根肿病的防效达75.46%，明显高于防治根肿病的农药氰霜唑2000倍的处理的67.89%。温室试验表明，四种处理方式对大白菜的株高和鲜重均有一定的促进作用，而代谢产物粗提物灌根对大白菜的促生效果很明显。代谢产物粗提物灌根处理后，大白菜均有很好的促生作用。其中，大白菜株高、鲜重分别比对照提高8.47 cm，20.41克，明显好于壳聚糖处理。

表生防菌剂1-7 对根肿病的田间防治效果禄丰试验点

表浸种和包衣处理对大白菜、苗高、鲜重的影响

Claims

1.魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7，特征在于生产菌株成团泛菌（Pantoeaagglomerans）1-7已于2012年5月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.6160。

2.权利要求1所述的魔芋内生细菌成团泛菌菌株1-7在制备大田防治魔芋细菌性软腐病和十字花科蔬菜根肿病制剂中的应用。