CN105219678B - 一株成团泛菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株成团泛菌（Pantoea agglomerans），其保藏号为CCTCC NO:M2015563，该菌菌体呈杆状，革兰氏染色阴性，可制备成液体菌剂或可湿性粉剂，用以防治小麦赤霉病、降低小麦赤霉毒素含量；其在解决毒素污染的过程中，也没有毒副产品的产生，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一株成团泛菌（Pantoea agglomerans）及其应用。
背景技术
小麦赤霉病是一种典型的气候型病害，在中国、日本、东南亚和美国南、北部等世界范围内均有发生，且发生频率逐渐增加，其多发生在小麦穗期多雨、气候潮湿的地区并具有周期性流行的特点，根据其发病特点又被称为烂麦头、红麦头、麦穗枯等。随着农业耕作中免耕、秸秆还田种植技术和小麦、玉米轮作的推广，化肥使用量的增加以及小麦品种抗性的丧失，该病的发病率逐年上升，成为麦田中流行的一种毁灭性病害。自20世纪90年代起，赤霉病给美国农业造成了极大的影响，损失多达30亿美元，很少有单个农业病害能带来如此庞大的损失。在我国，赤霉病的波及范围和危害也极大，其中发生频率最高、损失最大的是长江中下游地带。近年来，小麦赤霉病在华北麦区也逐渐流行，增加趋势明显，发病面积逐步扩大，赤霉病的盛行严重影响着小麦等作物的种植。
谷物感染赤霉病后可以产生多种毒素，其中最主要为呕吐毒素（DON）和玉米赤霉烯酮毒素（ZEN），其中DON毒素会对人畜造成毒害，使动物产生包括嗜睡、食欲丧失、呕吐、肠道损伤、皮肤坏死、胃肠功能障碍、免疫功能障碍和繁殖功能障碍等症状。
目前针对小麦赤霉病及其产生的毒素污染问题，主要采取一些化学药剂防治的方法，如：多菌灵、氰烯菌酯、福美双、甲基硫菌灵等，这些方法尽管在一定程度上控制了小麦赤霉病的病害，但是化学药剂本身会造成小麦中化学药剂的残留，摄入后影响人体健康，而且由于相同化学药剂的长期使用，产生了大量的抗性菌株，使得赤霉病发病没法得到有效控制。同时一些在小麦收获前期没有发病，但是收获的时候受到感染，这些染病小麦看起来籽粒很健康，但其中已含有大量毒素，误食后极有可能危害人体健康。目前，本领域研究认为的最佳方法是利用微生物制剂控制赤霉病的生长和产毒。
微生物数量大、种类多、基因资源丰富、而且干净彻底、无二次污染，因此，利用微生物来处理毒素是消除赤霉毒素污染的最好办法。成团泛菌(Pantoea agglomerans)作为一种生防菌，可以控制病原菌的生长，目前尚未有将成团泛菌用于防治赤霉病病害、减少ZEN毒素和DON毒素产生的相关报道。
发明内容
针对小麦中赤霉病病害和赤霉毒素广泛存在的问题，提供一株对赤霉病菌具有防控作用的成团泛菌，用于控制小麦赤霉病，减少小麦中DON毒素和ZEN毒素的含量，本发明是这样实现的：
一株成团泛菌（Pantoea agglomerans），其保藏号为CCTCC NO:M2015563;所述成团泛菌菌体呈杆状，革兰氏染色阴性。
保藏号为CCTCC NO:M2015563的成团泛菌在防治小麦赤霉病、降低小麦赤霉毒素含量中的应用。
进一步，本发明中所述保藏号为CCTCC NO:M2015563的成团泛菌在防治小麦赤霉病、降低小麦赤霉毒素含量中的应用是指：将成团泛菌制成液体菌剂或可湿性粉剂，用于防治小麦赤霉病、降低小麦赤霉毒素含量。
进一步，本发明中所述液体菌剂是这样获得的：
A） 将保藏号为CCTCC NO:M2015563的成团泛菌接种于LB培养基中，30℃试管斜面培养48h，获得试管菌种；
B） 将试管菌种接种至含有LB培养基的摇瓶中，30℃，150rpm振荡培养至对数生长期，获得菌种；
C） 将菌种接种至含灭菌LB培养基的种子罐中，接种量为LB培养基体积的10%，在28-33℃温度下，搅拌培养至对数生长期，搅拌速率为150-180rpm，培养期间通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得种子液；
D） 将种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，接种量为发酵培养基体积的10%，于28-33℃，搅拌培养48-60h，搅拌速率为150-180rpm，发酵培养期间向发酵罐中通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得成团泛菌的液体菌剂，其菌体含量不低于109个/ml。
进一步，本发明中，所述应用是指将菌体含量至少为109cfu/ml的液体菌剂，喷施于小麦穗部，5ml/m2，用以防治小麦赤霉病、降低小麦中赤霉毒素含量。
进一步，本发明中，所述可湿性粉剂是由菌体含量至少为109cfu/ml的液体菌剂与硅藻土、凹凸棒土混合后获得，它们的质量比为1:1:1；其中，成团泛菌液体菌剂的菌体含量不低于109个/ml，可湿性粉剂的菌体含量不低于1010cfu/g。
进一步，本发明所述应用是指，将可湿性粉剂悬浮于水溶液中，喷施于小麦穗部，用量为0.2g/m2，用以防治小麦赤霉病、降低小麦中赤霉毒素含量。
本发明中所述赤霉毒素为DON毒素和ZEN毒素。
本发明通过对赤霉菌拮抗菌筛选，获得能够同时抑制赤霉菌生长、同时减少DON毒素和ZEN毒素产生的成团泛菌菌株，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2015563；该菌株不但能有效地抑制赤霉病菌的生长，而且还能抑制赤霉毒素的产生；同时在解决毒素污染的过程中，也没有毒副产品的产生，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全；以该菌种制备的液体菌剂和固体菌剂，用于小麦赤霉病的防控，降低小麦中DON毒素和ZEN毒素含量，生产使用成本低，适宜推广使用。
附图说明
图1为实施例成团泛菌对禾谷镰刀菌的抑制效果示意图。
具体实施方式
实施例中涉及的培养基配方：
LB培养基：以质量百分比计，蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 1.0%，余量为去离子水；pH为7.0-7.2；
发酵培养基：以质量百分比计，葡萄糖1.0%，（NH4）2SO4 0.1%，K2HPO4 0.2%，MgSO40.02%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，蛋白胨0.05%，余量为蒸馏水，pH值为7.2-7.5。
PDA培养基/PDA平板：马铃薯200g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂15 g/L，余量为蒸馏水。
实施例中所使用的禾谷镰刀菌GZ3639菌株由美国农业部真菌毒素研究中心馈赠。
实施例1 筛选菌株
采集江苏六合地区的小麦穗，以常规方法进行表面消毒后，再无菌条件下磨碎麦穗，加入无菌水，混匀后，进行系列稀释，把不同浓度的稀释液分别涂布于LB、PDA培养基上，30℃条件下培养5天后，挑取平板上不同的菌落，验证不同菌株对禾谷镰刀菌的拮抗能力，挑取抑制禾谷镰刀菌生长的菌株，在小麦的扬花前期把拮抗菌喷施到麦穗上，等小麦成熟后收获小麦种子，按照国标SN/3136-2012的方法检测小麦中的DON毒素，按照NY/T2070-2011的方法检测小麦中的ZEN毒素，最终获得能够同时抑制镰刀菌生长和降低赤霉毒素产生的菌株，申请人将所获得的菌株自命名为AFXSJGH16，向AFXSJGH16培养基中加入甘油，在-70℃冰箱保存。
经检测，AFXSJGH16菌株主要生物学特性为：菌体呈杆状，革兰氏染色阴性；VP实验、接触酶、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、β-半乳糖苷酶阳性；不能水解淀粉、酪素、糊精、D-纤维二糖龙胆二糖,能利用柠檬酸、D-麦芽糖、D-海藻糖、蔗糖、D-甘露醇、D-果糖。
克隆AFXSJGH16菌株的16SrDNA序列，进行测序，构建AFXSJQ01的系统发育进化树，通过对AFXSJGH16的生理生化特征结果和系统发育进化地位等鉴定结果，申请人最终把AFXSJGH16鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans）。
申请人于2015年9月21将AFXSJGH16菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)），地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072，保藏号为CCTCC NO：2015563，其分类名称为Pantoea agglomerans AFXSJGH16。
实施例2 制备液体菌剂
（a）将实施例1获得的成团泛菌菌株AFXSJGH16在培养皿中活化，接种于LB培养基，于30℃，试管斜面培养48小时后获得试管菌种；
（b）挑取试管菌种接种至含有LB培养基的摇瓶中，30℃，150rpm振荡培养至对数生长期，获得菌种；
（c）向500L的的种子罐中加入400L的LB培养基，然后121℃，1.1kg/cm2高压湿热灭菌20分钟，冷却至30℃，按LB培养基体积的10%接入步骤（b）获得的菌种，在28-33℃温度下，搅拌培养至对数生长期，培养时间约为48-60h，搅拌速率为150-180rpm，培养期间通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得种子液；
（d）向5吨的发酵罐中加入4吨发酵培养基， 然后在121℃、1.1kg/cm2的环境中灭菌20分钟，冷却至33℃以下，然后将步骤（c）获得的种子液接种入发酵罐中，所接入菌种为发酵培养基体积的10%，于28-33℃，搅拌培养48-60h，搅拌速率为150-180rpm，发酵培养期间向发酵罐中通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得成团泛菌AFXSJGH16的液体菌剂，其菌体含量不低于109个/ml。
实施例3 制备可湿性粉剂
将实施例2获得的成团泛菌液体菌剂、硅藻土、凹凸棒土按质量比1：1：1混合均匀，即获得成团泛菌的可湿性粉剂，其菌体含量不低于1010cfu/g。
实施例4 AFXSJGH16抑制禾谷镰刀菌生长的实验
在PDA平板中滴5uL实施例2获得的成团泛菌AFXSJGH16液体菌剂，30℃培养24h，然后每块平板喷洒200μL禾谷镰刀菌GZ3639的孢子液，孢子液浓度为105个/mL,结果如图1所示，可见，AFXSJGH16对禾谷镰刀菌的生长具有抑制效果。
实施例5 AFXSJGH16液体菌剂防治小麦赤霉病、降低赤霉病毒素产生的田间试验
试验地点：江苏省农科院六合小麦实验基地
试验时间：2015年4月～6月
小麦的抽穗扬花期，在实验组小麦穗部喷施实施例2获得的液体菌剂的10倍稀释液（用自来水按体积比稀释），对照组喷灭菌的发酵培养基的10倍稀释液（用自来水按体积比稀释），喷施量为5mL/m2，喷施1小时后，再喷施禾谷镰刀菌GZ3639的孢子液，孢子液浓度为105个/mL, 喷施量为5mL/m2，20天后统计小麦赤霉病发病的病小穗率：
病小穗率%=发病小穗数×100/总小穗数，
防效%=100（对照组-实验组）/对照组
小麦成熟收获后，按照国标SN/3136-2012的方法检测小麦中的DON毒素，按照NY/T2070-2011的方法检测小麦中的ZEN毒素，检测结果如表1所示：
表1 AFXSJGH16液体菌剂对小麦赤霉病和赤霉毒素防控的田间使用效果
由表1可以看出，喷施AFXSJGH16液体菌剂的小麦的赤霉病发病率明显降低，这就说明该液体菌剂对小麦赤霉病的发生具有较高的防治作用，防效可达到61.21%；同时收获小麦中DON毒素减少了49.67%，玉米赤霉烯酮毒素含量减少了60.02%，由此可见，该液体菌剂可有效防控小麦赤霉病和赤霉毒素。
实施例6 AFXSJGH16可湿性粉剂防治小麦赤霉病、降低赤霉病毒素产生的田间试验
试验地点：江苏省农科院六合小麦实验基地
试验时间：2015年4月～6月
小麦的抽穗扬花期，在实验组小麦穗部喷施实施例3获得的可湿性粉剂悬浮于自来水中，浓度为40g/L，喷施于小麦穗部，5mL/m2（即可湿性粉剂施用量为0.2g/m2）,对照组喷等量的自来水；喷施1小时后，再喷施禾谷镰刀菌GZ3639的孢子液，孢子液浓度为105个/mL,喷施量为5mL/m2，20天后统计小麦赤霉病发病的病小穗率，小麦成熟收获后，测定不同处理小麦中DON毒素和玉米赤霉烯酮毒素的含量，检测结果如表2所示：
表2 AFXSJGH16可湿性粉剂对小麦赤霉病和赤霉毒素防控的田间使用效果
| 处理方式 | 病小穗率（%） | DON毒素浓度（ug/L） | 玉米赤霉烯酮毒素浓度（ug/L） |
| 实验组 | 43.12 | 875.3 | 38.5 |
| 对照组 | 85.48 | 1524.6 | 84.1 |
| 防效（%） | 49.55 | 42.58 | 54.22 |
由表2可以看出，喷施AFXSJGH16可湿性粉剂的小麦赤霉病发病率明显降低，这就说明该可湿性粉剂对小麦赤霉病的发生同样具有较高的防治作用，防效可达到49.55%；同时收获小麦中DON毒素减少了42.58%，玉米赤霉烯酮毒素含量减少了54.22%，由此可见，该可湿性粉剂可有效防控小麦赤霉病和赤霉毒素。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求的描述，结合本领域的基本常识，利用AFXSJGH16菌株防治赤霉病的发生、减少赤霉毒素的产生都应该属于本发明的保护范畴。
Claims (6)
1.一株成团泛菌（Pantoea agglomerans），其保藏号为CCTCC NO:M2015563;所述成团泛菌菌体呈杆状，革兰氏染色阴性。
2.如权利要求1所述成团泛菌在防治小麦赤霉病、降低小麦赤霉毒素含量中的应用；
其中，所述在防治小麦赤霉病、降低小麦赤霉毒素含量中的应用是指：将成团泛菌制成液体菌剂或可湿性粉剂，用于防治小麦赤霉病、降低小麦赤霉毒素含量。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述液体菌剂是这样获得的：
a）将权利要求1所述的成团泛菌接种于LB培养基中，30℃试管斜面培养48h，获得试管菌种；
b）将试管菌种接种至含有LB培养基的摇瓶中，30℃，150rpm振荡培养至对数生长期，获得菌种；
c）将菌种接种至含灭菌LB培养基的种子罐中，接种量为LB培养基体积的10%，在28-33℃温度下，搅拌培养至对数生长期，搅拌速率为150-180rpm，培养期间 通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得种子液；
d）将种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，接种量为发酵培养基体积的10%，于28-33℃，搅拌培养48-60h，搅拌速率为150-180rpm，发酵培养期间向发酵罐中通入无菌空气，通入量为1：0.2-0.4，获得成团泛菌的液体菌剂，其菌体含量不低于109个/ml。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，将液体菌剂喷施于小麦穗部，5ml/m2，用以防治小麦赤霉病、降低小麦中赤霉毒素含量。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述可湿性粉剂是由含权利要求1所述成团泛菌的液体菌剂与硅藻土、凹凸棒土按质量比1:1:1混合后获得；
其中，成团泛菌液体菌剂的菌体含量不低于109个/ml，可湿性粉剂的菌体含量不低于1010cfu/g。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，将可湿性粉剂悬浮于水溶液中，喷施于小麦穗部，用量为0.2g/m2，用以防治小麦赤霉病、降低小麦中赤霉毒素含量。
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