CN104222076B

CN104222076B - 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104222076B
Application number: CN201410303095.4A
Authority: CN
Inventors: 杨德昌; 李学红; 胡江春; 李春田; 潘华奇; 刘书琴; 杨永军; 赵少品; 王晓宏; 胡艳霞; 苑丽蒲
Original assignee: NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP AINO CO Ltd
Current assignee: NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP AINO CO Ltd
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104222076A

Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、4～10质量份的润湿剂和4～10质量份的分散剂；所述甲基营养型芽孢杆菌的制备方法是：按比例称取甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂，混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎后，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。该可湿性粉剂质量稳定、便于长期保存和使用，对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病具有较强的防治效果，克服了化学药剂所带来的环境毒副作用和农药残留问题，具有高效、无毒、安全无残留的特性，是一种安全有效、残留低的环境友好型绿色微生物农药，在微生物防治领域具有广阔的应用前景。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用，属于微生物农药领域。

背景技术

微生物农药，是指应用活体微生物及其代谢产物对农业病虫害进行防治。微生物农药具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不易产生抗药性等特点，因此得到了广泛研究。目前市场上已经有较为成熟的微生物农药产品，例如苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。

随着经济全球化的迅速发展，我国在国际农产品和食品贸易中将面对越来越苛刻的农药残留标准，这就要求我国农产品从传统种植方式逐步向绿色产业进行过渡，使用生物农药逐步替代化学农药施用，才能适应国际贸易中对出口农产品的高标准和新要求。同时，随着我国对生态环境可持续发展的要求，对微生物农药的需求也必然会逐渐增加。因此，微生物农药具有良好的发展前景和巨大的发展空间。

近年来，随着保护地蔬菜生产规模的不断扩大，灰霉病对蔬菜生产造成的危害越来越严重。灰霉病不仅在黄瓜、番茄、草莓、韭菜等蔬菜品种上大量发生，而且在棉花、果树等经济类作物上也时有发生，一旦发病往往给农业生产造成巨大损失。尤其是在黄瓜的保护地栽培中，灰霉病发病极为频繁，灰霉病会使黄瓜的花及果实发生腐烂，导致减产。一般发病时黄瓜的减产率可达20％～30％，发病严重时减产率甚至高达70％以上。因此，黄瓜灰霉病已成为黄瓜生产中的限制性障碍。目前用于防治灰霉病的常用药剂包括苯并咪唑类农药(多菌灵、苯菌灵、甲基硫菌)和二甲酰胺类农药(速克灵、菌核利、腐霉利等)。在上世纪80年代后又有乙霉威、嘧霉胺、环己酰胺、啶菌恶唑等化学药剂被相继开发。这些化学药剂对生物的伤害性很大、环境污染严重，有的药剂在蔬菜上的药物残留有蓄积作用，会对人体造成危害；有的药剂容易使农作物的病原菌产生抗药性，引起防治效果的逐年下降。

对于保护地栽培的苹果来说，最大的病害为苹果腐烂病。苹果腐烂病菌是弱寄生菌，凡是能够导致树势变弱的因素都能诱发苹果腐烂病，从而引起苹果树枝的枯萎、腐烂、致死。苹果腐烂病的防治药物也多为毒副作用大的化学类药剂，对环境、果树和人体都有很大的危害。

因此，针对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病，研制一种绿色环保型的、安全有效且无毒副作用的生物农药迫在眉睫。

中国科学院沈阳应用生态研究所胡江春等人从辽宁黄渤海海域的海泥样品中成功筛选、分离出一株海洋细菌；根据该菌的形态学特征、生物化学特征以及分子遗传学鉴定结果，将其鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotro-phicus)，简称BAC-9912。BAC-9912被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCCNo.M2010343，保藏日期为2010年12月9日。BAC-9912经培养后产生的物质具有很强的抗菌活性，其发酵产物对蔬菜根腐病、大豆根腐病、苹果腐烂病等真菌病毒具有很强的拮抗左右，而且对人畜没有不良影响，对环境无害，是一种有着广泛应用前景的新型微生物农药。但是，BAC-9912发酵液的稳定性差、不能长时间存放，且发酵液中的杀菌有效成分的含量不固定，作为微生物农药使用时多有不便，杀菌效果不能保证，因此必须将其制备成合适的农药剂型。

中国专利CN103039530A提供了一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法。所述可湿性粉剂采用特定方法制得的甲基营养型芽抱杆菌的原粉、轻质碳酸钙、十二烷基苯磺酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和分散剂亚甲基双甲基蔡磺酸钠组成；该发明的可湿性粉剂具有防治柑橘病害、特别是柑橘溃疡病的用途。但是，该发明的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂主要针对柑橘病害，对保护地蔬菜种植中常见的黄瓜灰霉病和苹果腐烂病的防治效果不佳。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用；该可湿性粉剂高效、稳定、无毒，能够快速杀灭致病菌，对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病具有良好的防治效果。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、4～10质量份的润湿剂和4～10质量份的分散剂；所述甲基营养型芽孢杆菌原药的制备方法是：向含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入絮凝剂并混合均匀，待菌体凝聚后加入助滤剂，然后经固液分离步骤收集菌体，干燥后即得原药。

本发明的进一步改进在于：所述可湿性粉剂优选包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、6～8质量份的润湿剂和6～8质量份的分散剂。

本发明的进一步改进在于：所述润湿剂是十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、烷基丁二酸磺酸盐、GSWP复合助剂中的任意一种或几种；所述分散剂是NNO、MF、SOPA、羟甲基纤维素中的任意一种或几种。

本发明的进一步改进在于：所述制备原药时，含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为100ppm～600ppm质量份，助滤剂的加入量为0.5％～3％质量份；所述固液分离步骤是过滤或离心；所述干燥过程为真空干燥，温度50℃～80℃，真空度为0.07Mpa～0.09Mpa。

本发明的进一步改进在于：所述制备原药时，含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为300ppm～500ppm质量份，助滤剂的加入量为1％～2％质量份；所述干燥过程中，温度60℃～70℃，真空度为0.07Mpa～0.09Mpa。

本发明的进一步改进在于：所述絮凝剂为聚丙烯酰胺，所述助滤剂为硅藻土。

本发明的进一步改进在于：所述可湿性粉剂中活芽孢的含量≥30亿/克。

一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于所述制备方法为：按比例称取甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂，混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎后，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。

所述粉碎过程中物料的温度不大于70℃；所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂过45μm标准筛网，通过率不小于95％。

一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂经稀释后喷雾，用于防治黄瓜灰霉病和苹果腐烂病。

用于防治黄瓜灰霉病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至500～800倍液后喷雾；用于防治苹果腐烂病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至50～200倍液后喷雾。

由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：

本发明提供了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。该可湿性粉剂中活芽孢的含量大于30亿/克，有效保证了对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病的防治效果，而且质量稳定、便于长期保存和使用；本发明可湿性粉剂以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分，克服了化学药剂所带来的环境毒副作用和农药残留问题，具有高效、无毒、安全无残留的特性，是一种安全有效、残留低的环境友好型绿色微生物农药，在微生物防治领域具有广阔的应用前景。

本发明可湿性粉剂所使用的活性成分为源自海洋的甲基营养型芽孢杆菌BAC-9912。BAC-9912是从辽宁渤海沿海的海泥中分离、筛选得到的，对番茄灰霉病、番茄枯萎病、番茄茎腐病、黄瓜灰霉病、苹果腐烂病、苹果干腐病、梨树枯萎病等植物病害都有较强的拮抗作用，非常适宜作为微生物农药的原料使用。

本发明提供的原药制备方法，首先向含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中添加絮凝剂，使得原本分散在发酵液中的菌体凝聚在絮凝剂上；然后加入助滤剂，以提高固液分离效率，收集到菌体湿品；最后通过真空干燥蒸发除去菌体湿品中残存的少量水分，真空干燥温度限定为50℃～80℃，有效地避免了高温对甲基营养型芽孢杆菌菌体的损伤。与目前常用的现将发酵液浓缩、然后进行喷雾干燥的方法相比，本发明有效解决了发酵液粘度大、菌体含量小、不易获得菌体的问题，制备过程简单快速，过滤时间短，能耗显著降低，发酵液处理量大、处理效率高，所用设备皆为常规化工设备，生产成本低。

本发明甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂选用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、烷基丁二酸磺酸盐或GSWP复合助剂作为润湿剂，这几种润湿剂与甲基营养型芽孢杆菌原药具有良好的相容性，而且具有合适的亲水亲油平衡值，能够有效改善可湿性粉剂在水中的润湿分散性能。本发明选用NNO、MF、羟甲基纤维素或SOPA作为分散剂，这几种分散剂与甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂都具有良好的相容性，显著提高了可湿性粉剂溶于水后形成的悬浮药液的均一性和稳定性。

本发明还提供了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法。该制备方法进一步限定使用气流粉碎机对原料进行粉碎，气流粉碎机以压缩空气为动力，气体在喷嘴处的膨胀造成较低的温度，所以在操作过程中不会产生大量的热，能够将物料温度稳定控制在70℃以下，不会损伤甲基营养型芽孢杆菌原药，使甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂中原药含量的恒定，进而保证了可湿性粉剂的防效；而且气流粉碎机的粉碎产品粒度均匀，有利于可湿性粉剂的均匀性。本发明产品过45μm筛网的通过率在95％以上，有利于可湿性粉剂的快速溶解稀释、以及在病株表面的铺展渗透。

本发明还提供了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用。将该可湿性粉剂经适度稀释后喷洒在患有黄瓜灰霉病或苹果腐烂病的病株上，能够起到与化学农药相近的防效，实现对黄瓜灰霉病或苹果腐烂病的有效防治。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：

本发明所涉及的甲基营养型芽孢杆菌菌株的分类命名为Bacillusmethylotro-phicus，简称BAC-9912，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCCNo.M2010343，保藏日期为2010年12月9日。

本发明制备甲基营养型芽孢杆菌原药时所使用的含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的制备方法参照中国专利CN102533579A：一种产芽孢培养基及其优化过程与应用。培养基的组成及重量配比为：玉米粉1.8％，麸皮0.35％，黄豆饼粉0.1％，十二水磷酸二氢钾0.05％，无水碳酸钙0.07％，其余为水；培养基体系的pH为6.5。

一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、4～10质量份的润湿剂和4～10质量份的分散剂；优选包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、6～8质量份的润湿剂和6～8质量份的分散剂；最优选包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、6质量份的润湿剂和6质量份的分散剂。

所述润湿剂是十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、烷基丁二酸磺酸盐、GSWP复合助剂中的任意一种或几种，优选为GSWP复合助剂。所述GSWP复合助剂由石家庄奇正精细化工厂生产，主要成分为木质素磺酸盐、OP-10(烷基酚聚氧乙烯基醚)和二氧化硅。

所述分散剂是NNO(萘磺酸钠甲醛缩合物)、MF(甲基萘磺酸钠甲醛缩合物)、SOPA(烷基酚聚氧乙烯基醚甲醛缩合物磺酸盐)、羟甲基纤维素中的任意一种或几种，优选的为MF。.

所述可湿性粉剂中活芽孢的含量≧30亿/克。

所述甲基营养型芽孢杆菌原药是按下列方法制得的：向含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入絮凝剂并混合均匀，待菌体凝聚后加入助滤剂，然后经固液分离步骤收集菌体，干燥后即得原药。

所述含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为100ppm～600ppm质量份，助滤剂的加入量为0.5％～3％质量份；优选：含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液为1质量份，絮凝剂的加入量为300ppm～500ppm质量份，助滤剂的加入量为1％～2％质量份；最优选：含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液为1质量份，絮凝剂的加入量为300ppm质量份，助滤剂的加入量为1％质量份。

所述絮凝剂优选为聚丙烯酰胺絮凝剂，助滤剂优选硅藻土；加入絮凝剂后的菌体凝聚时间为20～40min，优选30min。

所述固液分离步骤可采用离心或过滤方式。所述干燥过程为真空干燥，干燥设备优选真空双锥回转干燥机；真空干燥温度为50℃～80℃，优选60℃～70℃；干燥真空度为0.07Mpa～0.09Mpa。

甲基营养型芽孢杆菌原药的最优制备工艺为：向1质量份的含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入300ppm～500ppm的聚丙烯酰胺絮凝剂，待菌体凝聚后加入1.0％～2.0％质量份的硅藻土，混合均匀；然后通过离心或过滤收集菌体，在60℃～70℃、真空度0.07Mpa～0.09Mpa条件下进行真空干燥，干燥至水分≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其制备过程为：按比例称取甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂，混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎，粉碎过程中物料的温度不大于70℃，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂过45μm标准筛网，通过率不小于95％。

甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的最优制备工艺为：向100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入6质量份的GSWP复合助剂、6质量份的分散剂MF，混合均匀，然后经气流粉碎，粉碎过程物料温度≤70℃，粉碎细度应达到45μm筛通过率≥95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。

所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂满足下列条件：

所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂经稀释后喷雾，可用于防治黄瓜灰霉病和苹果腐烂病病害。用于防治黄瓜灰霉病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至500～800倍液后喷雾；用于防治苹果腐烂病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至50～200倍液后喷雾。

实施例1

(1)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP1-1的制备

向1份含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入1.0％的硅藻土，经固液分离步骤收集菌体，在60℃～70℃、真空度0.07Mpa～0.09Mpa条件下干燥至水分≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

向100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入6质量份的GSWP复合助剂、6质量份的分散剂MF，混合均匀后进行气流粉碎，粉碎细度为45μm标准筛通过率≧95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP1-1。

(2)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP1-2～WP1-8的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP1-1的制备基本相同，其区别在于：首先向含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入絮凝剂聚丙烯酰胺、待菌体凝聚30min后再加入硅藻土，且聚丙烯酰胺的加入量不同。具体加入量见下表。

名称	聚丙烯酰胺的加入量5 -->
		WP1-2	100ppm
WP1-3	200ppm
		WP1-4	300ppm
WP1-5	400ppm
		WP1-6	500ppm

WP1-7	600ppm
		WP1-8	700ppm

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP1-1～WP1-8进行性能测试，测试结果见表1。

测试项目为活性成分计数；测试方法采用菌落单位形成法(CFU)。具体测试步骤为：称取可湿性粉剂10g，放入100ml无菌容量瓶中，用无菌水定容至100ml，振摇约20分钟，使可湿性粉剂与水充分混合，将菌分散,该稀释液为10^-1g/ml稀释液。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml的10^-1g/ml稀释液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分振荡混匀，制成10^-2g/ml稀释液；以此类推，制成10^-3g/ml稀释液、10^-4g/ml稀释液、10^-5g/ml稀释液、10^- ⁶g/ml稀释液、10^-7g/ml稀释液。上述称量及稀释过程进行5个重复，即分别称量5个样品进行稀释，目的是增加数据量，减少实验误差。稀释完成后吸取10^-7g/ml稀释液100μL分别涂布到预先准备好的改良淀粉琼脂培养基上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，每个浓度涂布5个平板。将接菌的平板倒置于37℃温室中培养1～3日，根据活性成分菌落特征进行计数，然后进行含量计算。每平板菌落数20～200个为宜，以保证菌落充分分散，便于菌落特征辨别及菌落计数。

上述过程所用培养基为改良淀粉培养基，培养基的组成及重量配比为：可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.8％，余量为水；在自然pH下121℃蒸汽灭菌20min。

表1实施例1性能测试数据

由表1中的数据可以看出，不添加絮凝剂的可湿性粉剂WP1-1，可湿性粉剂中的活性成分含量较高，对病菌的防效较高；但是由于含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中的菌体微小、分散，导致在菌体分离时的难度和能耗都非常大，不利于工业化放大生产。絮凝剂添加量为700ppm的可湿性粉剂WP1-8，由于絮凝剂的加入量过大，因此菌体过度凝聚，WP1-8在使用时菌体无法完全分散，反而降低了防治作用，影响其使用效果。

当絮凝剂的加入量控制在100ppm～600ppm之间(即WP1-2～WP1-7)、尤其是絮凝剂加入量为300ppm～500ppm时，发酵液中的菌体分离较为容易，所制可湿性粉剂的活性成分含量也较高，能够同时保证甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的使用效果和工业化生产的效率；当絮凝剂加入量为300ppm时，效果最佳。

实施例2

(1)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP2-1的制备

向1份含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入300ppm的聚丙烯酰胺，待菌体凝聚30min后，在不加入硅藻土的情况下进行固液分离收集菌体，在60℃～70℃、真空度0.07Mpa～0.09Mpa条件下干燥至水分≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

向100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入6质量份的GSWP复合助剂、6质量份的分散剂MF，混合均匀后进行气流粉碎，粉碎细度为45μm标准筛通过率≧95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP2-1。

(2)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP2-2～WP2-8的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP2-1的制备基本相同，其区别在于：待菌体凝聚30min后先加入助滤剂硅藻土、再进行固液分离步骤，且硅藻土的加入量不同，具体加入量见下表。

待测样品	硅藻土的加入量(％)
		WP2-2	0.5
WP2-3	1.0

WP2-4	1.5
		WP2-5	2.0
WP2-6	2.5
		WP2-7	3.0
WP2-8	3.5

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP2-1～WP2-8进行性能测试，测试结果见表2。测试方法与实施例1中的测试方法相同。

表2实施例2性能测试数据

由表2中的数据可以看出，不添加助滤剂硅藻土的可湿性粉剂WP2-1，尽管可湿性粉剂中的活性成分含量较高、能对病菌带来良好的防效，但是，由于发酵液所含菌体微小、成分复杂，所以固液分离过程难度很大、不易过滤，不利于工业化大生产。硅藻土添加量为3.5％的可湿性粉剂WP2-8，发酵液的固液分离过程非常容易，但由于硅藻土的加入量较大，使菌体过度被稀释，导致最终制得的原药中的菌体浓度很低，进而影响了可湿性粉剂产品中的有效活性成分含量，降低了其对病害的防效。

当硅藻土的加入量控制在0.5％～3％之间(即WP2-2～WP2-7)、尤其是硅藻土的加入量为1％～2％时，发酵液中的菌体分离较为容易，所制可湿性粉剂的活性成分含量也较高，能够同时保证甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的使用效果和工业化生产的效率；特别是当硅藻土的加入量为1％时，效果最佳。

实施例3

(1)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP3-1的制备

向1份含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入300ppm的聚丙烯酰胺，待菌体凝聚30min后加入1.0％的硅藻土，经固液分离步骤收集菌体，在室温、真空度0.07MPa～0.09Mpa条件下干燥6h，制得甲基营养型芽孢杆菌原药。

向100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入6质量份的GSWP复合助剂、6质量份的分散剂MF，混合均匀后进行气流粉碎，粉碎细度为45μm标准筛通过率≧95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP3-1。

(2)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP3-2～WP3-7的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP3-1的制备基本相同，其区别在于：制备甲基营养型芽孢杆菌原药时的干燥温度不同，具体干燥温度如下：

待测样品	原药干燥温度(℃)
		WP3-2	40
WP3-3	50
		WP3-4	60
WP3-5	708 -->
		WP3-6	80
WP3-7	90

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP3-1～WP3-7的水分含量和活性成分含量进行检测、并计算活性成分存活率，测试结果见表3。活性成分含量的检测方法同实施例1，活性成分存活率的计算公式如下：

表3实施例3性能测试数据

待测样品	水分含量(％)	活性成分存活率(％)
			WP3-1	30.2	100
WP3-2	14.3	100
			WP3-3	4.9	98.2
WP3-4	4.0	92.6
			WP3-5	3.1	84.9
WP3-6	2.3	67.5
			WP3-7	1.7	15.7

由表3中的数据可以看出，原药干燥温度为室温的可湿性粉剂WP3-1，其活性成分存活率高达100％，菌体完全没有被破坏；但是，经过6h的干燥后，所得可湿性粉剂的水分含量仍高达30.2％，这就会导致可湿性粉剂在储存时易结块，而且流动性差，不易溶解和分散，使用效果不佳；若要通过延长干燥时间来降低水分含量，则导致能耗的显著提高，不利于工业生产。可湿性粉剂WP3-7所用原药的干燥温度为90℃，干燥6h后的WP3-7水分含量很低，但是由于甲基营养型芽孢杆菌属于活体微生物，90℃的高温导致绝大多数的菌体死亡，活性成分的存活率仅为15.7％，无法满足对病害的防治要求。

当原药干燥温度控制在量控制在50℃～80℃时(即WP3-3～WP3-6)，可湿性粉剂的活性成分存活率均在60％以上，具有对病害较好的防治效果，而且可湿性粉剂的水分含量较低，满足长期贮存的要求。特别是原药干燥温度为60℃～70℃时，可湿性粉剂的活性成分存活率在80％以上，且水分含量也很低，更加有利于可湿性粉剂的贮存及病害的防治。

实施例4

(1)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-1的制备

向1份含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入300ppm的聚丙烯酰胺，待菌体凝聚30min后加入1％质量份的硅藻土，然后通过固液分离收集菌体，在60℃～70℃、真空度0.07Mpa～0.09Mpa条件下干燥至水分≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

向100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入6质量份的分散剂MF，混合均匀后进行气流粉碎，粉碎细度为45μm标准筛通过率≧95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-1。

(2)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-2～WP4-1-7的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-1的制备基本相同，其区别在于：向甲基营养型芽孢杆菌原药中加入润湿剂十二烷基硫酸钠和分散剂MF，再进行混合粉碎；且所述润湿剂十二烷基硫酸钠的加入量不同。具体加入量见下表。

待测样品	十二烷基硫酸钠加入量(质量份)

WP4-1-2	2
		WP4-1-3	4
WP4-1-4	6
		WP4-1-5	8
WP4-1-6	10

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-1～WP4-1-7进行润湿性能测试。润湿性能是以润湿时间来表征的；润湿时间的测试方法参照GB/T5451—2001《农药可湿性粉剂润湿性测定方法》。测试结果见表4。

表4实施例4第一组润湿性能测试数据

待测样品	润湿时间(s)
		WP4-1-1	135.4
WP4-1-2	116.2
		WP4-1-3	89.3
WP4-1-4	80.0
		WP4-1-5	74.2
WP4-1-6	72.1
		WP4-1-7	70.9

(3)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-2-1的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-2的制备基本相同，其区别在于：所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠。

(4)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-2-2～WP4-2-6的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-2-1的制备基本相同，其区别在于：所述润湿剂十二烷基苯磺酸钠的加入量不同；具体加入量见表5。

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-2-1～WP4-2-6进行润湿性能测试，测试结果见表5。

表5实施例4第二组润湿性能测试数据

待测样品	十二烷基苯磺酸钠加入量(质量份)	润湿时间(s)
			WP4-2-1	2	114.8
WP4-2-2	4	86.0
			WP4-2-3	6	77.4
WP4-2-4	8	69.1

WP4-2-6

12

65.6

(5)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-3-1的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-2的制备基本相同，其区别在于：所述润湿剂为烷基丁二酸磺酸盐。

(6)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-3-2～WP4-3-6的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-3-1的制备基本相同，其区别在于：所述润湿剂烷基丁二酸磺酸盐的加入量不同；具体加入量见表6。

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-3-1～WP4-3-6进行润湿性能测试，测试结果见表6。

表6实施例4第三组润湿性能测试数据

待测样品	烷基丁二酸磺酸盐加入量(质量份)	润湿时间(s)
			WP4-3-1	2	111.5
WP4-3-2	4	85.6
			WP4-3-3	6	74.5
WP4-3-4	8	66.5
			WP4-3-5	10	64.1
WP4-3-6	12	63.6

(7)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-4-1的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-1-2的制备基本相同，其区别在于：所述润湿剂为GSWP复合助剂。

(8)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-4-2～WP4-4-6的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-4-1的制备基本相同，其区别在于：所述GSWP复合助剂的加入量不同；具体加入量见表7。

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP4-4-1～WP4-4-6进行润湿性能测试，测试结果见表7。

表7实施例4第四组润湿性能测试数据

待测样品	GSWP复合助剂(质量份)	润湿时间(s)
			WP4-4-1	2	106.3
WP4-4-2	4	79.2
			WP4-4-3	6	66.9

WP4-4-4	8	58.3
			WP4-4-5	10	56.4
WP4-4-6	12	55.1

由上述四组润湿性能测试数据可以看出，润湿剂的加入，能够显著提高可湿性粉剂在水中的润湿能力，迅速形成混悬药液，并有效改善药液的渗透性、以及在处理对象表面的粘展性。

本实施例中的四种润湿剂十二烷基硫酸钠、十二烷基笨磺酸钠、烷基丁二酸磺酸盐和GSWP复合助剂均与甲基营养型芽孢杆菌原药具有良好的相容性，显著改善了可湿性粉剂的润湿分散，其中GSWP复合助剂的润湿效果最佳。

由上面四个表格中的数据可知，润湿剂加入量为2质量份时，所制可湿性粉剂的润湿时间仍都在100s以上，润湿性能较差，不利于可湿性粉剂在水中迅速润湿，从而影响到可湿性粉剂的使用性能；润湿剂加入量为12质量份时，由于可湿性粉剂中润湿剂含量较多，亲水性较强，但会导致混悬药液的渗透性和铺展性降低，进而影响药效。当润湿剂的加入量为4～10质量份、尤其是6～8质量份时，即能够保证可湿性粉剂在水中迅速分散，提高其使用性能及防治效果，又能够保证润湿剂对可湿性粉剂的润湿性具有明显的改善效果，提高润湿剂的使用效率，同时使药液具有适合的亲油能力，具有较好的铺展性，进而提高防治效果。

实施例5

(1)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-1的制备

向100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入6质量份的GSWP复合助剂，混合均匀后进行气流粉碎，粉碎细度为45μm标准筛通过率≧95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-1。

(2)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-2～WP5-1-7的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-1的制备基本相同，其区别在于：向甲基营养型芽孢杆菌原药中加入GSWP复合助剂和分散剂NNO后，再进行混合粉碎；且所述分散剂NNO的加入量不同。具体加入量见下表。

待测样品	NNO加入量(质量份)
		WP5-1-2	2
WP5-1-3	4
		WP5-1-4	6
WP5-1-5	8
		WP5-1-6	10
WP5-1-7	12

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-1～WP5-1-7进行分散性能测试。可湿性粉剂的分散性能是以悬浮率来表征的，悬浮率的测试方法参照GB/T14825—2006《农药悬浮率测定方法》。测试结果见表8。

表8实施例5第一组分散性能测试数据

待测样品	悬浮率(％)
		WP5-1-1	23.1
WP5-1-2	48.9
		WP5-1-3	65.112 -->
WP5-1-4	76.2
		WP5-1-5	81.9
WP5-1-6	83.2
		WP5-1-7	84.1

(3)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-2-1的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-2的制备基本相同，其区别在于：所述分散剂为MF。

(4)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-2-2～WP5-2-6的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-2-1的制备基本相同，其区别在于：所述分散剂MF的加入量不同；具体加入量见表9。

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-2-1～WP5-2-6进行分散性能测试，测试结果见表9。

表5实施例5第二组润分散能测试数据

待测样品	MF加入量(质量份)	悬浮率(％)
			WP5-2-1	2	49.7
WP5-2-2	4	69.2
			WP5-2-3	6	82.1
WP5-2-4	8	87.9
			WP5-2-5	10	88.5

(5)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-3-1的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-2的制备基本相同，其区别在于：所述分散剂为羟甲基纤维素。

(6)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-3-2～WP5-3-6的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-3-1的制备基本相同，其区别在于：所述分散剂羟甲基纤维素的加入量不同；具体加入量见表10。

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-3-1～WP5-3-6进行分散性能测试，测试结果见表10。

表10实施例5第三组分散性能测试数据

待测样品	羟甲基纤维素加入量(质量份)	悬浮率(％)
			WP5-3-1	2	43.4
WP5-3-2	4	60.2
			WP5-3-3	6	68.3
WP5-3-4	8	76.7
			WP5-3-5	10	77.7
WP5-3-6	12	78.3

(7)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-4-1的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-1-2的制备基本相同，其区别在于：所述分散剂为SOPA。

(8)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-4-2～WP5-4-6的制备

制备过程与甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP54-4-1的制备基本相同，其区别在于：所述分散剂SOPA的加入量不同；具体加入量见表11。

对甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP5-4-1～WP5-4-6进行分散性能测试，测试结果见表11。

表11实施例5第四组分散性能测试数据

待测样品	SOPA加入量(质量份)	悬浮率(％)
			WP5-4-1	2	47.4
WP5-4-2	4	62.5
			WP5-4-3	6	72.5
WP5-4-4	8	77.9
			WP5-4-5	10	79.4
WP5-4-6	12	80.2

由上述四组分散性能测试数据可以看出，分散剂的加入，能够有效降低分散体系中固体或液体粒子聚集，克服聚团现象，保证可湿性粉剂水溶后形成的混悬药液稳定、分散。

本实施例中的四种分散剂NNO、MF、羟甲基纤维素和SOPA均与甲基营养型芽孢杆菌原药具有良好的相容性，能够显著改善可湿性粉剂混悬药液的稳定性，从而有利于混悬药液在病株表面上的粘附，提高了药效。其中分散剂MF的分散效果最佳。

由上面四个表格中的数据可知，分散剂加入量为2质量份时，所制可湿性粉剂的悬浮率都低于60％，分散性能较差，不能满足可湿性粉剂的性能要求。各种分散剂的加入量大于等于4质量份时，可湿性粉剂的悬浮率均可达到60％以上，混悬药液的分散性能较好。但分散剂加入量为12质量份时，由于可湿性粉剂中分散剂含量较多，亲水性较强，会导致混悬药液的渗透性和铺展性降低，进而影响药效。当分散剂的加入量为4～10质量份、尤其是6～8质量份时，即能够保证可湿性粉剂在水中稳定分散，提高其使用性能及防治效果，又能够保证分散剂对可湿性粉剂的分散性能具有明显的改善效果，提高分散剂的使用效率。同时使药液具有适合的亲油性，能够较好的铺展，进而提高防治效果。

下列实施例6～实施例10为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备实施例。

实施例6

6.1含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的制备

首先活化保藏的甲基营养型芽孢杆菌菌株，挑取活化后的单菌落接种于试管或克氏瓶上进行斜面培养，28℃下培养48h～96h，然后无菌取样、显微镜检测其培养物熟化程度，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的斜面培养物作为发酵种子。

将所得芽孢形成均一、两端着色清晰的培养物无菌接种于培养基中，36℃下培养18h至菌体达到对数生长期且菌体数量≥10⁷CFU/mL，即得发酵种子液。

将所得发酵种子液按照10％的体积比例再次接种到培养基中，进行发酵培养，培养条件为：罐压0.05Mpa，通气量100:150vvm，转速250rpm，培养温度为36℃；当发酵液芽孢率达到80％～99％，有效芽孢数达≥10⁹CFU/mL时，即可终止发酵，得到含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液。

所用培养基成分，按照重量计：玉米粉：1.8％，麸皮：0.35％，黄豆饼粉：0.1％，十二水磷酸二氢钾：0.05％，无水碳酸钙：0.07％，其余为水，pH＝6.5。

6.2甲基营养型芽孢杆菌原药的制备

向10000g(1质量份)含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入3g(300ppm质量份)聚丙烯酰胺，混合均匀；待菌体凝聚30min后加入100g(1％质量份)硅藻土，搅拌后过滤，所得滤饼在60℃～70℃、0.07Mpa～0.09Mpa真空度条件下干燥至水分含量≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

6.3甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6的制备

向100g(100质量份)的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入6.0g(6质量份)GSWP复合助剂、6.0g(6质量份)MF，混合均匀，然后经气流粉碎至45μm筛通过率≥95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6。

将所得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6进行性能测试，所述性能测试均是根据可湿性粉剂的国标中的相应方法进行，测试结果见表12.

表12可湿性粉剂WP-6的性能测试数据

性能测试项目	测试结果
		活性成分含量(CFU/g)	63.8×10⁸

细度(过45μm筛)(％)	97.5
		pH值	7.00
悬浮率(％)	85.1
		润湿时间(s)	58.7
干燥减量(％)	3.8
		杂菌率(％)	0

将WP-6按照GB/T19136-2003《农药热贮稳定性测定方法》中“粉体制剂”的稳定性测试方法进行测定，即在54℃±2℃保存14天，然后对可湿性粉剂中的活性成分含量进行测定，取5个样品重复测试，测试数据见表13。

表13可湿性粉剂WP-6的稳定性测试数据

样品序号	活性成分含量(CFU/g)
		样品1	53.5
样品2	57.1
		样品3	52.6
样品4	50.8
		样品5	59.7
平均值	54.7

由表13中数据可以看出，本发明所制备的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的热稳定性较好，在54℃±2℃保存14天后的活性成分含量仍然大于30×10⁸CFU/g，便于贮存和使用。

实施例7

7.1含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的制备

同实施例6中步骤6.1的制备；

7.2甲基营养型芽孢杆菌原药的制备

向10000g(1质量份)含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入5g(500ppm质量份)聚丙烯酰胺，混合均匀；待菌体凝聚30min后加入200g(2％质量份)硅藻土，搅拌后过滤，所得滤饼在60℃～70℃、0.07Mpa～0.09Mpa真空度条件下干燥至水分含量≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

7.3甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-7的制备

向100g(100质量份)的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入8.0g(8质量份)十二烷基硫酸钠、8.0g(8质量份)NNO分散剂，混合均匀，然后经气流粉碎至45μm筛通过率≥95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-7。

实施例8

8.1含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的制备

同实施例6中步骤6.1的制备；

8.2甲基营养型芽孢杆菌原药的制备

向10000g(1质量份)含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入4g(400ppm质量份)聚丙烯酰胺，混合均匀；待菌体凝聚30min后加入100g(1％质量份)硅藻土，搅拌后过滤，所得滤饼在60℃～70℃、0.07Mpa～0.09Mpa真空度条件下干燥至水分含量≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

8.3甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-8的制备

向100g(100质量份)的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入4.0g(4质量份)十二烷基苯磺酸钠、7.0g(7质量份)羟甲基纤维素，混合均匀，然后经气流粉碎至45μm筛通过率≥95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-8。

实施例9

9.1含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的制备

同实施例6中步骤6.1的制备；

9.2甲基营养型芽孢杆菌原药的制备

向10000g(1质量份)含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入1g(100ppm质量份)聚丙烯酰胺，混合均匀；待菌体凝聚30min后加入150g(1.5％质量份)硅藻土，搅拌后过滤，所得滤饼在60℃～70℃、0.07Mpa～0.09Mpa真空度条件下干燥至水分含量≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

9.3甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-9的制备

向100g(100质量份)的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入10.0g(10质量份)烷基丁二酸磺酸盐、4.0g(4质量份)SOPA，混合均匀，然后经气流粉碎至45μm筛通过率≥95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-9。

实施例10

10.1含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的制备

同实施例6中步骤6.1的制备；

10.2甲基营养型芽孢杆菌原药的制备

向10000g(1质量份)含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入6g(600ppm质量份)聚丙烯酰胺，混合均匀；待菌体凝聚30min后加入50g(0.5％质量份)硅藻土，搅拌后过滤，所得滤饼在60℃～70℃、0.07Mpa～0.09Mpa真空度条件下干燥至水分含量≤5.0％，即得甲基营养型芽孢杆菌原药。

10.3甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-10的制备

向100g(100质量份)的甲基营养型芽孢杆菌原药中加入7g(7质量份)烷基丁二酸磺酸盐、5g(5质量份)SOPA，混合均匀，然后经气流粉碎至45μm筛通过率≥95％，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-10。

取实施例7～实施例10制得的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂进行性能测试，测试方法同实施例6，测试结果见表14.

表14可湿性粉剂WP-7～WP-10的性能测试数据

性能测试项目	WP-7	WP-8	WP-9	WP-10
					活性成分含量(CFU/g)	49.8×10⁸	61.6×10⁸	75.4×10⁸	54.8×10⁸
细度(过45μm筛，％)	96.9	97.2	98.1	97.7
					pH值	6.97	7.00	6.99	7.01
悬浮率(％)	82.9	73.7	64.5	70.8
					润湿时间(s)	71.2	81.1	62.1	65.8
干燥减量(％)	3.4	3.2	3.1	3.7

取实施例7～实施例10制得的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂进行稳定性测试，测试方法同实施例6。所测可湿性粉剂的活性成分含量的平均值见表15。

表15可湿性粉剂WP-7～WP-10的稳定性测试数据

待测样品	活性成分含量(CFU/g)
		WP-7	43.4×10⁸
WP-8	52.2×10⁸
		WP-9	62.6×10⁸
WP-10	46.0×10⁸

由以上表14和表15中的数据可以看出，实施例7～实施例10所制备的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂也都具有良好的使用性能和热稳定性能，活性成分均大于30×10⁸CFU/g，对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病具有良好的杀除效果，而且稳定性高，便于贮存和使用。

下列实施例11和实施例12为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用实施例。

实施例11

本实施例为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病的防治应用实施例。通过两方面进行验证，一方面为可湿性粉剂对菌丝的室内活性测定试验，一方面为田间试验。所用试验药剂均为实施例6中所制得的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6。

(一)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长速率的室内抑制活性测定

通过室内活性测定实验，测定出甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长速率的抑制活性，以评价甲基营养型芽孢的生物活性。该测定按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T1156.2-2006)中的菌丝生长速率法进行测定。药剂对黄瓜灰霉病菌菌丝的生长抑制率的计算公式如下：

式中，菌落增长直径＝菌落直径-菌饼直径。

通过以上过程获得实验数据后，再采用回归分析法进行分析，将菌丝生长抑制率转换为几率值，以各药剂浓度对数值为横坐标，用直线回归分析法计算出EC₅₀值，比较各处理药剂的毒力大小。

下表是甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的测试值，并以现在常用的黄瓜灰霉病杀菌剂百菌清为对照组进行对比。

表16黄瓜灰霉病菌菌丝生长速率抑制实验数据

由表16的数据可以看出，甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长速率的抑制中浓度EC₅₀为9.5ug/ml，对照药剂百菌清对黄瓜灰霉病菌菌丝生长速率的抑制中浓度EC₅₀为3.18ug/ml。作为微生物农药，能够具有与化学类农药百菌清相仿的效果，表明甲基营养型芽孢杆菌对黄瓜灰霉病菌菌丝生长有较好的抑制作用。

(二)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间试验

试验时间：2013年

防治对象：黄瓜灰霉病

试验环境条件：山东省肥城市仪阳镇石坞村，地块面积0.9亩，土壤类型为褐土，有机质含量1.55％；黄瓜株距25cm，窄行距40cm，种植密度4444株/亩，施药时处于初花期。

试验药剂：甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6。

对照药剂：20％嘧霉胺可湿性粉剂。

试验处理：①甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6的500倍稀释液；②甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6的800倍稀释液；③甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6的1200倍稀释液；④20％嘧霉胺可湿性粉剂的333倍稀释液；⑤空白对照。上述5组各4次重复，共20个小区，每小区面积25m²。

施药方法和次数：均匀喷雾，黄瓜灰霉病发病时第一次用药，此后间隔7天用一次药，共使用3次。

病情调查：药剂处理前调查病指基数；第一次施药后7天调查；第二次施药后7天调查；第三次施药后10天调查，共4次。病情按如下标准分级：

0级：无病斑；1级：单叶片有病斑3个；3级：单叶片有病斑4-6个；5级：单叶片有病斑7-10个；7级：单叶片有病斑11-20个，部分密集成片；9级：单叶片有病斑密集占叶片面积四分之一以上。

药效计算方法如下列公式：

式中，PT₀：药剂处理区施药前病情指数；

CK₀：空白对照区施药前病情指数；

PT₁：药剂处理区施药前病情指数；

CK₁：空白对照区施药前病情指数。

具体实验数据列入表17中。

表17甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病的防治效果

从表17的数据可以看出，甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂500倍稀释液、800倍稀释液、1200倍稀释液用药后的防效分别为60.82％、56.37％、53.80％，虽然略低于40％嘧霉胺可湿性粉剂1000倍稀释液73.67％的防效，但仍对黄瓜灰霉病具有较好的防效。差异显著性测定结果中，试验药剂的500倍稀释液、800倍稀释液与对照药剂之间差异不显著，说明甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的500倍稀释液、800倍稀释液对黄瓜灰霉病均具有良好的防治效果；而甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的1200倍稀释液与对照药剂差异显著，无法达对黄瓜灰霉病的防治要求。

实施例12

本实施例为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对苹果腐烂病的防治应用实施例。通过两方面进行验证，一方面为可湿性粉剂对菌丝的室内活性测定试验，一方面为田间试验。所用试验药剂均为实施例6中所制得的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6。

(一)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对苹果腐烂病菌菌丝生长速率的室内抑制活性测定

通过室内活性测定实验，测定出甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对苹果腐烂病菌菌丝生长速率的抑制活性，以评价甲基营养型芽孢的生物活性。该测定按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T1156.2-2006)中的菌丝生长速率法进行测定。药剂对苹果腐烂病菌菌丝的生长抑制率的计算公式如下：

式中，菌落增长直径＝菌落直径-菌饼直径。

下表是甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的测试值，并以现在常用的苹果腐烂病杀菌剂百菌清为对照组进行对比。

表18苹果腐烂病菌菌丝生长速率抑制实验数据

由表18的数据可以看出，甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对苹果腐烂病菌菌丝生长速率的抑制中浓度EC₅₀为22.14×10⁴ug/ml，对照药剂百菌清对苹果腐烂病菌菌丝生长速率的抑制中浓度EC₅₀为5.58ug/ml。作为微生物农药，与化学类农药百菌清相比具备上述效果，表明甲基营养型芽孢杆菌对苹果腐烂病菌菌丝生长有较好的抑制作用。

(二)甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂防治苹果腐烂病田间试验

试验时间：2012年

防治对象及试验作物：防治对象为苹果腐烂病，试验作物为10年生苹果树，品种为富士。

试验环境条件：山东省栖霞市蛇窝泊镇东李王家村，地块面积0.25hm²，试验地砂质土壤，肥力中等，株行距3m×3.5m。

试验药剂：甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6。

对照药剂：40％福美胂可湿性粉剂。

试验处理：①甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6的50倍稀释液；②甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6的100倍稀释液；③甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂WP-6的200倍稀释液；④40％福美胂可湿性粉剂的400倍稀释液；⑤空白对照(清水)。上述5组各4次重复，共20个小区。

施药方法和次数：2012年4月上旬，应用甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对苹果腐烂病进行防治效果试验。具体做法为5天喷施一次，连续使用三次。同时由于春季是苹果腐烂病发病高峰期，所以在防治前对试验果树的树体病块组织进行刮除处理，即对较为严重的病块组织，用利刃消除，对较轻的病块组织，用利刃纵割数刀至木质部，然后在病块处用毛刷均匀涂抹对应的处理组药液，以便加强其防治效果。。

病情调查：施药前调查各小区药前病块数；施药后调查各小区药后病块数药效计算方法如下列公式：

具体实验数据列入表19中。

表19甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对苹果腐烂病的防治效果

从表19的数据可以看出，甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的50倍稀释液、100倍稀释液及200倍稀释液对苹果腐烂病的防效分别为为72.85％、68.67％、63.82％，40％福美胂的400倍稀释液对苹果腐烂病的防效为73.28％，基本持平。差异显著性测定结果表明，本发明的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂与化学药剂福美胂之间的防效无显著性差异，甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的50倍稀释液、100倍稀释液和200倍稀释液均对苹果腐烂病具有良好的防效。

Claims

1.一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述可湿性粉剂包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、4～10质量份的润湿剂和4～10质量份的分散剂；所述甲基营养型芽孢杆菌原药的制备方法是：向含有1质量份的甲基营养型芽孢杆菌发酵液中加入100ppm～600ppm质量份的絮凝剂聚丙烯酰胺并混合均匀，待菌体凝聚后加入0.5％～3％质量份的助滤剂硅藻土，然后经固液分离步骤收集菌体，所述固液分离步骤是过滤或离心；干燥后即得原药，所述干燥过程为真空干燥，温度50℃～80℃，真空度为0.07Mpa～0.09Mpa；所述润湿剂是十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、烷基丁二酸磺酸盐、GSWP复合助剂中的任意一种或几种；所述分散剂是NNO、MF、SOPA、羟甲基纤维素中的任意一种或几种。

2.根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述可湿性粉剂包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、6～8质量份的润湿剂和6～8质量份的分散剂。

3.根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述制备原药时，含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为300ppm～500ppm质量份，助滤剂的加入量为1％～2％质量份；所述干燥过程中，温度60℃～70℃，真空度为0.07Mpa～0.09Mpa。

4.根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述可湿性粉剂中活芽孢的含量≥30亿/克。

5.一种如权利要求1～4任一项所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于所述制备方法为：按比例称取甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂，混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎后，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。

6.根据权利要求5所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：粉碎过程中物料的温度不大于70℃；所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂过45μm标准筛网，通过率不小于95％。

7.一种如权利要求1～4任一项所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂经稀释后喷雾，用于防治黄瓜灰霉病和苹果腐烂病。

8.根据权利要求7所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用，其特征在于：用于防治黄瓜灰霉病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至500～800倍液后喷雾；用于防治苹果腐烂病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至50～200倍液后喷雾。