CN112501054A - 甲基营养型芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用，涉及高效农业技术领域。由甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和亚甲基二萘磺酸钠组成甲基营养型芽孢杆菌剂，并将甲基营养型芽孢杆菌剂作为生长增效剂应用在黄瓜种植中。本发明的甲基营养型芽孢杆菌剂对能促进黄瓜植株和根系的生长，达到增强根系活力的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及高效农业技术领域，尤其涉及一种用于促进黄瓜生长的甲基营养型芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
甲基营养型芽孢杆菌是一种革兰氏阳性，产芽孢的细菌。芽孢杆菌属于细菌界(Bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽孢杆菌和乳杆菌组(Bacilli and Lactobacilli)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、芽孢杆菌目(Bacillales)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及其他21个近似属，其中仅芽孢杆菌属就包含200多种菌。
甲基营养型芽孢杆菌不仅可以促进土壤矿物及有机物的分解，为植物提供营养；同时还可以分泌IAA，Butanidiol等植物激素以及小分子气调物质；此外，还可以诱导植物提高自身抗病害能力(ISR)，并可以通过合成脂肽类，细菌素，抗菌蛋白等抑菌物质，以及形成生物菌膜(Biofilm)等物理屏障，而直接帮助植物抵御病原微生物。总的来讲，甲基营养型芽孢杆菌植物亚种是目前国内外公认的无毒安全的植物促生土壤细菌，也是目前我国使用量最为广泛的微生物肥料菌种来源之一。
所以，亟需一种增效作用明显的甲基营养型芽孢杆菌粉状生物菌剂。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种用于促进黄瓜生长的甲基营养型芽孢杆菌粉状菌剂及其制备方法和应用，其主要目的是获得一种对黄瓜生长增效作用明显的菌剂。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于促进黄瓜生长的甲基营养型芽孢杆菌菌剂，所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂由质量比为1:3～4:0.8～1:0.1的甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和亚甲基二萘磺酸钠(NNO)组成。
进一步，优选的，所述甲基营养型芽孢杆菌为甲基营养型芽孢杆菌N5菌株。
本发明还保护一种所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备方法，将甲基营养型芽孢杆菌N5菌株接种在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；将活化后的菌落，接种至250mL pH＝7的NB液体培养基，置于28℃、120r/min振荡培养24h，获得种子液；将5mL种子液接种至液体发酵培养基中，置于28℃、120r/min振荡培养48h后收集菌体，将菌体重悬浮于无菌双蒸馏水中，用无菌双蒸馏水调整菌悬液浓度为6.5×1010cfu/mL，进行喷雾干燥，即制得甲基营养型芽孢杆菌株原粉；
将所述甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和NNO按照质量比为1:3～4:0.8～1:0.1混合，形成甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
进一步，优选的，所述液体发酵培养基的成分包括：玉米粉2％、酵母膏0.5％、麸皮5％、黄豆粕0.7％和MnSO40.1％，以重量百分比计。
进一步，优选的，所述液体发酵培养基的pH为8.0。
进一步，优选的，所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂经气流粉碎机粉碎至细度80目筛通过率为98％。
本发明还保护甲基营养型芽孢杆菌菌剂在黄瓜种植中作为生长增效剂的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明所提供的甲基营养型芽孢杆菌菌剂，甲基营养型芽孢杆菌菌剂的发酵产物有产铁载体和吲哚乙酸等促生物质，因此二次发酵生产的发酵产物对黄瓜生长有较好的促生作用，能促进黄瓜植株和根系的生长，增强根系活力。
以载体硅藻土、粘结剂羟甲基纤维素钠和分散剂NNO为保护剂制备的干粉状的甲基营养型芽孢杆菌菌剂对黄瓜的促生效果明显。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商，均可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
在现有技术中，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)是一类广泛存在于土壤当中的好氧性细菌。它最先发现于水稻根系的土壤中。近期的研究表明，甲基营养型芽孢杆菌是甲基营养型芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum)的同义词。根据目前的研究，许多甲基营养性细菌不仅可以促进土壤矿物及有机物的分解，为植物提供营养；同时还可以分泌IAA，Butanidiol等植物激素以及小分子气调物质；此外，甲基营养性细菌还可以诱导植物提高自身抗病害能力(ISR)，并可以通过合成脂肽类，细菌素，抗菌蛋白等抑菌物质，以及形成生物菌膜(Biofilm)等物理屏障，而直接帮助植物抵御病原微生物。总的来讲，甲基营养型芽孢杆菌(甲基营养型芽孢杆菌植物亚种)是目前国内外公认的无毒安全的植物促生土壤细菌，也是目前我国使用量最为广泛的微生物肥料菌种来源之一。甲基营养型芽孢杆菌不仅能够促进植物生长，还可以帮助植物抵御病害，因此，制备具有高效植物促生抗病活性的甲基营养型芽孢杆菌菌剂，对于减少我国化学肥料，化学农药的使用量，提升我国土壤质量，促进我国农林业的可持续发展来讲，具有十分重要的意义。
微生物制剂中的助剂可能对制剂的理化性质以及微生物本身活性有较大影响，因此必须考虑助剂与活体微生物两者的相容性。本发明公开了当粘结剂、分散剂、载体分别为羟甲基纤维素钠、NNO(亚甲基二萘磺酸钠)、硅藻土时，对黄瓜的促生效果最好。
而甲基营养型芽孢杆菌N5菌株、羟甲基纤维素钠、NNO、凹凸棒土和硅藻土均为市购。
制备例1
LB固体培养基：胰蛋白胨10g、琼脂粉15g～20g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.4；
NB液体培养基：葡萄糖10g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、Na Cl 15g、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。
将甲基营养型芽孢杆菌N5菌株接种在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；将活化后的菌落，接种至250mL pH＝7的NB液体培养基，置于28℃、120r/min振荡培养24h，获得种子液；将5mL种子液接种至液体发酵培养基中，置于28℃、120r/min振荡培养48h后收集菌体，将菌体重悬浮于无菌双蒸馏水中，用无菌双蒸馏水调整菌悬液浓度为6.5×1010cfu/mL，进行喷雾干燥，即制得甲基营养型芽孢杆菌株原粉；其中，所述液体发酵培养基的成分包括：玉米粉2％、酵母膏0.5％、麸皮5％、黄豆粕0.7％、MnSO40.1％以及无菌双蒸馏水，所述发酵培养基的pH为8.0，以重量百分比计。
将所述甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和NNO按照质量比为1:3:0.8:0.1混合，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂一，所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂一经气流粉碎机粉碎至细度80目筛通过率为98％。
制备例2
将甲基营养型芽孢杆菌N5菌株接种在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；将活化后的菌落，接种至250mL pH＝7的NB液体培养基，置于28℃、120r/min振荡培养24h，获得种子液；将5mL种子液接种至液体发酵培养基中，置于28℃、120r/min振荡培养48h后收集菌体，将菌体重悬浮于无菌双蒸馏水中，用无菌双蒸馏水调整菌悬液浓度为6.5×1010cfu/mL，进行喷雾干燥，即制得甲基营养型芽孢杆菌株原粉；其中，所述液体发酵培养基的成分包括：玉米粉2％、酵母膏0.5％、麸皮5％、黄豆粕0.7％、MnSO40.1％以及无菌双蒸馏水，所述发酵培养基的pH为8.0，以重量百分比计。
将所述甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和NNO按照质量比为1:4:1:0.1混合，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂二，所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂二经气流粉碎机粉碎至细度80目筛通过率为98％。
制备例3
将甲基营养型芽孢杆菌N5菌株接种在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；将活化后的菌落，接种至250mL pH＝7的NB液体培养基，置于28℃、120r/min振荡培养24h，获得种子液；将5mL种子液接种至液体发酵培养基中，置于28℃、120r/min振荡培养48h后收集菌体，将菌体重悬浮于无菌双蒸馏水中，用无菌双蒸馏水调整菌悬液浓度为6.5×1010cfu/mL，进行喷雾干燥，即制得甲基营养型芽孢杆菌株原粉；其中，所述液体发酵培养基的成分包括：玉米粉2％、酵母膏0.5％、麸皮5％、黄豆粕0.7％、MnSO40.1％以及无菌双蒸馏水，所述发酵培养基的pH为8.0，以重量百分比计。
将所述甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和NNO按照质量比为1:3:1:0.1混合，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂三，所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂三经气流粉碎机粉碎至细度80目筛通过率为98％。
比较制备例1
将甲基营养型芽孢杆菌N5菌株接种在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；将活化后的菌落，接种至250mL＝7的NB液体培养基，置于28℃、120r/min振荡培养24h，获得种子液；将5mL种子液接种至液体发酵培养基中，置于28℃、120r/min振荡培养48h后收集菌体，将菌体重悬浮于无菌双蒸馏水中，用无菌双蒸馏水调整菌悬液浓度为6.5×1010cfu/mL，进行喷雾干燥，即制得甲基营养型芽孢杆菌株原粉，其中，所述液体发酵培养基的成分包括：玉米粉2％、酵母膏0.5％、麸皮5％、黄豆粕0.7％、MnSO40.1％以及无菌双蒸馏水，所述发酵培养基的pH为8.0，以重量百分比计。
甲基营养型芽孢杆菌株原粉与凹凸棒土按照质量比为1:4混合，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂四。所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂四经气流粉碎机粉碎至细度80目筛通过率为98％。
本发明的实施例是采用室内活菌数测定和田间试验相结合的方法。
试验性实施例1
在等量的甲基营养型芽孢杆菌株原粉的条件下，取样涂布技术进行有效活菌数统计。
将上述4种干粉状菌剂甲基营养型芽孢杆菌菌剂一、甲基营养型芽孢杆菌菌剂二、甲基营养型芽孢杆菌菌剂三和甲基营养型芽孢杆菌菌剂四放置在阴凉处室温保存，一周后取1g菌剂加入到装有玻璃珠的摇床2小时后，进行梯度稀释涂布，测定菌剂中释放的活菌数，计算释放率，每组3次重复，取平均值。
其中，释放率(％)＝释放细菌数(cfu)/接种细菌数(cfu)×100％。
结果见表1
表1不同菌剂的活菌释放率情况
通过表1可见，甲基营养型芽孢杆菌菌剂一、甲基营养型芽孢杆菌菌剂二、甲基营养型芽孢杆菌菌剂三的活菌数以及释放率均显著高于甲基营养型芽孢杆菌菌剂四。说明以载体硅藻土、粘结剂羟甲基纤维素钠和分散剂NNO为保护剂制备的干粉状的甲基营养型芽孢杆菌菌剂比单纯结合载体凹凸棒土的甲基营养型芽孢杆菌菌剂的活菌数高。
试验性实施例2
实验地点选在大理市上关镇河尾村于2019年3月6日-2019年7月17日进行，供试品种为大棚春黄瓜，津春4号。
选取试验田5块A1-A5，试验设计5个处理，3次重复，共计15个试验小区，小区面积40平方米，各小区随机排列，设保护行。
处理1：常规施肥+叶面喷施甲基营养型芽孢杆菌菌剂一(50g/亩)；
处理2：常规施肥+叶面喷施甲基营养型芽孢杆菌菌剂二(50g/亩)；
处理3：常规施肥+叶面喷施甲基营养型芽孢杆菌菌剂三(50g/亩)；
处理4：常规施肥+叶面喷施甲基营养型芽孢杆菌菌剂四(50g/亩)；
处理5：常规施肥。
菌剂灭活方法：灭活处理采用强放射性辐照如放射性同位素60Co灭菌。经灭菌后的样品要进行灭活检验，检验不合格的重新灭活，直至检验合格。
施肥方法
①常规施肥：底肥为腐熟的厩肥3000kg/亩、45％(15-15-15)复混肥70kg/亩；追肥三次，每次冲施45％(20-15-10)复混肥40kg/亩。
②叶面喷施高含量微生物菌剂：移栽时叶面喷施高含量微生物菌剂。
5块实验田中；其中A1地块进行处理1，使用甲基营养型芽孢杆菌菌剂一；A2地块进行处理2，使用甲基营养型芽孢杆菌菌剂二；A3地块进行处理3，使用甲基营养型芽孢杆菌菌剂三；A4地块进行处理4，使用甲基营养型芽孢杆菌菌剂四；A5地块不使用微生物菌剂。
该地域土壤类型属于壤质潮褐土，地势平坦、整齐，排灌条件较好，肥力中等、均匀，前茬作物未做肥料试验，土壤养分状况见表2。
表2土壤养分状况表
试验采用直播法播种，3月6日播种，播种前将种子进行催芽，试验地在深翻、施入基肥后耙平，再按60cm的行距开3cm深，6cm宽的小沟后把已发芽的种子点播，每10cm点一粒种子，播后覆土1.5cm。4月20号开始采收，7月17日采收结束。
肥效调查：
生物量调查：在始花期每小区选取10株代表性植株分别测量其株高和茎粗。
自收获之日起，田间采收后每小区随机称取100个新鲜果实称重，记录单果重，计算平均值。
自采摘之日起，各小区单独采收，累计记产，累计总和即为小区产量。
试验地田间浇水、施肥等管理措施保持一致，试验记录期间天气良好，无明显气候影响因素。
结果与分析
不同处理对黄瓜生物学性状的影响
不同施肥处理对黄瓜生物学性状的影响如表3所示。
表3不同施肥处理对黄瓜生物学性状的影响
注：不同字母代表同一时期不同处理间差异达5％显著水平，下同。
由表3可知，处理1-4的株高、基部茎粗及单果重均显著高于处理5组，其株高比处理5组提高21.12cm，相对提高10.48％；基部茎粗比处理5组提高0.23cm，相对提高35.23％；单果重平均增加22.53g，相对提高13.67％。说明甲基营养型芽孢杆菌菌剂对黄瓜的具有促生效果。
进一步的，处理1-3的株高基部茎粗及单果重均高于处理4。说明以载体硅藻土、粘结剂羟甲基纤维素钠和分散剂NNO为保护剂制备的干粉状的甲基营养型芽孢杆菌菌剂对黄瓜的促生效果明显。
不同施肥处理对黄瓜产量的影响
不同施肥处理对黄瓜产量的影响如表4所示。
表4不同施肥处理对黄瓜产量的影响
自采摘之日起，各小区累计记产，结果如表4所示。由表3可知，叶面喷施基营养型芽孢杆菌菌剂能显著提高黄瓜产量。处理1-4与处理5相比产量均获得较大提升，而处理1-3与处理4相比，处理1-3的产量提升尤其显著，说明以载体硅藻土、粘结剂羟甲基纤维素钠和分散剂NNO为保护剂制备的干粉状的甲基营养型芽孢杆菌菌剂对黄瓜的促生效果明显。
综上，本发明的甲基营养型芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用，对黄瓜的促生效果明显。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式以及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂，其特征在于，
所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂由质量比为1:3～4:0.8～1:0.1的甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和亚甲基二萘磺酸钠组成。
2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌为甲基营养型芽孢杆菌N5菌株。
3.一种根据权利要求2所述的甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，
将甲基营养型芽孢杆菌N5菌株接种在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；将活化后的菌落，接种至250mL pH＝7的NB液体培养基，置于28℃、120r/min振荡培养24h，获得种子液；将5mL种子液接种至液体发酵培养基中，置于28℃、120r/min振荡培养48h后收集菌体，将菌体重悬浮于无菌双蒸馏水中，用无菌双蒸馏水调整菌悬液浓度为6.5×1010cfu/mL，进行喷雾干燥，即制得甲基营养型芽孢杆菌株原粉；
将所述甲基营养型芽孢杆菌菌株原粉、硅藻土、羟甲基纤维素钠和亚甲基二萘二磺酸钠按照质量比为1:3～4:0.8～1:0.1混合，形成甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
4.根据权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的成分包括：玉米粉2wt％、酵母膏0.5wt％、麸皮5wt％、黄豆粕0.7wt％和MnSO40.1wt％。
5.按照权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的pH为8.0。
6.按照权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂经气流粉碎机粉碎至细度80目筛通过率为98％。
7.根据权利要求1或2所述的甲基营养型芽孢杆菌菌剂在黄瓜种植中作为生长增效剂的应用。
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