CN106754489A - 甲基营养型芽孢杆菌f7及其应用 - Google Patents

甲基营养型芽孢杆菌f7及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌F7及其应用，旨在提供一种具有产铁载体、纤维素酶、蛋白酶、产生长素和产氨等多种有益特性的菌株，该菌株既可有效抑制青枯雷尔氏菌、尖孢镰刀菌古巴转化型、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌黄瓜专化型等多种病原菌，又能促进植物生长；其技术方案，该甲基营养型芽孢杆菌F7于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12124；并且，从所述甲基营养型芽孢杆菌F7发酵液中提取出具有抗菌功效的5种表面活性素同系物，6种丰原素同系物和3种伊枯草素同系物；属于农业生物技术领域。

Description

甲基营养型芽孢杆菌F7及其应用
技术领域
本发明涉及植物土传病害生物防治领域，是一种微生物及其应用，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌F7(Bacillus methylotrophicus)及应用。
背景技术
番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染番茄组织后引起的一种土传细菌性萎蔫病，在世界范围内严重威胁着番茄的产量和品质。长期以来，化学农药作为防治番茄青枯病的主要手段，存在着药剂品种少、防治效果不理想等诸多弊端，同时也导致了生态环境破坏，食品污染，人、畜中毒等一系列问题。而由于新型高效杀菌剂开发难度大、抗性品种培育周期长，因此近年来，对环境安全的生物防治技术逐渐成为新的研究热点。寻找高效的拮抗微生物对番茄青枯病的生物防治具有重要意义。
甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus，Bme)是一种能利用甲醇、三乙胺和乙醇的革兰氏阳性菌。Madhaiyan等于2010年从水稻根际土中首次分离和报道BmeCBMB205T。随后许多研究者报道Bme在土传病害生防中显示了巨大的潜力。周登博等筛选的甲基营养型芽孢杆菌4-L-16，对尖孢镰刀菌的抑菌直径高达12mm，抑制荔枝炭疽菌直径达8mm以上。孙正祥等从油菜根际分离的菌株XK-4能有效抑制油菜菌核病菌菌丝，造成菌丝溶解。赵月菊等报道的JS20GA菌剂能够有效防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。杨利民等从人参根际分离得到两个菌株SZ-3和SZ-81，能够显著降低人参真菌性病害的发病率。林克明等利用筛选的菌株防治辣椒青枯病和柑橘炭疽病，均具有良好的防治效果。夏艳等从烟草青枯病田中分离出菌株H34，具有产铁载体和IAA的能力，防病效果显著，并对烟草表现出较好的促生效果。王洪梅等在番茄盆栽中单独使用N5菌株生物有机肥，防治效果只有24.7％。然而，甲基营养型芽孢杆菌防治番茄青枯病的研究尚未报道。
已报道的研究表明，拮抗菌在代谢过程中能分泌多种抗菌化合物，包括表面活性素(surfactin)、伊枯草素类(iturin)、丰原素(fengycin)以及细菌素(subtilisin qk)和其它抗菌活性蛋白(Yndj)等。Joshi R等从芽孢杆菌发酵产物中检测到多种抗菌活性物质。Ongena M等研究发现这类物质具有抑制病原菌的作用，能够能提高菌株在植株根际的持久定殖，并刺激宿主产生防御机制。王洪梅等利用LC-ESI-MS对N5发酵液中的抗菌物质进行了测定。在此基础上，本发明采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)方法，首次研究了甲基营养型芽孢杆菌F7发酵物中脂肽类抗菌化合物种类。在平板拮抗实验中研究了脂肽类抗菌化合物合成基因表达的制备方法。
许多菌株往往在平板实验中表现出拮抗活性，但在盆栽与大田阶段却很难有理想效果。因此，为研究该生防菌株在植株根际土壤定殖能力，本发明在分子生物学水平，利用Real-Time PCR技术，定量测定了菌株F7在植物根际土壤中的DNA拷贝数，首次研究了甲基营养型芽孢杆菌抗菌物质合成基因srfAB、fenD和ituC等在土壤中的DNA拷贝数，探讨F7菌株在田间的生防潜力。
发明内容
本发明的第一目的在于根据现有技术中上述问题，提供一种新型的兼具防病和促生功能的甲基营养型芽孢杆菌F7菌株。
本发明的第二个目的在于提供上述甲基营养型芽孢杆菌F7的发酵液提取物及其提取方法；
本发明的第三个目的在于提供上述甲基营养型芽孢杆菌F7制备的生物抗菌剂。
本发明的第四个目的是在于提供甲基营养型芽孢杆菌F7及其发酵液提取物和生物菌剂的应用。
本发明的上述第一个目的通过以下技术方案实现：
一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)F7，简称F7菌。该菌株于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.12124，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
该F7菌是在广州华南农业大学番茄种植田中分离纯化所得，属革兰氏阳性菌，有芽孢，杆状，好氧，有运动性；在LB固体培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，表面皱褶湿润。该菌株对细菌和真菌病原菌均较强的抑制能力，对番茄青枯病有显著的防治效果，经过生理生化和分子鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二个目的通过下述技术方案实现：
挑取F7单菌落，采用LB液体培养，在30℃、转速150r/min摇床培养48h，吸取5mL发酵液用无菌离心管在14000r/min下离心3min，吸取上清液，重复该步骤得到无细胞上清液，用6mol/L盐酸沉淀去菌体培养基，加入甲醇后用索氏抽提器抽提，将抽提液蒸干后用0.02mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液溶解，冷冻干燥后得粗提物。加入活化的C18萃取柱中，用5mL超纯水洗2-3遍，再分别用1mL的80％的甲醇溶液萃取，过0.22μm的滤膜除菌，既得抑菌活性物质的甲醇萃取液。然后用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)方法，反相超高效液相色谱(waters,Xevo G2-XS QTof四极杆串联飞行时间质谱仪)结合单四极杆质谱(ESI)系统，用T3柱子(C18,2.1×100mm,1.8μm)分离和SQ质谱检测器。采用表面活性素、伊枯菌素和丰宁素标样(sigma),首次鉴定了甲基营养型芽孢杆菌F7甲醇提取物中脂肽类抗菌物质种类，包括5种表面活性素(surfactin)同系物(C12-C16)，6种丰原素(fengycin)同系物(C12-C17)和3种伊枯草素类(iturin)(C14-C16)。
本发明的第三个目的通过下述技术方案实现：
一种含上述的甲基营养型芽孢杆菌F7发酵液的生物菌剂，所述的甲基营养型芽孢杆菌F7数量为1.0×108～9.0×109cfu/ml。
该菌剂制备方法为：挑取-80℃甘油冻干管F7菌株划线在LB培养基上，37℃过夜培养。挑取单菌落至LB液体培养基，150rpm,37℃摇床培养14h,3得到种子液；按1％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇床培养2～4d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。
本发明的第四个目的通过下述技术方案实现：
F7菌株甲醇提取液具有抑制青枯假单胞菌和镰刀菌的作用。具体如下：采用双层平板打孔法(disc diffusion assay),取青枯菌(OD600＝0.4)LB培养液200μL或者镰刀菌PDF孢子培养液200μl，分别与4ml 0.7％琼脂的LB培养基混合，然后倒入15ml 1.5％琼脂的LB平板，待凝固后，在平板中间打孔(直径5mm)。在孔中加入F7菌株甲醇提取液30μl，于30℃下培养48h后，测量抑菌圈直径。结果表明，F7菌株甲醇提取液对青枯菌显著抑菌作用，其抑菌圈直径为17mm。F7菌株甲醇提取液对镰刀菌的抑菌圈为15mm。
表面活性素、伊枯菌素和丰宁素抑制青枯菌的作用。采用bioscreen培养方法，分别配制含不同浓度梯度(500,200,100,50,25,0μg/ml.)表面活性素、伊枯菌素和丰宁素(sigma)的CPG液体培养基200μl于培养板中，加入2μl青枯菌CPG预培养液(OD＝0.4)，于30℃间歇振动培养18h。每15分钟测定OD600。在18小时内，OD600<0.01的浓度为该化合物抑制青枯菌的最小抑制浓度(MIC)。表面活性素、伊枯菌素和丰宁素抑制青枯菌的最小抑制浓度(MIC)为(500,100,100μg/ml)。首次确实了表面活性素、伊枯菌素和丰宁素对青枯菌的抑制作用和最小抑制浓度。
甲基营养型芽孢杆菌F7具有产铁载体、蛋白酶、过氧化氢酶、纤维素酶以及IAA等多种有益特性，具体方案如下，将F7菌株点样在蔗糖-天冬酰胺(MSA)培养基上，观察F7菌落外围出现明显的黄色晕圈，说明F7菌株产铁载体。将F7菌点接到羧甲基纤维素(CMC)平板上，30℃培养2d，刚果红染色，结果表明菌落周围出现透明圈，说明F7菌株能够产纤维素酶。将F7菌接种于含L-色氨酸的LB液体培养基中，摇床培养1d，将菌悬液在8000rpm下离心10min，取4mL上清液加入4mL S2比色液，混匀，黑暗中静置30min，在530nm下测吸光度，结果显示F7菌产IAA。
采用双层平板扩散法和平板对峙拮抗法，表明甲基营养型芽孢杆菌F7、甲醇萃取液或者生物菌剂对病原菌具有广谱的抑制作用。所述的植物真菌病原菌为香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌和黄瓜枯萎病原菌。采用盆栽植株试验方法，表明甲基营养型芽孢杆菌F7及其生物菌剂对番茄青枯病具有显著的防治效果。这些结果表明F7菌株在防治番茄青枯病具有重要的应用意义。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的甲基营养型芽孢杆菌F7，具备产铁载体、产纤维素酶、产蛋白酶多种特性，分泌胞外脂肽抗菌化合物表面活性素，伊枯菌素和丰宁素，这些脂肽抗菌化合物对多种土传病原真菌和细菌有显著的拮抗效果，对番茄青枯病有显著的生防效果。另外，本发明还对F7中的防病功能基因采用荧光定量RT-PCR制备方法，确实了在平板培养条件下青枯假单胞菌促进了F7菌剂中抗菌活性物质合成基因srfAB、ituC和fenD表达，在土壤原位条件下番茄植株根际fenD基因拷贝数显著增加，佐证了该生防菌株能在土壤中产生有效的生防作用，有效防治番茄青枯病。具体表现如下：
(1)本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌F7，对番茄青枯病具有高效生物防治能力，对番茄青枯病的生物防治效率达46％。
(2)该菌株对香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌和黄瓜枯萎病原菌等多种真菌病原菌具有广谱抑菌能力。
(3)与前人相关菌株报道相比较，F7菌株脂肽类抗菌物质同系物种类最多，包括5种表面活性素同系物(C12-C16)，6种丰原素(fengycin)同系物(C12-C17)和3种伊枯草素(iturin)同系物(C14-C16)。
(4)表面活性素、伊枯菌素和丰宁素对青枯菌有显著的抑制作用，该发明首次报道表面活性素对青枯菌的抑制作用。其表面活性素最小抑制青枯菌浓度(MIC)为500μg/ml。
(5)青枯菌刺激F7菌株相关抗菌化合物合成基因高效表达，提高了土壤中抗菌合成基因数量，从而显示了较大的田间生防潜力。
(6)本发明将为作物土传病害微生态防治提供一种高效新型的甲基营养型芽孢杆菌株资源。
附图说明：
图1.F7菌革芽孢染色显微照片；
图2.F7菌游泳swim(A)和蠕动swarm(B)的照片
图3.F7菌系统发育树图；
图4.F7菌产铁载体照片；
图5.F7菌产纤维素酶照片；
图6.F7菌为产蛋白酶照片；
图7.F7菌(A)及其甲醇提取物(B)对青枯假单胞菌的拮抗效果图；
图8.F7菌对真菌病原菌的拮抗效果图；
a：尖孢镰刀菌；b：胶孢炭疽菌；c：尖孢镰刀菌黄瓜专化型。
图9 F7菌甲醇提取物对镰刀菌的拮抗效果图；
图10.F7菌的脂肽类表面活性素、伊枯菌素和丰宁素质谱图；
图11.F7菌防治番茄青枯病的盆栽试验照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权力要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
实施例1 菌株的筛选、纯化
(1)初筛
牛肉膏蛋白胨培养基：细菌学蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH调为7.0～7.2。
采用青枯假单胞菌(Ralstonia Solanacearum)作为病原指示菌用来筛选拮抗菌株。将青枯假单胞菌在TTC平板上划线，在30℃恒温培养箱中培养48h后观察，挑取致病性强的菌株培养待用。取30℃恒温培养24h的青枯假单胞菌培养液，用移液器吸取200μL菌液分别放入无菌平板中，向盛有菌液的平板中倒入灭菌后冷却至45℃左右的NA培养基约20mL/平板，置水平位置迅速旋动平板，使培养基与菌液混合均匀，待培养基凝固后，自然晾干，制成含青枯假单胞菌的平板备用。
以广州华南农业大学农场番茄种植基地的赤红壤为筛选土样，称取10g放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使细菌充分分散，静置20～30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用103～105稀释度，用移液枪分别移取稀释液0.l mL，涂布在含菌平板上，上述接种培养基于30℃恒温培养箱中培养，48h后，观察有无抑菌圈，将有拮抗效果的菌株接种试管斜面，4℃保存待用。
(2)复筛
试验操作步骤为：在无菌平板中倒入灭菌后冷却至45℃左右的素琼脂10m L作底层，待平板凝固后，用移液器吸取200μL恒温培养24h的青枯假单胞菌培养液于底层平板，再将灭菌后冷却至45℃左右的NA培养基10m L迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后用无菌打孔器在含青枯假单胞菌平板上打孔，每孔中分别注入不同分离菌株的培养液50μL。于30℃恒温培养箱中培养。记录拮抗圈直径(D)。筛选出有拮抗圈的细菌菌株，其中F7的拮抗效果显著，抑菌圈直径为21.3mm。
(3)纯化
将初步筛选出的拮抗菌在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化后，挑单菌落于LB液体培养基中过夜培养，菌液保存在-80℃的75％甘油管中。
实施例2 特性鉴定
(1)菌体形态特性，革兰氏阳性菌，有芽孢。菌体为杆状，有运动性，好氧。菌体芽孢染色照片见图1。
(2)菌落形态特性，在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形，乳白色，直径约为1～2mm，边缘不整齐，湿润。F7菌具有游泳和蠕动性质，在含琼脂0.3％的LB培养基上过夜培养后扩散到整个平板,说明F7菌具有游泳性(swim)，在含琼脂0.7％的LB培养基过夜培养具有一定的蠕动性(swam),参阅图2。
(3)生长特性，在酵母提取粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000mL的液体培养基中，转速180rpm，温度30℃，起始pH值为7.0的条件下，培养18h，测得活菌数为(3.83±0.60)×108cfu/ml。
(4)生理、生化特性，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》的常规实验方法，对此菌株进行一些生理生化试验，实验结果见表1。
表1 菌株F7生理生化试验
试验名称 结果 试验名称 结果
蛋白酶 + 解淀粉酶 +
铁载体试验 + 甲基红试验 +
纤维素降解 + 产氨试验 +
产生物膜 - 过氧化氢酶 +
产IAA试验 + 明胶液化试验 －
注：+表示为阳性；－表示为阴性
(5)分子生物学特性
采用试剂盒法提取F7菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,SEQ ID NO:2)和1492R(ACGGCTACCTTGTTACGACTT,SEQ ID NO:3)，PCR扩增细菌的16S rRNA，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的长度和浓度，在1400bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入美国国立生物信息中心NCBI，对GenBank数据库中的所有序列进行Blast比较分析，结果发现本发明所述菌株的16S rRNA序列(SEQ ID NO:1)与GenBank中甲基营养型芽孢杆菌模式菌株Bacillus methylotrophicus CBMB205具有较高的同源性，其相似度为99％。结合上述的平板菌落特征、生理生化特性、16S rRNA序列建系统发育树的结果，初步鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，命名为Bacillus methylotrophicus F7系统发育树见图3。
实施例3 F7菌产铁载体实验
将菌株转接到LB平板上培养24-48h后,采用点接种法，用灭菌的牙签将菌种接在CAS固体检测平板上，点3个重复，28℃培养3d，经过培养的CAS检测平板上，由于嗜铁素竞争培养基中的EDTA螯合的铁离子，使培养基由蓝色变为黄色，由此判断是否产铁载体。试验结果如图4所示，该菌株的周围出现明显的黄色晕圈，说明该菌株产铁载体。
实施例4 F7菌产纤维素酶实验
将F7菌从斜面上点接到CMC平板上，30℃培养2d，用千分之一的刚果红溶液(1g/L)染色30min，再用1mol/L的氯化钠溶液固定30min，最后用流动的水冲洗，根据菌落周围是否出现透明圈来判断菌株产纤维素酶的能力，结果如图5所示，菌落周围出现透明圈，说明该菌株能够产纤维素酶。羧甲基纤维素(CMC)培养基配方(g/L)：羧甲基纤维素钠20g，磷酸氢二钠1.5g，磷酸二氢钠2.5g，琼脂20g，水1000ml，PH：7.0-7.2。
实施例5 F7菌产蛋白酶实验
将菌株接种到蛋白酶检测培养基上，30℃培养2d，观察菌落周围的透明圈大小来判断菌株的蛋白质水解能力，结果如图6所示，与对照相比，菌株平板上的蛋白质几乎都被利用完全，说明该菌株利用蛋白质的能力很强。蛋白酶检测培养基(g/L)：蛋白胨10g，氯化钠5g，氯化钙0.1g，脱脂奶粉10g，琼脂18g，115℃灭菌30min，pH 7.2-7.4。
实施例6 含甲基营养型芽孢杆菌F7发酵液菌剂的制备
该菌剂制备方法为：在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培养，培养温度28～30℃，培养8-12h；从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30℃摇床培养1d，转速150r/min，得到种子液；按5％-10％接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30℃摇床培养24-48h，转速200r/min，即得到甲基营养型芽孢杆菌F7的发酵液，有效活菌数为1×108-1×109cfu/ml。
其中：种子培养时所用的培养基成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15～20g/L，pH 6.8～7.2；发酵培养时所用的培养基成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0～7.2。
实施例7 F7菌剂对青枯假单胞菌的拮抗效果
试验操作步骤为:在无菌平板中倒入灭菌后冷却至45℃左右的素琼脂10m L作底层，待平板凝固后，用移液器吸取200μL恒温培养24h的青枯假单胞菌培养液于底层平板，再将灭菌后冷却至45℃左右的NA培养基10m L迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后用用直径为5mm的灭菌打孔器在含菌平板中央打孔，用灭菌的牙签把菌饼移除。用移液枪吸取20μL的F7菌剂于含菌平板中央的孔中，30℃培养2～3d，观察孔的周围有无抑菌圈，测量抑菌圈半径。结果表明(图7A)：F7菌拮抗番茄青枯假单胞菌效果显著，抑菌圈直径为21.3mm。
实施例8 F7菌株对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense的拮抗效果
将在PDA培养基上活化尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense病原菌，培养3d，用无菌打孔器取菌饼用无菌牙签移至PDA平板中央，然后用接种环于病原菌菌饼十字交叉接种供试F7菌株，30℃培养，5d后观察抑菌圈。以不接种供试细菌的平板作CK对照，实验重复三次。测量其抑菌带达38mm。结果见图8a。PDA培养基：取去皮的马铃薯200.0g，切成小块。加水煮沸30min，滤去马铃薯块将滤液加水补足至1000mL，加葡萄糖20.0g，琼脂粉18g，熔化后分装，121℃灭菌20min。
实施例9 F7菌株对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides).Colletotrichum gloeosporioides的拮抗效果
参照实施例9，将在PDA培养基上活化胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides).Colletotrichum gloeosporioides病原菌，培养3d，用无菌打孔器取菌饼用无菌牙签移至PDA平板中央，然后用接种环于病原菌菌饼十字交叉接种供试F7菌株，30℃培养，5d后观察抑菌圈。以不接种供试细菌的平板作CK对照，实验重复三次。测量其抑菌带达45mm。结果见图8b。
实施例10 F7菌株对尖孢镰刀菌黄瓜专化型F.oxysporum f.sp.cucumerinum的拮抗效果
参照实施例9，将在PDA培养基上活化尖孢镰刀菌黄瓜专化型F.oxysporumf.sp.cucumerinum病原菌，培养3d，用无菌打孔器取菌饼用无菌牙签移至PDA平板中央，然后用接种环于病原菌菌饼十字交叉接种供试F7菌株，30℃培养，5d后观察抑菌圈。以不接种供试细菌的平板作CK对照，实验重复三次。测量其抑菌带达35mm。结果见图8c。
实施例11 F7菌发酵液甲醇萃取物中抗菌脂肽类化合物的鉴定
挑取F7单菌落，采用LB液体培养，在30℃、转速150r/min摇床培养48h，吸取5mL发酵液用无菌离心管在14000r/min下离心3min，吸取上清液，重复该步骤得到无细胞上清液，用6mol/L盐酸沉淀去菌体培养基，加入甲醇后用索氏抽提器抽提，将抽提液蒸干后用0.02mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液溶解，冷冻干燥后得粗提物。加入活化的C18萃取柱中，用5mL超纯水洗2-3遍，再分别用1mL的80％的甲醇溶液萃取，过0.22μm的滤膜除菌，既得抑菌活性物质的甲醇萃取液。然后用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)方法，反相超高效液相色谱(waters,Xevo G2-XS QTof四极杆串联飞行时间质谱仪)结合单四极杆质谱(ESI)系统，用T3柱子(C18,2.1×100mm,1.8μm)分离和SQ质谱检测器。采用表面活性素、伊枯菌素和丰宁素标样(sigma),依据脂肽物质标准物质(sigma)表面活性素、伊枯菌素和丰宁素同系物的相应质谱峰，鉴定了甲基营养型芽孢杆菌F7甲醇提取物中脂肽类抗菌物质种类，包括5种表面活性素(surfactin)同系物(C12-C16，其质谱峰m/z[M+H]为994,1008,1022 1037和1050)，6种丰原素(fengycin)同系物(C12-C17，其m/z[M+H]为1435.9,1449.9,1464.0,1478.0,1492.0和1506.0)和3种伊枯草素类(iturin)(C14-C16，其m/z[M+H]为1043.7,1057.6和1071.7)。结果如图10
实施例12 F7菌发酵液甲醇萃取物拮抗青枯假单胞菌和镰刀菌的效果
采用双层平板打孔法(disc diffusion assay),取青枯菌(OD600＝0.4)LB培养液200μL或者镰刀菌PDF孢子培养液200μl，分别与4ml 0.7％琼脂的LB培养基混合，然后倒入15ml 1.5％琼脂的LB平板，待凝固后，在平板中间打孔(直径5mm)。在孔中加入F7菌株甲醇提取液30μl，于30℃下培养48h后，测量抑菌圈直径。结果表明，F7菌株甲醇提取液对青枯菌显著抑菌作用，其抑菌圈直径为17mm(图7B)。F7菌株甲醇提取液对镰刀菌的抑菌圈为15mm。如图9。
实施例13 脂肽类化合物对青枯假单胞菌的抑制实验
采用bioscreen全自动细菌培养系统，分别配制含不同浓度梯度(500,200,100,50,25,0μg/ml.)表面活性素、伊枯菌素和丰宁素标样(sigma)的CPG液体培养基200μl于100孔培养板中，加入2μl青枯菌CPG预培养液(OD＝0.4)，于30℃间歇振动培养18h。每15分钟测定OD600。培养18小时后，培养液中OD600<0.01时为该化合物抑制青枯菌的最小抑制浓度(MIC)。结果表明，培养液中表面活性素为500,μg/ml，伊枯菌素100μg/ml或者丰宁素100μg/ml时，青枯菌在18小时培养后，仍旧没有生长，OD<0.01。因此确定拮抗青枯菌的最小抑制浓度(MIC)分别为表面活性素为500μg/ml，伊枯菌素100μg/ml或者丰宁素100μg/ml。
实施例14 青枯菌促进抗菌化合物合成基因高效表达的制备实验。
取青枯菌(OD600＝0.4)LB培养液200μL与4ml 0.7％琼脂的LB培养基混合，然后倒入15ml 1.5％琼脂的LB平板，加入5μl F7菌株LB预培养液(OD＝0.4)，于30℃下培养40h后，取F7菌落于离心管中，用PBS缓冲液洗涤2次，离心收集细胞于-80℃备用，用未接种青枯菌的F7培养平板为空白对照，用23S rRNA为内参，采用定量PCR方法测定srfAA,srfAB,ituCand fenD相对表达量2-△△Ct method。结果表明(表2)，在青枯菌刺激下，F7菌株的丰宁素合成基因fenD高效表达，其2-△△Ct为5.0。
表2 在平板培养下青枯菌促进F7菌株抗菌基因的相对表达量(fold change)。
实施例15 F7菌防治番茄青枯病盆栽效果试验
盆栽试验：采用F7菌和空白对照进行效果对比试验，番茄种子水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，两天后露出芽播种至苗床中。番茄种子播种10天后破苗，当苗约10cm高，移苗至盆中(直径20厘米)。将植物种植在28/20℃和65％相对湿度下的温室，16/8小时的昼/夜周期。温室条件下测定菌株对青枯病病菌的抑制潜力。共分2个处理组(第1组加入F7菌菌体重悬液70mL，用F7表示，种子细胞悬浮液和幼苗制备如前所述。第2组加入无菌水70mL作为空白对照，用CK表示)，每个重复2盆，每盆4棵苗，每个处理3个重复。各处理组含土1.5kg，尿素136mg，过磷酸钙330mg，氯化钾484mg。每天浇水适量，每盆的水量相同，均匀，注意不要使水流出盆底以免肥料损失而误差。测量番茄株高和复叶片数。温室条件下培养四周，记录病情发生。根据以下分级记录每株植物的疾病症状程度：0＝植物健康无病症状；1＝少数叶片发育不良，无明显萎蔫症状；2＝轻度，少于20％叶片萎蔫；3＝中度萎蔫，20-50％叶片萎蔫；4＝严重，超过50％叶片萎蔫；5＝全株萎蔫，植株死亡。所有的处理完全随机设计。并整个实验进行两次。观察青枯病严重病症苗的比例(疾病的严重程度>1)，评估F7菌株抑制番茄青枯病的能力。植物样品干重通过在80℃下干燥48小时进行测定。最后数据采用SPSS软件进行方差分析。结果表明(表3及图11)：加入F7菌能够有效降低青枯病的发病率及显著促进植物的生长。
表3 F7菌防治番茄青枯病盆栽效果
注：数据为3次重复的平均值±标准误，同列数据不同字母表示在0.05水平差异显著。
实施例15 F7菌促进植物生长田间效果试验
采用F7菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(F7组加入F7菌；CK组加入等量营养液。每个处理组3个小区，每个小区面积2.43×1.4m2，种植密度15×8＝120株苗(除去边际效应保护行，实际株数13×6＝78株)。生菜种子水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，出芽后移栽至苗床中。当苗长出两心一叶时，移入大田，每小区136棵苗。施用复合肥料，移栽前每小区施肥0.25kg。每个小区定量浇水，均匀一致。35日后收苗，并测量生菜株高、叶面积、相对叶绿素含量、根干重、叶干重等。结果表明(表4)：F7菌能够促进生菜的生长。
表4 F7菌对生菜植株的田间促生效果对比表
注：数据为3次重复的平均值±标准误，同列数据不同字母表示在0.05水平差异显著。
实施例16F7菌功能基因在番茄盆栽土壤中表达的检测
1)以分别含有功能基因(yndJ、srfAB、fenD、ituC)的重组质粒载体为模板，测定其DNA浓度并换算成拷贝数log值；用Power soil试剂盒提取番茄盆栽不同处理土壤的总DNA；将供试土壤总DNA和获得的重组质粒DNA为模板，进行RT-PCR分析；
2)其Real-Time PCR扩增体系为10μL：DNA模板0.5μL；上、下引物各0.5μL；SYBRPremix Ex-Taq5μL，水3.5μL。扩增条件为：Cycle1：95℃1min；Cycle2×45：95℃20s，59℃25s；Cycle3：95℃30s，60℃1min，95℃20s。扩增的引物同菌株DNA功能基因普通PCR的引物一致，如表6所示。
番茄盆栽土壤中植株根际甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)F7功能基因表达量的定量检测，数据显示单位为log(copies/100ng total soil DNA)，结果见表5。结果表明施加了F7菌剂处理的番茄盆栽土壤中，功能基因ituC的表达未表现出差异，功能基因yndJ、srfAB、fenD的表达量增加，均显著高于未施菌剂的对照组，可认为该甲基型芽孢杆菌能够成功于土壤中定殖并在植物根际表达分泌相关抗菌物质，从而抑制植物病原的生长繁殖，达到了防治植物土传病害的目的。
表5 番茄盆栽土壤功能基因的定量检测
注：数据为3次重复的平均值±标准误，同列数据不同字母表示在0.05水平差异显著。
表6 扩增基因及引物序列
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 甲基营养型芽孢杆菌F7及生物菌剂的应用
<160> 10
<170>PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1458
<212> 16S rRNA
<213>甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）
<400> 1
agggggggcg tgctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120
aaaccggggc taataccgga tggttgtctg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180
tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420
aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600
gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720
ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080
caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140
aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1260
tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttatggagc cagccgccga 1440
aggtggacca ggggtggg 1458
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 通用引物F27
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 通用引物R1492
<400> 3
acggctacct tgttacgact t 21

Claims (9)

1.一株甲基营养型芽孢杆菌F7，保藏编号CGMCC No.12124，于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌F7，其特征在于，其16S rRNA核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌F7的发酵液提取物，其特征在于，所述的发酵液提取物为脂肽类抗菌化合物。
4.根据权利要求3所述的一种甲基营养型芽孢杆菌F7的发酵液提取物，其特征在于，所述的脂肽类抗菌化合物包括C12-C16表面活性素同系物，C12-C17丰原素同系物和3种C14-C16伊枯草素同系物。
5.提取权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌F7的发酵液提取物的方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤：
1)挑取甲基营养型芽孢杆菌F7单菌落，采用LB液体培养，在28-32℃、转速120-180r/min摇床培养36-60h得发酵液；
2)将发酵液移至无菌离心管在14000r/min下离心3min，吸取上清液，重复该步骤得到无细胞上清液；
3)用盐酸沉淀去菌体培养基，加入甲醇后用索氏抽提器抽提，将抽提液蒸干后用0.02mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液溶解，冷冻干燥后得粗提物；
4)将粗提物加入C18萃取柱中，用超纯水洗2-3遍，再分别用80％的甲醇溶液萃取，过0.22μm的滤膜除菌，即得抑菌活性物质的发酵液提取物；
5)用超高效液相色谱-质谱联用，反相超高效液相色谱结合单四极杆质谱系统，用T3柱子分离和SQ质谱检测器，采用表面活性素、伊枯菌素和丰宁素标样，鉴定甲基营养型芽孢杆菌F7的发酵液提取物为脂肽类抗菌物质。
6.一种生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂是由权利要1所述的甲基营养型芽孢杆菌F7制得的，所述的甲基营养型芽孢杆菌F7数量为1.0×108～9.0×109cfu/ml。
7.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌F7或者权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌F7的发酵液提取物在防治青枯假单胞菌方面的应用。
8.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌F7或权利要求5所述的生物菌剂在防治番茄青枯病或者促进植物生长方面应用。
9.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌F7在拮抗植物真菌病菌方面的应用，所述的植物真菌病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型或胶孢炭疽菌或尖孢镰刀菌黄瓜专化型。
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