CN107058120A - 对黄瓜根结线虫具强致病力的淡紫紫孢菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对黄瓜根结线虫具强致病力的淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）及其应用，所述菌株为淡紫紫孢菌Pl36‑1‑1，可开发为生防菌制剂用于对黄瓜根结线虫的生物防治，较目前防治黄瓜根结线虫的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征。本发明菌株除了对黄瓜根结线虫有强致病力以外，而且菌株培养快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备，具有良好的市场应用前景。

Description

对黄瓜根结线虫具强致病力的淡紫紫孢菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种对黄瓜根结线虫具强致病力的淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）及其应用。
背景技术
黄瓜根结线虫(Meloidogyne spp.)属于侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目(Tylenchida)、异皮总科(Heteroderoidea)、黄瓜根结线虫科(Meloidogyne)中的黄瓜根结线虫属(Meloidogyne Goeldi)，是一类严重危害经济农作物并广泛分布于世界各地的重要的植物病原线虫。黄瓜根结线虫具有非常广的寄主范围，它不仅可以侵染经济性的粮食作物、蔬菜以及观赏性的花卉树木，甚至连杂草都可以侵染。黄瓜根结线虫病害可以使经济作物减产10～20%，严重时达到75%以上，甚至导致绝收。在我国，由于农业经济的高速发展、产业结构的不断改革调整、种植制度的不断合理优化以及温室和大棚栽培面积的迅速发展，再加上农民的管理意识淡薄，从而导致黄瓜根结线虫病害发病程度逐年呈上升趋势，如我国南方黄瓜根结线虫造成寄主作物常年减产15～20%，严重时达到70%以上。黄瓜根结线虫不仅造成作物减产，而且也同时诱发寄主产生其它的病害如根腐、青枯病、枯萎病和烟草黑胫病。目前，由黄瓜根结线虫引起的病害已严重制约着我国保护地作物的发展和稳产，影响着全国经济持续快速健康的发展。
迄今为止，对线虫病害的防治方法主要采用化学农药防治、农业轮作防治以及利用抗病品种等多种方法来防治和控制黄瓜根结线虫病害。化学防治因为具有高效、速效的优势，是农民目前采用控制蔬菜黄瓜根结线虫病的常用防治方法。但是，许多化学农药如二溴氯丙烷（DBCP）和甲基溴容易诱导非靶标生物产生抗性、潜在毒性，具有高毒性，残留量高，对食品安全、环境污染、臭氧层有较大的隐患，同时和当今发展环境友好型社会宗旨相违背，因此己被陆续禁用。农业防治可以通过轮作的方法改良土壤环境来减少虫源，靠增施有机肥料，提高土壤肥力以及靠通过施加碱性肥料，调节土壤pH值等防治方法防治植物线虫病害。但局限于有限的种植面积、温室建设的高成本投资，农户受环境和利益的影响，很难接受土地空闲，或者与经济价值和收益不高的作物轮作，因此靠农业防治线虫病害在我国目前不能很好地实施。抗性品种的栽种曾一度是防治黄瓜根结线虫病害比较有效而且广泛使用的防治措施，然而目前抗性品种资源太少。而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治黄瓜根结线虫也逐渐引起人们的重视。
目前，黄瓜根结线虫的生物防治以活体微生物或其代谢产物的研究较多，己有的研究结果表明，许多土壤、叶围、根围及内生微生物甚至包括一些植物病原物对黄瓜根结线虫均有一定程度的抑制作用。当前用于防治黄瓜根结线虫的生防菌当前报道主要有真菌、细菌、放线菌和杀线植物等用来作为防治植物线虫病害的生物因子。例如洛氏被毛孢(Hirstutella rhossiliensis)、厚垣普可尼亚菌 (Pochonia chamydosporium) 、Monacrosporium ellipsosporum和Arthrobotrys rubusta的分离物、Verticillum chlamydosporium、尖镰孢菌( Fusarium oxysporum)可作为有效防治南方黄瓜根结线虫的生防因子。奥尔类脐菇(Omphalotus olearius) 的次级代谢物环十二缩肽( OmphalotinA)、糙皮侧耳菌产生的反癸烯二酸毒素、绿色木霉、巴氏杆菌(Pasteuria penetrans)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、万寿菊等。用生物防治方法防治线虫病害，不仅可以防治线虫病害和增加作物产量，而且还能克服施用化学农药带来的农药残留、人畜健康和生态失衡等一系列环境灾害。但是在防治中，由于土壤生态因子环境的的复杂性，防治效果的稳定性不一定能得到保证。
目前对于黄瓜根结线虫生防菌的研究多处于实验室阶段，尚未在农业生产中达到有效防治，亟待进一步分离筛选或诱导驯化出能有效应用的生防菌，并进行生物潜能的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一株对黄瓜根结线虫具有强致病力的淡紫紫孢菌菌株，该菌株作为生防菌，具有良好的市场应用前景。
为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：
在已分离、筛选得到的原始菌株Pl36-1（来源于华中农业大学植物病理学线虫实验室）基础上，发明人进一步通过紫外诱变而得到的稳定突变子，进而得到变异的淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1，并于2016年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编430072），保藏编号为CCTCC NO：M2016683，分类命名为Purpureocillium lilacinum。
本发明还公开了该淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1在防控黄瓜根结线虫中的应用，以及在制备用于防治黄瓜根结线虫的生物农药中的应用，菌株的分生孢子悬浮液及代谢产物对黄瓜根结线虫具有强致病力。
与现有技术相比，本发明具有以下积极有益的技术效果：
（1）本发明淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1是一种线虫病原生防真菌，可制成生防菌制剂用于对黄瓜根结线虫的生物防治，较目前防治黄瓜根结线虫的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征。
（2）本发明淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1繁殖力强，培养速度快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。
（3）本发明淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1的孢子悬浮液和代谢产物对黄瓜根结线虫具有很强的致病力，浓度为106孢子/mL淡紫紫孢菌菌株接种黄瓜根结线虫后第3d的，黄瓜根结线虫的死亡率高达99.5%以上。
（4）本发明淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1产白灰制菌素浓度高、量大，而白灰制菌素在对黄瓜根结线虫幼虫致死方面起重要的作用，是用来检测线虫活性的重要指标。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。在以下实施例中所涉及的仪器、设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂如无特别说明，均为常规市售产品；所涉及的检测方法或试验方法，如无特别说明，则均为常规方法。
实施例1：淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1的获取
淡紫紫孢菌原始菌株pl36-1王明祖老师1991年在湖北省从根结线虫体内分离得到（参见1991年发表在《植物病理学报》名为“根结线虫卵寄生真菌的研究初报”的文章），至今保存于华中农业大学植物病理线虫研究室。本发明Pl36-1-1是通过紫外光诱变而获得的突变菌株。
诱变方法：根据Tanaka et al (1988)报道方法进行紫外诱变，大致如下：10mL淡紫紫孢菌Pl36-1分生孢子悬浮液（1×104个分生孢子/mL）含有吐温20（0.02％V/V）倒入直径9cm的培养皿并暴露于离紫外灯(254 nm Phillips TUV 25 W/h)下15厘米左右的地方，照射时间分别为0.5，1，1.5和2分钟。孢子悬浮液在黑暗中培养8h以后，取100μL处理过的分生孢子悬浮液分别涂布在含有多菌灵浓度为1μg/mL的PDA平板上，28℃，培养3天。然后将可以生长的突变菌株转移至含有多菌灵浓度浓度为5，10，50，60，100，120和150μg/mL的PDA培养基中筛选耐药性菌株。
突变体耐药性稳定性试验：多菌灵耐药性突变体在不含多菌灵的PDA培养基上生长10代。然后再转移到相应浓度的多菌灵PDA平板上生长，通过外观形态和存活的菌落数量确定其对多菌灵耐药性的稳定性。
实施例2：淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1对根结线虫卵寄生及幼虫致死率测定
将根结线虫卵从发病植株根部分离，用1%次氯酸钠进行表面消毒3min，水洗3次，将表面消毒的卵置于已在水琼脂（WA）平板上生长2天的菌丝上方，每皿50个卵囊，封口于28℃温箱中暗培养9天，于显微镜下观察卵被寄生情况。卵粒的寄生观察采用乳酸甘油液处理，处理约2min后被菌侵染的卵边缘透明，未被侵染的仍为深色，重复四次，只接卵的为空白对照。
从黄瓜根结上面分离根结线虫幼虫，然后0.5mL的淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1无菌发酵液和0.5mL的线虫液（100条/mL）混合均匀，28℃温箱培养，24小时以后，每天开始计数幼虫死亡条数，计算幼虫死亡率。死亡率公式=(Ca-Ta)/Ca，Ca代表对照中未死亡的线虫数量，Ta代表处理中未死亡的线虫数量。
淡紫紫孢菌株对根结线虫卵寄生率测定表明：菌株Pl36-1-1对黄瓜根结线虫寄生率达99.5%；Pl36-1对线虫卵寄生率为63.5%。具体结果见表1。
表1淡紫紫孢菌对根结线虫卵寄生率变化
淡紫紫孢菌株对根结线虫幼虫致死率测定表明：菌株Pl36-1-1对黄瓜根结线虫寄生率达91.2%；Pl36-1对线虫卵寄生率为68.4%。具体结果见表2。
表2 淡紫紫孢菌对根结线虫幼虫致死率
。
实施例3：淡紫紫孢菌Pl36-1-1产孢测定
将淡紫紫孢菌Pl36-1-1在PDA平板上于28℃下培养3d后，用打孔器(直径为0.5cm)打取边缘带菌丝的琼脂块，转接于含定量PDA(20mL/皿)的培养皿(直径为9cm)中央，每培养皿中接种一块，以出发菌株(Pl36-1菌株)为对照，每菌株4次重复。28℃下培养，10天后，制成淡紫紫孢菌孢子悬浮液，血球计数板计数，测定孢子浓度。
淡紫紫孢菌株产孢测定表明：菌株Pl36-1-1产孢量可达5.9×108spores/皿；菌株Pl36-1-1产孢量可达3.2×106spores/皿。具体结果见表3。
表3 淡紫紫孢菌产孢量
。
实施例4：白灰制菌素的提取及测定
白灰制菌素提取方法如下(Yuzuru et al., 1989)：Pl36-1-1和Pl36-1菌株在PDA平板上28°C黑暗中培养九天，用无菌水清洗孢子制成（106孢子/mL）孢子悬浮液，分别取1mL孢子悬浮液放置含有100mL的培养基B的250mL的三角瓶中，28°C，200rpm/min 培养15天。然后在培养好的发酵液中加入1mol/L HCl溶液，调节pH值到3.0，然后加入同体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取液用5% NaHCO3溶液洗涤两次，然后真空旋转干燥。粗提物即为白灰制菌素，最后用小量（10mL）的甲醇溶解，并使用质谱仪（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry MALDI-TOF MS）进行物质分析和浓度测定。
白灰制菌素在幼虫致死方面起重要的作用，是用来检测线虫活性的重要指标。白灰制菌素A和B是白灰制菌素家族重要组成成分，白灰制菌素A和B以一定的比例存在于原始菌株中，Pl36-1菌株产白灰制菌素A和B浓度分别为50.2%、98.9%，Pl36-1-1菌株产白灰制菌素A和B浓度分别为99.6%、76.3%。
表4 淡紫紫孢菌株白灰制菌素浓度
。

Claims (5)

1. 一种淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）菌株Pl36-1-1，其保藏编号为CCTCC NO：M2016683。
2.权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1在黄瓜根结线虫病中的应用。
3.权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1在制备用于防治黄瓜根结线虫的生物农药中的应用。
4.权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1在制备白灰制菌素中的应用。
5.一种生防菌制剂，含有权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株Pl36-1-1、其分生孢子或/和其代谢产物。
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