CN103602595A - 淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂和应用。本发明将淡紫拟青霉菌株20-7、山东（Sd）菌株搭载“神舟”8号飞船进行航天诱变，以未搭载的原始菌株为对照，比较航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性，以筛选获得生长性能有所改善以及对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株。本发明对航天搭载菌株通过生长速度、产孢量和致病力的筛选发现，山东菌株航天诱变菌株Sd-m-26在生长特性和致病力方面发生了较大幅度的正向变异，特别是在对根结线虫卵的致病力上比原始菌株有了非常显著的提升，在根结线虫的生物防治上具有重要的应用潜力。

Description

淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂和应用

技术领域

本发明涉及淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）航天诱变突变株，尤其涉及淡紫拟青霉山东株航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂，本发明进一步涉及该突变株在生物防治根结线虫中的应用，属于淡紫拟青霉突变株的筛选及其应用领域。

背景技术

航天诱变育种(Space Mutation Breeding)，又叫空间诱变育种，就是将航天技术与传统的物理、化学诱变及分子技术等相结合的新育种技术，利用卫星搭载微生物等生物体样品，经特殊的空间环境条件(微重力、强宇宙射线、高真空、微重力等)的作用，引起生物体的染色体畸变，进而导致生物体遗传变异，经地面选育试验后，能快速而有效地育成生物新品种(系)，供生产和研究使用（张玲华，田兴山.微生物空间诱变育种的研究进展[J].核农学报，2004，18(4)：294～296）。因此法能引起大幅度的生理变异和遗传变异，所以成为高效率育种的新途径。已有研究表明，一些农作物和微生物经过航天诱变，正向突变率和变异幅度大大高于常规诱变（宋满刚，张满贵，缪美锁，红晓祥，梁虹，罗宝君,.我国太空育种成果显著[J].种子世界，2004，7：57）。

太空环境具有较好的诱变作用，可以产生改善菌种的有利性状、创造新品种等有益变异，还可发诱发与产量有关的数量性状变异，但很多变异具有一定的随机性。搭载微生物的主要目的就是通过设计最佳方案筛选那些产量高、价值大的变异生产菌株，而为了选择得到性状稳定的新品种或品系，需要进行大量繁重的筛选和检测试验（张世成，林作楫，杨会民，赖菁茹.航天诱变条件下小麦若干性状的变异[J].空间科学学报，1996，增刊：103～107；边银丙，翁曼丽，孙勇，王斌，赵培新，闵家顺.香菇菌丝太空诱变效应研究I太空环境对香菇菌丝生长特性的影响[J].食用菌学报，1999，6(4)：11～14）。

淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）是许多重要农作物病虫的生防菌，能在土壤中习居并宿存，能够寄生控制多种植物根结线虫，还是多种非土栖害虫如荔枝蝽蟓、稻黑蝽、稻叶蝉等的天敌。其能够产生几丁质酶和丝氨酸蛋白酶，并通过这两种酶的作用破坏根结线虫卵壳，从而菌丝侵入根结线虫的卵并寄生于卵内，因此淡紫拟青霉菌株被认为是最具有应用前景的线虫生防真菌（Khan A，Willianms K L，and Nevalainen H K M.Effect ofPaecilomyces lilacius protease and chitinase on the eggshell structures andhatching of Meloidogyne javanica juveniles[J].Biological Control，2004，3：346-352）。

现有的淡紫拟青霉菌株在生长速度、产孢量等生长性能以及对根结线虫卵的致病力上都亟待提高，将淡紫拟青霉菌株通过航天诱变筛选得到在生产性能或对根结线虫卵的致病力上有显著提高的突变菌株，对于根结线虫的生物防治将具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的主要目的是将淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）进行航天诱变获得一株对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株；

本发明的另一目的是将所获得的突变株应用于根结线虫的生物防治。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株对根结线虫卵的致病能力有显著提高的淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）山东航天诱变突变株Sd-m-26，其微生物保藏号是：CGMCCNo.7770；分类命名：淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus；保藏时间是：2013年6月20日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将淡紫拟青霉菌株20-7、山东（Sd）菌株各分为两份，一份为原始菌株，留在地面常规保存用作对照（CK）；另一份搭载“神舟”8号飞船进行航天诱变，航天搭载菌株返回地面后，以未搭载的原始菌株为对照，比较航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性，以筛选获得对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株。

本发明将航天搭载菌株通过5-6代继代培养得到性状稳定菌株后，观察航天诱变对菌落形态和色素变化的影响，观察发现，经航天诱变的20-7淡紫拟青霉菌株筛选得到的19个突变菌株，变异类型较多，且各菌株均出现比原始菌株明显的轮纹，但产孢均比原始菌株少，与轮纹越明显产孢越多的文献中的结论不一致（王明祖.根结线虫卵寄生真菌的研究Ⅱ.淡紫拟青霉菌生长和产孢条件[J].华中农业大学学报，1992，11(1)：52-56）。菌落出现不同程度的隆起，大致可分为三种类型：中心隆起，隆起或扁平。中心隆起和隆起菌株颜色均比原始菌株浅；扁平菌株颜色也比原始菌株浅，只有极少数菌株颜色加深呈紫色。菌落背后颜色一般呈炒米黄色，与原始菌株差异不大。

在山东（Sd）突变菌株中，菌落有明显的形态分化，可将它们分为4种类型：I型菌落为性状变化最大的一种，菌落正面为极浅淡紫色，接近白色，菌落背部色素初生长时为墨绿色，9d后由墨绿色变为黑-棕红-白色的由深及浅的特征，菌落直径均比原始菌株小，即生长速度较原始菌株慢，其中Sd-m-30生长速度最慢，培养15d的菌落直径仅5.85cm，I型菌落共8株，占山东航天突变体菌落数的26.7％，其中Sd-m-3菌株边缘不呈圆形而是呈现出类似花朵状边缘；另外两种色素较原始菌株深，其中一种菌落中部为白色凸起外围呈淡紫色，菌落轮纹明显，为Ⅱ型，共7株，占山东航天突变体菌落数的23.3％；另一种菌落平展，中部无凸起并出现辐射状分支，为Ⅲ型，共5株占航天单孢菌落数的16.7％。其它菌落的大小均与原始菌株相近，其中12株菌株与原始菌株形态相似，为Ⅳ型，占山东航天突变体菌落数的40％。

本发明采用显微镜观察航天诱变对菌丝及孢子形态的影响，观察结果发现山东突变体I型菌落均出现菌丝缠绕形成的环状菌丝结构，环状结构的成因还不明确，有待于进一步的实验研究。Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型菌株有轮状分枝的分生孢子梗，分生孢子多数稍呈棱形，少数近椭圆形或圆形，单细胞，无色，表面光滑，形态与原始菌株基本无差异。20-7突变体菌株的菌丝及孢子形态基本无变化。

本发明还观察了航天诱变对菌株的生长速度以及菌丝干重的影响，以筛选出生长速度比原始菌株有加快的突变菌株。观察结果发现，与原始菌株相比，淡紫拟青霉20-7航天诱变菌落生长速度无明显加快的菌株；山东（sd）突变菌株生长速度与山东（sd）原始菌株相比，出现了正负双向变异，变异幅度较大，说明航天诱变可使山东菌株的生长速度产生不同趋向和不同幅度的变异。培养15d后菌落直径大于或等于原始菌株的菌株占突变菌株的26.7%，小于原始菌株的占73.3%；其中，生长速度最快的菌株为Sd-m-26，培养15d后菌落直径为8.46cm，生长速度最慢的为菌株Sd-m-30，培养15d后菌落直径仅为5.85cm。

淡紫拟青霉菌株20-7和山东（Sd）菌株的突变体菌株培养过程菌丝干重总体均变化幅度较大，培养4d的航天突变菌株菌丝干重均在0.3g以下。在20-7突变菌株中，除H20-7-1菌丝干重为0.2592g，比20-7原始菌株的0.2555g重外，其它突变体均轻于原始菌株。山东突变体菌株菌丝干重最重的Sd-m-26为0.2751g；总体上看，20-7和山东两种菌株负变异率均大于正变异率。

本发明进一步的观察了航天诱变对菌株产孢量的影响，观察结果发现，20-7原始菌株经航天诱变后，筛选得到的19株菌株中产孢量均少于原始菌株，其中产孢量最小的H20-7-4只有0.24×10⁷cfu/mL，说明航天诱变使菌落的产孢量较难在菌株本身产孢量较高的基础上更优而产生正向变异，而是更趋向于产生负向变异并且负向变异的幅度较大。相对于20-7菌株，山东菌株本身产孢量要小于20-7菌株，而经航天诱变后的菌株出现了不同趋向、不同幅度的变异。正向变异的幅度比较小，负向变异幅度较大。从观察结果可见，山东航天诱变突变株Sd-m-26的产孢量相比于原始菌株有了非常显著的提升。

为了筛选出对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株，本发明对20-7、山东（Sd）菌株的航天搭载株进行了根结线虫卵的致病力测定，测定结果发现，20-7的各航天诱变菌株都保持了对根结线虫卵的致病能力，但未见致病力提高的菌株，H20-7-16寄生率最低为4.0%。山东试验菌株中，大部分航天诱变菌株保持了原始菌株的致病水平，寄生率提高菌株占突变菌株的46.7%。其中菌株Sd-m-26致病力显著提高，其致病力达到了94.0%，比原始菌株的致病力提高了14.3%。寄生率最低的突变菌株为Sd-m-17，仅为16.3%。

生长速度、产孢量和致病力是筛选生物防治菌株的重要指标，航天诱变使这些特性表现出不同变异趋向和幅度，证明了航天诱变是非定点的、广泛性的、正负双向性的，且诱变位点多、诱变率高，所导致的生物体变异有生理性变异也可能有遗传性变异（农向群，张泽华，胡攀，高松，张礼生.航天诱变对昆虫病原真菌的生物学效应[J].菌物学报，2006，25(4)：674～681）。两株原始菌株相比，20-7无论是产孢量、生长速率还是致病力等方面均优于山东（sd）菌株，经航天诱变后，20-7菌株只在生长速度、菌丝干重上出现了少量正向变异，产孢量、致病力等均无正向变异出现，而山东菌株出现了正负双向变异，说明在诱变率高低与出发菌株本身性状的优劣密切相关。

通过生长速度、产孢量和致病力的筛选发现，山东菌株航天诱变菌株Sd-m-26在生长特性和致病力方面发生了较大幅度的正向变异，尤其是在致病力上相比于原始菌株有了非常显著的提升。本发明进一步将山东菌株航天诱变菌株Sd-m-26按照常规的微生物菌剂制备成可湿性粉剂，同时按照同样的方法将山东原始菌株制备成可湿性粉剂，比较了二者对根结线虫的生防效果；从实验结果可见，用淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26制备的可湿性粉剂对根结线虫的相对防治效果高出对照菌剂（用淡紫拟青霉山东原始菌株制备的可湿性粉剂）32.66%，幼虫减少百分率高出对照菌剂32.1%；实验结果表明，淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26对于根结线虫的生物防治效果要远远优于原始菌株对于根结线虫的生物防治效果。

本发明提供了一种防治根结线虫的淡紫拟青霉微微生物制剂，包括：淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液和载体。

作为参考，本领域技术人员可参考下述方法制备得到淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26孢子粉：（1）制备淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26发酵液；（2）从淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26发酵液中回收孢子产物；（3）干燥所回收的淡紫拟青霉孢子产物，即得淡紫拟青霉粉。

本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到淡紫拟青霉发酵液；例如，采用三级培养方法，即：种子培养、二级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到淡紫拟青霉菌航天诱变突变株Sd-m-26发酵液；其中，在液体发酵培养时,可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养；三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。

本发明进一步提供一种制备防治根结线虫的淡紫拟青霉微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤：将淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，制备得到相应的微生物制剂，例如，可以是颗粒制剂、粉剂、可湿性粉剂或微胶囊菌剂等。

其中，所述的载体可以是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸秆、干燥的农家肥等；此外，本发明的淡紫拟青霉微生物制剂中还可加入辅料或/和助剂；所述的辅料可以是蟹壳粉或几丁质等；所述的助剂可以是润湿剂、分散剂或稳定剂等。

附图说明

图1航天诱变20-7菌落形态变异菌株与20-7原始菌株。

图2航天诱变山东菌株形态变异4种类型与山东原始菌株及花朵状边缘Sd-m-3菌株。

图3航天诱变山东突变体I型菌落的环状菌丝结构。

具体实施方式

通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1淡紫拟青霉可湿性粉剂的制备

一、淡紫拟青霉(P.lilacinus)航天诱变突变株Sd-m-26孢子粉的制备

（一）、淡紫拟青霉发酵液的制备

1、将淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26菌种活化后，进行摇瓶种子培养；

摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)：

液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml,高压灭菌后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，接种量为1.5-3%，置于24-28℃，摇床150-200r/min，培养18-36h。

2、二级液体扩大培养(按质量百分比计):

二级液体扩大培养的培养基组成：

将上述二级液体扩大培养基发酵罐中在位灭菌；

液体发酵条件：发酵温度25-28℃，罐压0.6-0.8bar，其通氧量可以是100-300L/h，转速150-250rpm，起始pH值5.5-6.0。

3、液体发酵培养：

液体发酵培养的培养基组成：

将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；

液体发酵条件：发酵温度为28-30℃，其通氧量可以是100-300L/h，前24h，通气量控制在100-150L/h，后期控制在250-300L/h；起始pH：5.0-6.0；转速：150-200r/min；罐压：0.6-0.8Mpa，发酵周期控制在6d，一般镜检孢子浓度达到10⁹个/ml以上即可。

（二）、从发酵液中回收并干燥孢子产物

将发酵液离心，离心条件为：相对离心力为4000g，离心时间为40min，每100毫升发酵液中加入絮凝剂2.0g；弃上清，将沉淀菌浆用硅藻土载体吸附后阴干至产品中的含水量低于10%，即得孢子粉。

二、可湿性粉剂的制备

按下述质量百分配比称取各组分：将上述制备的淡紫拟青霉孢子粉85%，硅藻土11%，润湿剂PEG2%、分散剂木钠2%；将淡紫拟青霉孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。

对比实施例淡紫拟青霉可湿性粉剂的制备

除了淡紫拟青霉菌种为淡紫拟青霉山东（Sd）原始菌株（即：没有进行航天搭载诱变，留在地面常规保存用作对照（CK）的山东菌株）外，其余均与实施例1完全相同。

实验例1淡紫拟青霉20-7航天诱变突变株的筛选及诱变效应的测定实验

1实验材料及方法

1.1菌株

供试淡紫拟青霉（P.lilacinus）20-7、山东（Sd）菌株。航天诱变返地后，于本试验室4℃保存，备用。

1.2航天搭载

将淡紫拟青霉20-7、山东（Sd）菌株分别分为两份，一份留在地面常规保存用作对照（CK）；另一份于2011年11月1日搭载“神舟”8号飞船，历时6d20h。返回地面后，及时取出材料低温保存。

1.3突变体筛选

将经航天诱变处理后的淡紫拟青霉菌株和野生型菌株（CK）分别制成孢子悬浮液，稀释至10³倍，涂布到PDA平板上（每皿加0.1mL孢子液），25℃恒温培养4d-6d后，观察单菌落大小、形态和正反面颜色，挑选出与野生型菌株（CK）差别较明显的菌株。

1.4航天诱变效应的测定

以未搭载的原始菌株为对照，比较航天菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性。

1.4.1突变菌株的形态和色素变化观察

淡紫拟青霉菌株孢子活力极强，容易四周飞溅生长，故采用孢子液滤纸片接种法接种。从已生长好的平板上，用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含0.5‰吐温的溶液中，充分震荡，制成孢子悬浮液。用灭好菌的直径为6mm的滤纸片蘸满孢子液放在培养皿中央，置于25℃温箱中培养，每个菌株3皿，观察菌落的形态、颜色。

1.4.2菌丝及孢子形态观察

将盖玻片斜插在正常生长的突变菌株边缘，3-4d后，待菌丝生长延伸至盖玻片上，显微镜观察并拍照。

1.4.3菌落生长速度测定

用灭菌的直径为6mm的滤纸片蘸满孢子液放在培养皿中央，置于25℃温箱中培养，以十字交叉法每三天测菌落直径，至有菌株长满整皿（约15d）时停止测定。野生型菌株为对照，重复3次。

1.4.4菌丝干重测定

250mL锥形瓶装50mL PD培养液，吸取0.2mL孢子悬浮液于每瓶培养基中，恒温摇床温度为25℃，转速为110r/min。培养4d后，从三角瓶中倒出所有菌液，离心倒上清，将沉淀倒在滤纸上，60℃烘箱烘干，称重。

1.4.5产孢量测定

用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含0.5‰吐温的溶液中，充分震荡后在显微镜下用血球计数板计数，计算产孢量，设3次重复。

2实验结果

2.1航天诱变对菌落形态和色素变化的影响

通过5-6代继代培养得到性状稳定菌株后，观察发现，经航天诱变的20-7淡紫拟青霉菌株筛选得到的19个突变菌株，变异类型较多，且各菌株均出现比原始菌株明显的轮纹，但产孢均比原始菌株少，与轮纹越明显产孢越多的文献中的结论不一致（王明祖.根结线虫卵寄生真菌的研究Ⅱ.淡紫拟青霉菌生长和产孢条件[J].华中农业大学学报，1992，11(1)：52-56）。据观察，菌株色素越深产孢越多，说明产孢量的多少与色素之间的关系比与菌株轮纹的明显程度更为密切（表1）。

菌落出现不同程度的隆起，大致可分为三种类型：中心隆起，隆起或扁平。中心隆起和隆起菌株颜色均比原始菌株浅，如：H20-7-1，H20-7-2，H20-7-3，H20-7-4，H20-7-5等；扁平菌株颜色也比原始菌株浅，只有极少数菌株颜色加深呈紫色，如：H20-7-7，H20-7-8，H20-7-16。菌落背后颜色一般呈炒米黄色，与原始菌株差异不大，特别的，H20-7-12和H20-7-16菌落背后中心为辐射状棕黄色，H20-7-19呈偏转辐射状棕黄色（图1，表1）。

表1淡紫拟青霉20-7突变体的形态学特征

在山东（Sd）突变菌株中，菌落有明显的形态分化，可将它们分为4种类型：I型菌落为性状变化最大的一种，菌落正面为极浅淡紫色，接近白色，菌落背部色素初生长时为墨绿色，9d后由墨绿色变为黑-棕红-白色的由深及浅的特征，菌落直径均比原始菌株小，即生长速度较原始菌株慢，其中Sd-m-30生长速度最慢，培养15d的菌落直径仅5.85cm，I型菌落共8株，占山东航天突变体菌落数的26.7％，其中Sd-m-3菌株边缘不呈圆形而是呈现出类似花朵状边缘；另外两种色素较原始菌株深，其中一种菌落中部为白色凸起外围呈淡紫色，菌落轮纹明显，为Ⅱ型，共7株，占山东航天突变体菌落数的23.3％；另一种菌落平展，中部无凸起并出现辐射状分支，为Ⅲ型，共5株占航天单孢菌落数的16.7％。其它菌落的大小均与原始菌株相近，其中12株菌株与原始菌株形态相似，为Ⅳ型，占山东航天突变体菌落数的40％（图2，表2）。

表2淡紫拟青霉山东（sd）突变体的形态学特征

2.2菌丝及孢子形态观察

经显微观察，山东突变体I型菌落均出现菌丝缠绕形成的环状菌丝结构（图3）环状结构的成因还不明确，有待于进一步的实验研究。Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型菌株有轮状分枝的分生孢子梗，分生孢子多数稍呈棱形，少数近椭圆形或圆形，单细胞，无色，表面光滑，形态与原始菌株基本无差异。20-7突变体菌株的菌丝及孢子形态也基本无变化。

2.3航天诱变对生长速度的影响

与原始菌株相比，淡紫拟青霉20-7航天诱变菌落生长速度无明显加快的菌株，分别测定了突变菌株6d，9d，12d，15d的菌落直径后发现：多数菌株9d-12d加快，12d-15d又减缓，而H20-7-4菌株菌落直径9d-12d较3d-6d减缓而后又加快，差别于所有突变菌株和原始菌株。H20-7-3，H20-7-4和H20-7-16生长速度明显缓慢，原始菌株的菌落在15d后直径平均达到7.95cm，而突变菌株的菌落直径在培养15d时平均值分别只有7.58cm、7.55cm、7.18cm，其中H20-7-16生长最为缓慢。经SPSS检测，H20-7-7、H20-7-13、H20-7-14、H20-7-16、H20-7-17、H20-7-22、H20-7-27和H20-7-30菌落直径在第6d、9d、12d、15d与原始菌株之间差异显著，其它菌株均差异不显著。

表3航天诱变淡紫拟青霉20-7生长速度变异筛选结果

注：表中数据为平均值±标准误，同一栏内数据后小写字母表示经SPSS检测相互间差异显著(P<0.05)，下表同。

山东（sd）突变菌株生长速度与山东（sd）原始菌株相比，出现了正负双向变异，变异幅度较大，说明航天诱变可使菌落的生长速度产生不同趋向和不同幅度的变异。培养15d后菌落直径大于或等于原始菌株的菌株有8株，占突变菌株的26.7%，小于原始菌株的占73.3%；生长速度最快的菌株为Sd-m-26，培养15d后菌落直径为8.39cm，生长速度最慢的为菌株Sd-m-30，培养15d后菌落直径仅为5.85cm；据观察，生长速度普遍较慢的大多数为菌落表型尤其是色素变化较大的菌株。经SPSS检测，Sd-m-7、Sd-m-13、Sd-m-14、Sd-m-16、Sd-m-17、Sd-m-22和Sd-m-30菌落直径在第6d、9d、12d、15d与原始菌株之间差异显著，其它菌株均差异不显著。

表4航天诱变淡紫拟青霉山东（Sd）生长速度变异筛选结果

注：表中数据为平均值±标准误。同一栏内数据后小写字母表示经SPSS检测相互间差异显著(P<0.05)。

Note:Data in the table is mean±SD,means followed by the different letter within a column are significantly different(P<0.05,SPSS test).

2.4航天诱变对菌丝干重的影响

两种突变体菌株培养过程菌丝干重总体均变化幅度较大，培养4d的航天突变菌株菌丝干重均在0.3g以下。在20-7突变菌株中，除H20-7-1菌丝干重为0.2592g比20-7原始菌株的0.2555g重外，其它突变体均轻于原始菌株。山东突变体菌株菌丝干重最重的Sd-m-26为0.2751g；与山东原始菌株相比，菌丝干重加重的有9株，正变异率为30%，相对的，负变异率为70%，负变异率大于正变异率。总体上看，20-7和山东两种菌株负变异率均大于正变异率。

2.5航天诱变对产孢量的影响

20-7原始菌株为优选菌株，经航天诱变后，筛选得到的19株菌株中产孢量均少于原始菌株，其中产孢量最小的H20-7-4只有0.24×10⁷cfu/mL，说明航天诱变使菌落的产孢量较难在菌株本身产孢量较高的基础上更优而产生正向变异，而是更趋向于产生负向变异并且负向变异的幅度较大。

相对于20-7菌株，山东菌株本身产孢量要小于20-7菌株，而经航天诱变后的菌株出现了不同趋向、不同幅度的变异。正向变异的幅度比较小，负向变异幅度较大（表5），其中，山东突变体菌株Sd-m-26比原始菌株的产孢量有非常显著的增长。

表5山东航天诱变菌株产孢量变异筛选结果

实验例2淡紫拟青霉20-7航天诱变突变株对根结线虫卵的致病能力的测定实验

1、实验方法

用无菌水配制10³/mL根结线虫卵粒悬浮液，在6cm的小培养皿中加入0.5mL该卵悬浮液，50μL孢子液，4.5mL无菌水。以未加孢液的小培养皿作为对照。每个突变菌株各重复3次，即各3皿。25℃培养4d。镜检，每皿随机计数50粒卵，统计被寄生的卵数，计算各菌株的卵寄生率。卵寄生率（％）＝（该菌株3次重复试验中被寄生卵数的平均值/50）×100％。

2、实验结果

据观察，在接种后2d，根结线虫卵即可被侵染，被寄生卵多为胚胎发育早期的卵，3-4d后卵壳表面布满菌丝，边缘不完整，到5-6d时卵粒严重变形，卵内容物模糊，卵壳内物质被当做营养基质逐渐消解变空；发育后期的卵未见被寄生，且幼虫大多未孵化逸出，说明孢悬液寄生卵的同时对卵孵化也有抑制作用，对照中的卵内容物清晰且边缘平滑完整。结合生长速度和产孢量的提高，可进一步筛选出高产高毒的优良菌株。

测定结果表明，20-7的各航天诱变菌株都保持了对根结线虫卵的致病能力，但未见致病力提高的菌株，H20-7-16寄生率最低为4.0%。山东试验菌株中，大部分航天诱变菌株保持了原始菌株的致病水平，寄生率提高菌株占突变菌株的46.7%。其中突变菌株Sd-m-26致病力有非常显著的提高，其致病力为94.0%，比原始菌株提高了14.3%。寄生率最低的突变菌株为Sd-m-17仅为16.3%（表6，表7）。

表6 20-7航天诱变菌株对根结线虫卵的寄生率（致病力）筛选结果

注:清水中处理4d的根结线虫卵孵化率为18.0%

表7山东航天诱变菌株对根结线虫卵的寄生率（致病力）筛选结果

注:清水中处理4d的根结线虫卵孵化率为18.0%

实验例3山东航天诱变突变株Sd-m-26制备的可湿性粉剂防治花椒根结线虫的田间实验

1试验材料及方法

1.1供试菌剂

试验菌剂：用淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26制备的可湿性粉剂（实施例1制备）；

对照菌剂：用淡紫拟青霉山东原始菌株（未进行航天诱变）制备的可湿性粉剂（对比实施例制备）。

1.2试验作物

花椒种植区种植的花椒树。

1.3实验设计

实验地点设在线虫虫量大且均匀的花椒种植区，药前调查根结线虫二龄幼虫虫口在每100g土壤20-30头。

实验分为3组，试验1组，试验2组和清水对照组，具体实验设计如下：

试验1组采用实施例1制备的可湿性粉剂进行处理；

对照2组采用对照实施例制备的可湿性粉剂进行处理。

清水对照组：采用清水进行处理（不施加任何防治线虫的药剂），不作防线虫处理；

每个处理30个重复（分三列，每列10株花椒树），各处理随机排列。

4月中旬至5月初进行菌剂小区试验，在花椒树四周扒开根表面10cm厚、半径为50cm的土层，将1毫升的原菌剂（试验菌剂以及对照菌剂的用量均相同，均为1毫升原菌剂/株）用水稀释后采用喷雾方式将稀释后的菌剂均匀喷洒在挖好的坑中，使菌剂分布在根围，再使扒开土壤复位。施药90d后调查花椒树根结指数（病情指数）和土壤中二龄幼虫数，评价防治效果。

根结指数（病情指数）计算方法：挖出每处理花椒根，按照根结线虫分级调查指标进行调查，根结严重度分0-10级，分级标准参照Benjamin等（Benjamin D，Grover C B J.Comparison of compatible and incompatibleresponse of potato to Meloidogyne incognita.Journal of Nematology，1987，19:218-221）。根结指数计算公式如下：

幼虫减少百分率（相对减退率）计算方法：每小区用取土钻（2cm×H20cm）从作物根围（0-20cm深）采集5个点的土样，充分混匀后，取100g用离心漂浮分离法（Karssen G.The Plant Parasitic NematodeGenus Meloidogyne Goldi,(Tylenchida)in Europe[M].Gent:DrukkeruModern,1982:5-24.）分离土样中的二龄幼虫，热杀死后用4%福尔马林固定，在倒置显微镜下计数，计算100g土样内根结线虫二龄幼虫数及幼虫减少百分率（相对减退率）。计算公式如下：

相对防治效果计算公式如下：

2实验结果

实验结果见表8。

表8淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26菌剂对花椒根结线虫的防治效果实验

从表8的实验数据可见，试验菌剂（用淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26制备的可湿性粉剂）对根结线虫的相对防治效果高出对照菌剂（用淡紫拟青霉山东原始菌株制备的可湿性粉剂）32.66%，试验菌剂幼虫减少百分率高出对照菌剂32.1%；试验结果表明，淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26对于根结线虫的生物防治效果要远远优于原始菌株对于根结线虫的生物防治效果。

Claims (10)

1.一株淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）山东航天诱变突变株Sd-m-26，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC No.7770。

2.权利要求1所述的淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26在防治植物害虫中的应用。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的植物害虫是线虫。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的线虫是根结线虫。

5.一种防治植物害虫的微生物制剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液以及载体。

6.按照权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于：所述的载体是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸秆或干燥的农家肥。

7.按照权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于：还含有辅料或助剂。

8.按照权利要求7所述的微生物制剂，其特征在于：所述的辅料是蟹壳粉或几丁质；所述的助剂是润湿剂、分散剂或稳定剂。

9.一种制备权利要求5-8任何一项所述微生物制剂的方法，包括以下步骤：将淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，得到相应的微生物制剂。

10.按照权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于：所述的植物害虫是根结线虫。

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