CN109825463A - 多粘类芽孢杆菌bmf02及其可湿性粉剂的制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种源自海洋的多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BMF02菌株，其保藏号为：CCTCC NO：M 2017154。本发明还公开了利用多粘类芽孢杆菌BMF02菌株制备可湿性粉剂的方法与用途。本发明菌株发酵温度低，发酵时间短，发酵条件易于控制。用该菌株制得的可湿性粉剂具有很好的防治甜瓜枯萎病的作用，可以用于甜瓜的种植。本发明方法制备的海洋多黏类芽孢杆菌BMF02菌株可湿性粉剂，对甜瓜枯萎病的田间综合防效高达84.9％，高于3％的多抗霉素。使用该菌剂后，甜瓜产量得到了较大的提高。

Description

多粘类芽孢杆菌BMF02及其可湿性粉剂的制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种源自海洋的菌株，特别是一种多粘类芽孢杆菌BMF02菌株，本发明还涉及利用该多粘类芽孢杆菌BMF02菌株制备可湿性粉剂的方法和用途。

背景技术

甜瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌甜瓜转化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)侵染引起的一种土传病害，严重影响甜瓜的产量和品质，造成经济损失。目前甜瓜枯萎病的防治主要依赖化学农药，但化学防治会导致一系列的问题，如食品中农药残留超标、环境污染和病原菌产生抗药性等。因此，研制新型高效、环保、安全的微生物制剂成为了防治植物病害的研究热点。

多黏类芽孢杆菌(PaenibaciLLus.poLymyxa)是一种广范存在的重要微生物资源，其中很多菌株作为重要的生防资源，用于多种植物病害的生物防治，该菌对人畜安全、无环境污染、对植物非致病性，具有显著的生防潜力和环境适应性，在生产过程中活菌量高且产品稳定性强，是目前进行微生物农药规模化生产的理想菌属。多个学者分离得到的多黏类芽孢杆菌对番茄灰霉病、黄瓜枯萎病和辣椒疫病等植物病害具有一定的防治效果。美国环境保护署(EPA)将多黏类芽孢杆菌列为可商业上应用的微生物种类之一。近年来有关防治植物病害的微生物制剂研究报道日益增加。李磊等通过室内筛选和田间试验，确定解淀粉芽孢杆菌Ht-q6可湿性粉剂的最佳配方以及对番茄叶霉病和灰霉病的田间防效。贾海民等研究了微生物杀菌剂“10亿芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂”不同施用量(0.5g/穴、1.0g/穴和1.5g/穴)对番茄重茬病的防治效果及其对番茄产量的影响。结果表明：施用微生物杀菌剂0.5～1.5g/穴能够有效控制番茄重茬病的发生，防效为59.1％～98.9％，且能够显著增强番茄的生长势，提高番茄果实产量和品质。徐玲等通过室内盆栽实验结果表明，HY96-2的生防制剂KDLD对番茄青枯病的防治效果可达81.5％。

目前，国内外对于甜瓜防治的生物防治主要是利用陆源微生物进行防治，而采用海洋微生物防治的报道较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种源自海洋的耐盐、培养温度低、营养简单的新的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BMF02菌株CCTCCNO：M 2017154。

本发明所要解决的另一个术问题，供述了利用多粘类芽孢杆菌BMF02菌株制备可湿性粉剂的方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供了可湿性粉剂防治甜瓜枯萎病的用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BMF02菌株，其特点是，其保藏号为：CCTCC NO：M2017154。

本发明所涉及的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BMF02菌株，已于2017年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection)CCTCC，其保藏号为：CCTCC NO：M 2017154，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，邮编：430072；电话：027-68752319。

本发明还公开了多粘类芽孢杆菌BMF02菌株的产芽孢发酵培养方法，其特点是，其步骤如下：

(1)将BMF02菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取BMF02菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁸个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基为PD培养基；

(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为180r/min，在0～12h时通气量为15m³/h，12h后通气量调整为32m³/h，28℃，发酵时间为24h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH 7.0。

本发明还公开了利用多粘类芽孢杆菌BMF02菌株制备可湿性粉剂的方法，其特点是，其步骤如下：

(1)将多粘类芽孢杆菌BMF02菌株在发酵罐中进行发酵培养，得到的发酵液用皂土为载体，增加絮凝剂进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到BMF02菌粉；

(2)向BMF02菌粉，按以下质量百分比向BMF02菌粉中加入助剂：BMF02菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂蔗糖脂肪酸酯8％，分散剂聚乙烯醇8％；混合均匀，粉碎后过300目筛，得到BMF02菌株可湿性粉剂。

以上所述的方法中，所述的絮凝剂优选为氯化钙和磷酸氢二钠的组合物，二者占为发酵液体积7％。优选二者的比例为氯化钙占组合物的45％。

本发明所述的方法所制得的BMF02菌株可湿性粉剂作为有效成份可以用来制造防治甜瓜枯萎病的药物或者药物组合物。

以下是发明所做的相关的实验及其结果。

1材料与方法

1.1供试菌种

海洋多黏类芽孢杆菌(PaenibaciLLus.poLymyxa)菌株BMF02,保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017154。

1.2培养基

菌株活化培养基：PDA培养基；种子液培养基：PD培养基。

1.3载体和助剂

载体：膨润土、皂土、高岭土、碳酸氢钙、活性白土、硅藻土、凹凸棒土；稳定剂：荧光素钠、硬脂酸锌、腐植酸、黄原胶、海藻酸钠、硬脂酸钙；湿润剂：脂肪醇聚氧乙烯醚25、蔗糖脂肪酸酯、吐温80、乙氧基化烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠；分散剂：聚乙烯醇、羧甲基纤维素纳；展着剂：柱层层析硅胶、薄层层析硅胶。

1.4种子液制备

将BMF02菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取BMF02菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁸个细胞/mL，作发酵用种子液。

1.5可湿性粉剂载体和助剂的筛选

1.5.1不同载体和助剂与BMF02菌株生物相容性的测定

将制备好的种子液取6mL分别接入装有60mL含4％载体和助剂的PD培养基的250mL的三角瓶中，在28℃，180r/min的条件下培养24h，用稀释涂布计数法检测培养液中的含菌量。每个处理3个重复。根据活菌数量判断不同载体和助剂与BMF02菌株的生物相容性。

1.5.2可湿性粉剂载体和助剂种类的筛选

载体对BMF02菌株吸附量的测定，分别向100mL的烧杯中加入各种载体各2g。将BMF02菌株的发酵液向烧杯中的载体缓慢滴加，滴加的同时用玻璃棒搅拌。当载体粉末开始凝结成团且不散开时，停止向其中继续滴加发酵液。记录滴加到载体中的发酵液的量。每种载体3个重复。

载体和助剂悬浮率测定采用国家标准农药可湿性粉剂悬浮率测定方法。

载体和助剂润湿性采用国家标准农药可湿性粉剂润湿时间测定方法。

1.5.3可湿性粉剂加工载体与助剂配比及用量筛选

筛选出的稳定剂与BMF02菌株的新鲜干粉按1:5、1:10、1:20的质量比混合均匀。分别在放置5d、10d、15d时称取不同配比的试样测定活菌数。确定稳定剂的配比。

将筛选出的最佳湿润剂、分散剂和展着剂按不同的比例混合，粉碎机混合均匀后过325目筛，测定其润湿时间和悬浮率，筛选出湿润剂、分散剂和展着剂的最佳质量配比。将筛选出的最佳质量配比的分散剂和润湿剂按2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％的不同用量添加到BMF02菌株的新鲜菌粉中。综合考虑润湿性和悬浮效果，筛选出湿润剂、分散剂和展着剂的最佳用量。

1.6可湿性粉剂的制备及性质测定

1.6.1菌粉的制备

海洋多黏类芽孢杆菌在1吨发酵罐中按优化的发酵条进行发酵，搅拌速度为180r/min，在0～12h时通气量为15m³/h，12h后通气量调整为32m³/h，28℃，发酵时间为24h，得发酵液；用筛选出的载体并增加絮凝作用的物质进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到菌粉。

1.6.2可湿性粉剂的加工及其性质测定

按照优化BMF02菌株的菌粉与助剂比例加入优化筛选出的稳定剂、湿润剂和分散剂，混合均匀，粉碎后过325目筛，得到BMF02菌株可湿性粉剂，按照国家可湿性粉剂的标准测定悬浮率、润湿时间和含水量，将制得的BMF02菌株可湿性粉剂存放于室温条件下(25℃)，120d前每15d、120d后每30d取样，采用平板计数法测定保存不同时间样品的活菌数。

1.7 BMF02菌株可湿性粉剂不同处理方法防治甜瓜枯萎病的田间药效试验

试验地选择甜瓜枯萎病发病较重地区进行田间药效试验。试验小区按随机区组排列，每小区移栽2行甜瓜，行距为65cm，株距为29cm。在盆栽实验不同方法最适用药浓度的基础上，设计拌种法、拌土法、灌根法及综合方法施药4种方法。拌种法：取甜瓜种子质量3％BMF02可湿性粉剂对甜瓜种子进行拌种后催芽，接种至土壤中；拌土法：制备质量分数为30％含药土壤，采用上铺下盖的处理方式将含生防制剂的土壤添加到甜瓜床的土壤中，种植甜瓜时铺上500g含药剂土壤后播种露白的种子，种子上再盖上500g含药剂土壤；灌根法：甜瓜生长至子叶期时用20％BMF02可湿性粉剂溶液进行灌根处理^[18]。综合防治：使用以上三种方法及浓度分别对甜瓜进行处理。每种处理，3次重复，以清水和3％多抗霉素作对照，最后1次施药后10d进行第1次调查，之后每隔10d进行1次药效调查。记录发病率和病情指数，计算防效。甜瓜收获后不同小区单独测产，分别记录单瓜质量、每株果实数及20株产量，计算保产率。

2结果与分析

2.1.可湿性粉剂载体和助剂的筛选

2.1.1载体的筛选

添加皂土的发酵液中的活菌数最高，为1.22×10¹⁰CFU/mL，说明在试验所测定的所有载体中，皂土与BMF02菌株的生物相容性最好(表1)。本试验中所选载体对BMF02菌株的吸附效果有显著差异，其中皂土对BMF02菌液的吸附效果最好，平均吸附量可达2.333mL/g，其吸附量明显多于其他载体(表2)。添加皂土的制剂润湿时间最短，为25s，添加皂土的悬浮率也最高，为87％。综上所述，本试验选择皂土作为BMF02菌株可湿性粉剂的载体。

表1 添加不同载体的BMF02菌株发酵24h的菌落数

表2 不同载体对BMF02菌株发酵液吸附量的影响

2.1.2稳定剂的筛选

不同的稳定剂与BMF02菌株生物相容性有明显差异。其中添加稳定海藻酸钠的发酵液活菌数最高，为1.76×10¹⁰CFU/mL(表3)。不同稳定剂对制剂性能有明显的影响，添加不同稳定剂的润湿时间由短到长的顺序为：硬脂酸钙<海藻酸钠<荧光素钠<腐殖酸<硬脂酸锌<黄原胶，添加硬脂酸钙的润湿时间最短，为63s，海藻酸钠、荧光素钠次之；海藻酸钠的悬浮率最高，为81％，悬浮效果最佳，其次是荧光素钠、硬脂酸钙。综合考虑稳定剂与BMF02菌株的生物相容性、润湿效果和悬浮效果，选择海藻酸钠作为制剂的稳定剂。

表3 添加不同稳定剂的BMF02菌株发酵24h的菌落数

2.1.3湿润剂的筛选

添加湿润剂的发酵液中的活菌数与空白对照相比都有明显增加。其中添加蔗糖脂肪酸酯的发酵液中的活菌数最高，为8.98×10⁹CFU/mL(表4)。添加不同湿润剂对制剂的湿润时间和悬浮率有明显影响。添加蔗糖脂肪酸酯时润湿时间最短，润湿时间为9s，悬浮率也最高，为80％。综上所述，本试验选择蔗糖脂肪酸酯作为制剂的湿润剂。

表4 添加不同湿润剂的BMF02菌株发酵24h的菌落数

2.1.4分散剂、展着剂的筛选

不同分散剂与BMF02菌株的生物相容性有明显的不同。由表5可以看出，供试分散剂聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠和柱层层析硅胶与BMF02菌株有较好的生物相容性，对菌株的生长都表现了一定的促进作用；而薄层层析硅胶与BMF02菌株的生物相容性较差。

添加不同分散剂的制剂的悬浮率均比较高，表明分散剂能显著提高BMF02可湿性粉剂的悬浮性，添加分散剂聚乙烯醇的悬浮率最高，为80％，悬浮时间最短，为10s。添加展着剂柱层层析硅胶和薄层层析硅胶的悬浮率较低，湿润性差。因此在制剂制备的过程中不添加展着剂(表6)。

综合考虑以上筛选结果，选择聚乙烯醇作为BMF02可湿性粉剂的分散剂。

表5 添加不同分散剂、展着剂的BMF02菌株发酵24h的菌落数

表6 不同的分散剂、展着剂对制剂性质的影响

2.2可湿性粉剂载体与助剂配比及用量筛选

2.2.1稳定剂配比的筛选

菌粉与稳定剂硬脂酸钙的配比不同，保存相同天数活菌数的减少量也不同。存放15d时，不添加稳定剂海藻酸钠的制剂中活菌数最少，为9.07×10⁸CFU/g，添加不同配比稳定剂硬脂酸钙的制剂活菌数均明显高于空白对照，说明添加稳定剂海藻酸钠提高了制剂的稳定性。且当菌粉与稳定剂的配比为5:1时，制剂存放15d时活菌数最多，说明当菌粉与稳定剂的配比为5:1时，此时稳定性最佳。因此可以确定菌粉与稳定剂的最优配比为5:1(表7)。

表7 加入不同比例海藻酸钠对BMF02菌株制剂活菌数的影响(CFU/g)

2.2.2湿润剂与分散剂的质量配比对制剂性质的影响

随着分散剂聚乙烯醇与湿润剂蔗糖脂肪酸酯质量配比的增加，制剂的悬浮率随着提高，同时制剂的润湿时间也随着变长(表8)。说明湿润剂与分散剂的质量配比对制剂性质有显著影响，分散剂质量的增加显著提高了制剂的悬浮率，同时湿润剂质量的减少显著延长了湿润时间。

综合考虑润湿性与悬浮性，选择分散剂与湿润剂的质量配比为5:5。

表8 不同湿润剂和分散剂对制剂性质的影响

2.2.3湿润剂与分散剂的用量对制剂性质的影响

湿润剂与分散剂的用量对制剂性质有明显的影响(表9)。随着湿润剂和分散剂添加量的增加，制剂的悬浮率随之提高，润湿时间变短。说明增加湿润剂与分散剂的用量将提高制剂的悬浮性和润湿性。同时考虑到湿润剂和分散剂用量的增加将导致制剂有效成分含量的减少，在本试验中，选择湿润剂与分散剂的用量为16％，此时制剂的悬浮率为82％，润湿时间为20s。

表9 湿润剂与分散剂的用量对制剂性质的影响

2.3 BMF02可湿性粉剂的制备及性质测定

2.3.1 BMF02菌粉的制备

结果如表10。制备的菌粉含菌量达3.77×10¹¹CFU/g，含水率6％。

表10 BMF02菌株1吨酵罐发酵记录

2.3.2 BMF02可湿性粉剂的制备及其性质检测

测得该制剂的润湿时间为48s，悬浮率为75％，含水量6％，制剂100％通过325目筛，活菌数为2.36×10¹¹CFU/g，杂菌率为0％。达到了国家农药可湿性粉剂的质量要求。

由表11可以看出，BMF02可湿性粉剂的活菌含量随着储存时间的延长有所下降，但减少的速度较缓慢，保存360d后活菌数减少较少，说明该菌株的可湿性粉剂稳定性较好。

表11 BMF02可湿性粉剂保存不同时间的活菌数

2.4 BMF02可湿性粉剂菌剂不同处理方法防治甜瓜枯萎病的田间药效试验

田间药效试验结果表明(表12)，不同处理方法对枯萎病的防治效果不同，综合应用拌种、拌土、灌根的防治效果最好，拌土的防治效果次之，防效分别为84.9％和64.2％，综合处理的防效高于CK1(3％的多抗霉素)。

表12 不同处理方法对甜瓜枯萎病的防病效果(％)

可湿性粉剂作为微生物制剂主要剂型，相比于液体制剂更容易运输和贮存，与其它固体制剂相比，有效成分、湿润性等多方面都有提高，防病范围更广。可湿性粉剂性能评价常用指标包括有效成分、悬浮率、湿润性、含水量和细度等，其中悬浮率是最重要的性能指标，其次为润湿性和有效成分。载体虽然是一种惰性材料，但不同种类的载体对活体微生物的影响较大。

本发明研究显示皂土与海洋多黏类芽孢杆菌有较好的生物相容性，但硅藻土会抑制其菌落的生长。因此可见，同一种载体，对不同微生物会产生不一样的效果，所以研制不同微生物可湿性粉剂时，必须针对其所用菌株而选择相关载体和助剂，提高其生防效果。载体和助剂的选择对可湿性粉剂的悬浮率、湿润时间和有效成分均有影响。

本发明制得的海洋细菌BMF02菌株可湿性粉剂的悬浮率为75％，润湿时间为48s，悬浮率与文献报道比较接近，而湿润时间则减少了一半，这是由于本发明优选了可湿性粉剂中所选用的载体和助剂。

本发明研制的海洋多黏类芽孢杆菌BMF02菌株可湿性粉剂，对甜瓜枯萎病的田间综合防效高达84.9％，高于3％的多抗霉素。使用该菌剂后，甜瓜产量得到了增加，表明该菌株具有良好的应用前景，为该菌株可湿性粉剂的工业生产奠定基础。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种源自海洋的多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BMF02菌株，其保藏号为：CCTCC NO：M 2017154。

所述的多粘类芽孢杆菌BMF02菌株的产芽孢发酵培养方法步骤如下：

(1)将BMF02菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取BMF02菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁸个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基为PD培养基；

(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为170r/min，在0～12h时通气量为15m³/h，12h后通气量调整为32m³/h，发酵时间为24h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH 7.0。

利用前述的多粘类芽孢杆菌BMF02菌株制备可湿性粉剂的方法步骤如下：

(1)将多粘类芽孢杆菌BMF02菌株在发酵罐中进行发酵培养，得到的发酵液用皂土为载体，增加絮凝剂进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到BMF02菌粉；

(2)向BMF02菌粉，按以下质量百分比向BMF02菌粉中加入助剂：BMF02菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂蔗糖脂肪酸酯8％，分散剂聚乙烯醇8％；混合均匀，粉碎后过300目筛，得到BMF02菌株可湿性粉剂。

絮凝剂为氯化钙和磷酸氢二钠的组合物，二者占为发酵液体积7％；氯化钙为2％，磷酸氢二钠为5％。

所制得的BMF02菌株可湿性粉剂作为有效成份可以用来制造防治甜瓜枯萎病的药物或者药物组合物，用于防治甜瓜枯萎病。

Claims (5)

1.一种多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BMF02菌株，其特征在于，其保藏号为：CCTCC NO：M 2017154。

2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌BMF02菌株的产芽孢发酵培养方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)将BMF02菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取BMF02菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁸个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基为PD培养基；

(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为180r/min，在0～12h时通气量为15m³/h，12h后通气量调整为32m³/h，发酵时间为24h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH7.0。

3.利用权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌BMF02菌株制备可湿性粉剂的方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)将多粘类芽孢杆菌BMF02菌株在发酵罐中进行发酵培养，得到的发酵液用皂土为载体，增加絮凝剂进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到BMF02菌粉；

(2)向BMF02菌粉，按以下质量百分比向BMF02菌粉中加入助剂：BMF02菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂蔗糖脂肪酸酯8％，分散剂聚乙烯醇8％；混合均匀，粉碎后过300目筛，得到BMF02菌株可湿性粉剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的絮凝剂为氯化钙和磷酸氢二钠的组合物，二者占为发酵液体积7％。

5.权利要求3所述的方法所制得的BMF02菌株可湿性粉剂作为有效成份在制造防治甜瓜枯萎病的药物或者药物组合物中的用途。