CN108148778B

CN108148778B - 解淀粉芽孢杆菌gy30及其菌粉的制备与用途

Info

Publication number: CN108148778B
Application number: CN201810024753.4A
Authority: CN
Inventors: 李楠; 贾杰; 张海军; 刘慕兰; 李惠; 陶忠; 蒋涛; 丁正庭; 徐全德
Original assignee: Jiangsu Frey Agrochemicals Co ltd
Current assignee: Jiangsu Frey Agrochemicals Co ltd
Priority date: 2018-01-10
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-01-10
Also published as: CN108148778A

Abstract

本发明公开了一种源自海洋的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY30菌株，其保藏号为：CGMCC NO.14480。本发明还公开了解淀粉芽孢杆菌GY30菌株的产芽孢发酵培养基配方和培养方法，以及利用解淀粉芽孢杆菌GY30菌株芽孢制备菌粉的方法。本发明菌株具有陆源微生物不具有的较强耐盐性，生长温度低，抑菌作用强、抑菌范围广，易培养的优点；其产芽孢发酵培养基配方和方法简单，原料主要为农产品下脚料，价格低廉，来源广泛，菌株生长速度快，发酵温度低，发酵时间短，发酵条件易于控制，发酵芽孢产量高，减少了原料成本，降低了发酵能耗，提高了发酵生产效率，该菌株制得的菌粉具有很好的用作微生物肥料或者防治水稻纹枯病的微生物农药加工的作用。

Description

解淀粉芽孢杆菌GY30及其菌粉的制备与用途

技术领域

本发明涉及一种源自海洋的菌株，特别是一种解淀粉芽孢杆菌GY30，本发明还涉及该解淀粉芽孢杆菌GY30菌株的发酵培养方法，利用该菌株制备菌粉的方法和用途。

背景技术

解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列抗生素、抗菌蛋白或多肽等生物活性物质对动、植物病原细菌、真菌、病毒和线虫具有抑制作用，该菌在自然界分布广泛，易分离培养，生长快，稳定性较好，对人畜无毒无害，不污染环境，代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，在动、植物病害的生物防治、果蔬保鲜、及动物养殖饲料添加剂被广泛应用，也有研究报道解淀粉芽孢杆菌降解污染的废水中丁草胺、苯酚等物质、降解水华鱼腥藻，对缓解抗生素滥用现状以及发展绿色安全的种养殖业具有积极的社会学意义和重大的经济学价值，具有广阔的开发应用前景。

解淀粉芽孢杆菌已商品化，美国、德国均已制成不同制剂用于用于马铃薯黑痣病、黄瓜白粉病和稻稻瘟病等病害的防治，我国农业部于2013年为该菌颁发了100亿活芽孢/g的母药和10亿活芽孢/g可湿性粉剂生产许可证，已有产品登记销售，我国对解淀粉芽孢杆菌制剂的研究及应用已经引起重视，开展不同来源的解淀粉芽孢杆菌制剂的研究对其进一步推广和产品多样化具有重要的参考意义。

已报道的解淀粉芽孢杆菌主要来自陆源环境，而有关来自海洋的解淀粉芽孢杆菌的研究较少。海洋面积占地球的71％，海洋中蕴涵着丰富的微生物资源，随着陆地资源的贫乏，人们开始在海洋中搜寻资源，断挖掘和探索海洋中微生物资源的多样性，开发海洋药物和微生物制剂，已成为国内外研究热点，一些学者分离到很多优良菌株并应用到生物防治。越来越多研究证明，海洋细菌在病害防治方面有很大的潜力，筛选具有优良特性的海洋细菌菌株、研究海洋细菌的发酵工艺，开发微生物制剂，对于丰富生防微生物的菌种资源，开发高效无毒微生物制剂具有重要的理论和实践意义。

商品化的微生物制品主要以活菌制剂为主，芽孢杆菌的活菌制剂主要以芽孢为主要成份，发酵工艺不稳定和活菌数不高、芽孢率低是研究和生产中主要问题，因此生防菌株的产芽孢发酵能力是决定其能否被开发为微生物制剂的关键，而培养基成分、比例和发酵条件是影响菌株发酵能力的关键因素。不同来源菌株对营养需求不同，每个菌株都有独特营养需求，优化适合特定菌株的发酵培养基和条件是开发应用优良菌株的基础。而现有解淀粉芽孢杆菌发酵培养基所用碳源多数是葡萄糖、蔗糖等，成本较高，而发酵条件多数仅限于实验室的摇瓶发酵，关于工业化的规模化放大研究较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，特别是生产上优良菌株较少、适应性差、培养温度较高等不足，提供一种源自海洋的耐盐、培养温度低、营养简单的新的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY30菌株CGMCC NO.14480。

本发明所要解决的另一个液体发酵芽孢产量低、培养基成分、复杂成本高的技术问题，供述了前述源自海洋的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY30菌株芽孢产量高的液体发酵培养方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是根据现有解淀粉芽孢杆菌制剂种类少、以及其制剂中芽孢含量低的不足，提供利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY30菌株制备芽孢含量高的菌粉的方法。

本发明所要解决的再一个技术问题提供了解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GY30菌粉的用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY30菌株，其特点是，其保藏号为：CGMCCNO.14480。

本发明所涉及的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY30菌株，已于2017年7月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏号为：CGMCC NO.14480，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355。

本发明还公开了前述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株的产芽孢发酵培养方法，其特点是，其步骤如下：

(1)将GY30菌株接种到PDA培养基斜面上活化培养18h，在无菌条件下用接种环挑取GY30菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180 r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁹个细胞/mL，作发酵用一级种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L；

(2)将一级种子液接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，32℃，180r/min发酵培养12-14h，制备成二级种子液；发酵培养基配方为：米糠0.2％，花生饼粉1.5％，无机盐NaCl 0.025％，MnSO₄0.025％，pH7.0。

(3)将二级种子液按接种量为5％-10％接种于装有产芽孢发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为140～180r/min，在0～12h时通气量为14m³/h，12h后通气量调整为30m³/h，发酵时间为36～44h，发酵温度30℃～32℃，得发酵液；产芽孢发酵培养基配方为：米糠0.2％，花生饼粉1.5％，无机盐NaCl 0.025％，MnSO₄0.025％，pH7.0。

本发明还公开了利用所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特点是，其步骤如下：将解淀粉芽孢杆菌GY30菌株在发酵罐中按以上技术方案所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用硅藻土为载体，并增加氯化钙和磷酸氢二钠进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到GY30菌粉。

以上所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其进一步优选的技术方案是：产芽孢发酵培养得到的发酵液温度降低20℃以下后将载体硅藻土缓慢加入到发酵液中，搅拌速度为150r/min，加完后继续搅拌30min，静置1-2h；

吸附过程中按发酵液体积的2％加入氯化钙，按体积的3％加入磷酸氢二钠；

氯化钙先和磷酸氢二钠分别用少量热水溶解，搅拌转速为100r/min，完全溶解，溶液温度降到40℃后，分别加入到载体吸附的发酵液中，继续搅拌20min，转速150r/min，后静置30-60min；

吸附絮凝好的GY30菌株发酵液转入板框压滤机中，利用压力将发酵液压缩进300目的筛布中，发酵液中的水挤压出后，再通过空气压缩机吹入空气，使板框内部压力达到0.3MPa，连续吹10min，干燥至含水量低于10％，得到GY30菌粉。

本发明还公开了一种利用前述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特点是，其步骤如下：将解淀粉芽孢杆菌GY30菌株在发酵罐中按以上技术方案所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用皂土为助干剂进行喷雾干燥，得到GY30菌粉。

以上所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其进一步优选的技术方案是：皂土的用量为发酵液7％，喷雾干燥时喷雾塔进风温度为160℃。

本发明还公开了利用前述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其进一于，其步骤如下：将解淀粉芽孢杆菌GY30菌株在发酵罐中按以上技术所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用稻壳粉为载体吸附干燥，至含水量低于10％，过100目筛即得GY30菌粉。

以上所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其进一步优选的技术方案是：稻壳粉与发酵液的质量体积比为1∶1。

本发明方法所制得的发酵液、GY30菌粉可以作为有效成份在用于制备防治水稻纹枯病的药物或者药物组合物。也可以作为有效成份用于制备微生物肥料。

本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株是分离自黄海海域海泥中的一株对多种植物病原菌有强的抑制作用的优良菌株，该菌株抗菌范围广，发酵液的抑菌活性具有较好稳定性，具有广阔的生防应用前景。本发明根据现有关于解淀粉芽孢杆菌主要来源于陆源环境、抗逆性差、产芽孢发酵水平低和培养基成本高、产量低等不足，以农产品下脚料作为碳源、氮源，进行液体发酵产芽孢培养基和发酵条件优化，筛选生物相容性好的载体，制备以芽孢为主要成分的菌粉母药，为生物农药和生物肥料的生产提供更广泛廉价的配方和生产方法。以下是发明所做的相关的实验及其结果。

1材料与方法

1.1供试菌株

本公司在连云港海域采集大量海水、海泥、海洋动植物等样品，采用平板涂布法分离菌株，通过平板对峙法和牛津杯法测定不同菌株的抑菌活性进行筛选，从海水样品里得到了1株抗菌活性强的优良菌株，标记为GY30菌株，该菌株由中国普通培养物保藏管理中心鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)并保藏于该中心，保藏号为CGMCCNO.14480。

小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporiumf.sp.Cucumerinum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctorzia solani)等13种植物病原真菌由中国农科院植物保护研究所土传病害实验室提供。

1.2培养基

(1)病原真菌培养及抑菌试验用培养基：PDA培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml)；

(2)GY30菌株种子液制备和发酵培养基(PD)：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L。

1.3 GY30菌株对病原真菌的的抑菌作用

1.3.1 GY30菌株对不同病原菌真菌的抑菌作用测定

采用对峙培养法，将活化的直径5mm的供试病原真菌的菌苔接种于PDA平板中央，在距离平板边缘2.5cm处对称划线接GY30菌株，28℃培养3-5d，待空白对照真菌长满，观察抗菌作用结果，采用十字交叉法测量GY30菌株的抑菌带宽度。

1.3.2 GY30菌株发酵液对病原真菌的抑菌作用

1.3.2.1 对真菌菌丝生长的抑制作用

将GY30菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取GY30菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁹个细胞/mL，作发酵用种子液。

将种子液按6％的接种量接入到装有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，pH7.0，28℃，180r/min振荡培养36h，4℃、12000r/min条件下离心20min去掉菌体，上清液经孔径0.22μm的细菌过滤器过滤，即为无菌发酵液。

在PDA平板中央接种直径为5mm的不同病原菌菌苔，距培养皿边缘15mm处，对称打直径为5mm的孔，每个孔内加入200μl GY30菌株的无菌发酵液，25℃恒温培养4d后，观察病原真菌的菌落生长状况，测量抑菌带宽度。

1.3.2.2对植物病原菌孢子萌发的抑制作用

分别用5mL发酵培养基洗下培养5d的菠菜早疫病菌(Alternaria solani)菌落和小麦根腐病菌菌落，4层纱布过滤除去菌丝，得到分生孢子悬浮液。取0.5mL的分生孢子液和0.5mL制备好的GY30菌株无菌发酵液混匀配制孢子悬浮液，浓度为每毫升1×10⁶个孢子，放在无菌试管中，28℃下黑暗恒温保湿培养，每隔1h取样观察孢子萌发情况，计算萌发率，，直到对照组孢子萌发率达90％以上，测量芽管长度，以发酵培养基为对照。

1.4 GY30菌株的耐盐性测定

把培养18h的GY30菌株接种到装60mL不同盐浓度(2％、5％、7％和10％)PD液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养24h，发酵液进行梯度稀释，取0.2ml稀释液涂布于PDA培养基平板上，28℃培养36h，观察计算不同盐浓度发酵液的菌落数。

1.5海洋解淀粉芽孢杆菌GY30菌株产芽孢培养基的筛选

1.5.1基础培养基筛选

将GY30菌株种子液分别接种到8种不同培养基中进行发酵(表1)，发酵的基本条件为250mL三角瓶装60mL培养基，pH7.0、接种量10％、28℃、180r/min摇床培养48h，每种培养基为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，分别测定GY30菌株在不同培养基中发酵液的细菌数和芽孢产率。细菌数的测定采用血球计数板法。芽孢产率的测定采用结晶紫染色法。

表1供试培养基及其配方

1.5.2海洋解淀粉芽孢杆菌GY30菌株产芽孢培养基优化的单因素试验

1.5.2.1氮源种类的筛选

分别用等量的胰蛋白胨、硫酸铵、酵母粉、牛肉膏、花生饼粉、尿素等不同氮源代替基础培养基中的氮源，培养基中其它成分不变，以基础培养基作为对照，每种氮源为一个处理，每个处理接种3瓶为3次重复，按1.5.1的发酵条件要求进行摇瓶发酵，测定不同氮源发酵液的细菌数和产芽孢率。

1.5.2.2氮源浓度的筛选

根据筛选出的最佳氮源，在GY30菌株产芽孢基础培养基中加入不同浓度的最佳氮源配制不同氮源浓度的培养基，接种GY30菌株种子液，按1.5.1的发酵条件进行发酵，测定不同浓度氮源发酵液的细菌数和产芽孢率。

1.5.2.3碳源种类的筛选

分别用等量的麦芽糖、麸皮、葡萄糖、米糠、玉米粉等不同碳源代替筛选出的GY30菌株产芽孢基础培养基中的碳源，培养基其它成分不变，每种碳源为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，以基础培养基作为对照组，按1.5.1的发酵条件要求进行发酵，测定不同碳源发酵液的细菌数和产芽孢率。

1.5.2.4碳源浓度的筛选

配制最佳碳源不同浓度加入到GY30菌株产芽孢基础培养基中，制成碳源浓度不同的培养基，按1.5.1的发酵条件进行发酵，测定不同碳源浓度发酵液的细菌数和产芽孢率。

1.5.2.5无机盐种类的筛选

分别用等量的氯化钙、碳酸钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸锌、氯化钠、硫酸锰、氯化镁等不同种类的无机盐来代替GY30菌株产芽孢基础培养基中的无机盐，其他成分不变，每种无机盐为一个处理，每个处理接种3瓶为3次重复，按1.5.1的发酵条件进行发酵试验。测定不同无机盐发酵液的细菌数和芽孢产率。

1.5.2.6无机盐浓度的筛选

在GY30菌株产芽孢基础培养基中加入不同浓度的筛选出的无机盐，配制成无机盐浓度不同的培养基，接种GY30菌株种子液，按1.5.1的发酵条件进行发酵，测定不同浓度无机盐发酵液的细菌数和芽孢产率。

1.5.3海洋解淀粉芽孢杆菌GY30菌株产芽孢培养基优化正交试验

将筛选到的最佳碳源、氮源、无机盐按正交试验表中相应的因素和水平设计进行正交试验。按1.5.1的发酵条件进行发酵试验，测定细菌数及芽孢产率。以细菌数多、芽孢产率高的组合作为GY30菌株产芽孢的最佳培养基配方。

1.6海洋解淀粉芽孢杆菌GY30菌株摇瓶发酵条件优化

1.6.1产芽孢的时间曲线

将GY30菌株种子液接种到优化的GY30菌株产芽孢培养基中进行发酵，每4h取样，待到产芽孢后改为2h取样，测定不同培养时间发酵液的细菌数和芽孢产率，以时间为横坐标，菌体数目和芽孢率为纵坐标绘制时间曲线。

1.6.2发酵初始pH值的优化

用1M HCl或1M NaOH调节优化的GY30菌株产芽孢培养基的pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将GY30菌株种子液接种到不同pH值的GY30培养基中进行发酵，每个pH值为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，测定GY30菌株发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的pH值作为发酵初始pH值。

1.6.3温度的优化

在发酵时间优化和发酵初始pH值优化的基础上，将GY30菌株种子液接种到优化的GY30菌株产芽孢培养基后进行发酵试验。发酵温度分别为：24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，每个温度为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，测定GY30菌株发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵温度作为最佳发酵温度。

1.6.4接种量的优化

在时间、温度和初始pH值筛选试验结果的基础上，将菌株GY30菌液分别按4％、6％、8％、10％、12％5个接种量接种到优化的GY30菌株产芽孢培养基中进行发酵试验，每种接种量为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复。测定发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵接种量作为最佳发酵接种量。

1.6.5装液量的优化

在时间、温度、初始pH值和接种量筛选试验结果的基础上，将菌株GY30菌液分别接种于装有30mL、50mL、60mL、90mL、110mL优化的GY30菌株产芽孢培养基的250mL三角瓶中进行发酵试验，每种装液量为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，测定发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵装液量作为最佳发酵装液量。

1.6.6转速的优化

在时间、温度、初始pH值、接种量和装液量筛选试验结果的基础上，将GY30菌株种子液接种到优化的GY30菌株产芽孢培养基上进行发酵试验。转速为140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min，每个转速处理为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复。测定发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵转速作为最佳发酵转速。

1.6.7 GY30菌株产芽孢培养基摇瓶发酵条件优化验证试验

分别采用优化前的和优化后的培养基和摇瓶发酵条件对GY30菌株进行发酵试验。测定两者发酵液的细菌数和芽孢产率，并进行对比。

1.6.8优化的菌株GY30产芽孢培养基配方特异性验证

将优化的培养基配方与另外3种培养基分别记为1、2、3、4号培养基，配方见表2。将菌株GY30与另外一株的海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1-1菌株和海洋多粘类芽孢杆菌GY40分别接种到4种培养基中，以优化后的发酵条件进行发酵，比较3个菌株在不同配方培养基配方中的菌体数量和芽孢率。

表2验证试验对比培养基及配方

1.7海洋解淀粉芽孢杆菌GY30菌株产芽孢发酵工艺扩大

采用优化出的发酵培养基，根据优化的摇瓶发酵条件，GY30菌株在500L和1吨发酵罐中在不同温度、接种量和物料浓度条件下进行发酵，比较不同条件下的菌体数目和产芽孢率。

1.7.1 500L发酵罐发酵

将活化好的GY30菌株分别接入装有60mLPD培养液的250mL三角瓶中，32℃，180r/min条件下培养16h，即为一级种子液，将一级种子液按10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，32℃，180r/min发酵培养12-14h，调整浓度为10⁹个细胞/mL制备成二级种子液。

500L发酵罐中装发酵培养基300L，加入消泡剂，调节pH值到7.0。高温高压灭菌20min，降温至32℃，按6％的接种量接入种子液。设置温度为32℃，转速为150r/min，通气量为6m³/h进行发酵。从发酵开始每隔4h取连续取样至发酵结束，测定样品中的菌量和芽孢率。

1.7.2 GY30菌株在1吨发酵灌中的发酵

基本条件为装量400L、初始pH值为7.0、初始搅拌速度为150r/min，发酵初期通气量为14m³/h，随着发酵液中菌体数目的增加加大通气量，接种量为6％、发酵温度分别为30℃和32℃，在接种量10％的条件下增加培养基中的不同物料种类增加20％。每隔4h连续取样测定发酵液的总菌量和芽孢率。

1.8海洋细菌GY30菌株菌粉的制备

1.8.1载体的筛选

(1)不同载体与海洋细菌GY30菌株生物相容性测定

250ml的三角瓶中加入50ml的含4％助剂的PD培养基，接种海洋细菌GY30菌株的种子液2ml，28℃，160r/m的摇床中培养24h，采用平板菌落计数法测定发酵液中的活菌数，以不添加助剂的为对照，比较不同载体对GY30菌株生长的影响。

(2)载体对海洋细菌GY30菌株吸附量的测定

选取生物相容性好的载体各2g分别放入到100ml的烧杯中，缓慢向填充剂中滴加海洋细菌GY30菌株的发酵液，用玻璃棒搅拌至填充剂粉末开始聚成团状而不分散时停止添加，记录滴加到填充剂中的海洋细菌GY30发酵液的量，测定不同载体对海洋细菌GY30的饱和吸附量。每种载体3个重复。

1.8.2菌粉的制备

选择不同的载体，分别制备适合加工成生物农药和生物肥料的母药粉剂。

(1)板框过滤法：根据载体筛选实验结果对发酵液进行吸附。

发酵液温度降低20℃以下后将载体按计算好的用量缓慢加入到发酵液中，搅拌速度为150r/min，加完后继续搅拌30min，静置1-2h。

吸附过程中按发酵液体积的2％加入氯化钙，按体积的3％加入磷酸氢二钠。

氯化钙先和磷酸氢二钠分别用少量热水溶解，搅拌转速为100r/min，完全溶解，溶液温度降到40℃后，分别加入到载体吸附的发酵液中，继续搅拌20min，转速150r/min，后静置30-60min。

吸附絮凝好的GY30菌株发酵液转入板框压滤机中，利用压力将发酵液压缩进300目的筛布中，发酵液中的水挤压出后，再通过空气压缩机吹入空气，使板框内部压力达到0.3MPa，连续吹10min左右，板框过滤后的样品测定含水量和芽孢含量，干燥至含水量低于10％，得到GY30菌粉，测定芽孢含量。

(2)喷雾干燥法：

助干剂种类和进风温度对GY30菌株菌粉形成的影响

将筛选出的与GY30菌株生物相容性好、吸附量高的载体作为助干剂，按质量体积比与发酵液混合均匀后过100目筛，分别在110℃、120℃、140℃、160℃、180℃、200℃的进风温度下进行喷雾干燥，出口温度随进口温度机器自动调节，观察喷雾干燥后的成粉状态，记录出口温度，测定菌粉含水量，采用平板菌落计数法测定菌粉的菌落数，计算菌体成活率。选择成粉状况好、菌体成活率高的助干剂和进风温度作为喷雾干燥的条件。

助干剂用量对GY30菌株菌粉形成的影响

将筛选出的适合的助干剂设置不同用量，添加到发酵液中，在筛选出的适合的进风温度下进行喷雾干燥，测定所形成菌粉的菌体存活率和含水率，选择活菌率高含水量低的助干剂含量作为GY30菌株菌粉制备的助干剂用量。

C2：每g菌粉中的活菌数

M：菌粉的重量

V：用于喷雾干燥的发酵液体积

C1：用于喷雾干燥的每ml发酵液中的活菌数

选择成粉状况好、菌体成活率高的载体和进风温度作为喷雾干燥制备菌粉的条件。

(3)稻壳粉为载体吸附干燥

将稻壳粉与发酵液按质量体积比1∶1的比例加入发酵液中，完成吸附干燥至含水量低于10％，过100目筛即为菌粉，记为GY30D，用稀释涂布的方法检测菌粉的含菌量。

1.9 GY30菌株菌粉对2种植物病原真菌的毒力测定

采用含药平板法。将制备得到的GY30菌株菌粉按不同质量加入到装有70mL PDA培养基的250ml的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个培养皿中，为3个重复，以无菌水为对照。取直径为5mm的供试水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌菌苔于不同浓度的含药平板中央，28℃下培养5d。采用十字交叉法测量植物病原菌菌落直径，计算抑制率，建立GY30菌株菌粉对2种植物病原真菌的毒力回归方程，计算EC₅₀和EC₉₀。

1.10 GY30菌株菌粉对水稻生长的促进作用和对水稻纹枯病的防治作用

试验在连云港市东海县石榴街道麻汪村三组东湖进行，连续多年种植水稻，为水稻纹枯病常发区，前茬作物为小麦，水稻品种为连粳七号。

5月16日菌粉浸种、拌土处理，5月19日播种，正常施肥灌水等田间管理，观察记录出苗和秧苗生长状况，适时移栽插秧。

1.10.1浸种

选适合种子处理的菌粉加水稀释500倍，放入水稻种子浸种催芽静置48h。用量为药种比为1∶100，每个处理播种60m^2，。

1.10.2拌土

水稻播种前，菌粉与苗床土(营养土)按1比200的比例混匀后播种，播种菌粉处理过的水稻种子。混合前先用少量水将菌粉吸水湿润24h，再与土壤混合。

以壮秧剂拌营养土和空白基质为对照，分别播种浸种处理及其对照的水稻种子，每个处理播种60m²。

1.10.3蘸根

菌粉加水稀释500倍，静置24h，水稻秧苗移栽前秧苗根系在其中浸蘸30min，以不蘸根为对照，移栽后正常管理，观察植株生长情况。每个处理移栽面积60m²。

1.10.4喷雾

喷雾干燥和板框过滤制成的菌粉加入不同助剂制成有效含量为10¹⁰CFU/g的可湿性粉剂，设置不同用量进行田间试验，采用随机区组设计，在发病前或发病初期均匀喷雾于水稻茎基部，每隔7d用药一次，连续用药3次。每个用量为一处理，每个用量3个重复，以20％井岗霉素水剂为对照，每个小区25m²。最后一次喷药后7d调查发病率和病情指数，收获时测定产量，计算防病效果和保产率。

水稻纹枯病分级标准：0级，全株无病；1级，第3片叶以下各叶鞘或叶片发病(自顶叶算起，下同)；2级，第2叶以下各叶鞘或叶片发病；3级顶叶叶鞘或叶片发病；4级，全株发病，提早枯死。

2结果与分析

2.1 GY30菌株及其无菌发酵液的抑菌作用和耐盐性测定结果

2.1.1对菌丝生长的抑制作用

GY30菌株及其发酵液对13种供试植物病原菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，对供试的水稻纹枯病菌等10种植物病原真菌的抑菌带宽度达20mm以上，发酵液对8种病原真菌的抑菌带宽度达20mm以上。其中对水稻纹枯病菌、番茄早疫病菌、小麦根腐病菌的抑制作用最强。表明GY30菌株及其发酵液具有较强的抑菌作用和较广的抑菌谱。结果见表3。

表3 GY30菌株及其发酵液的抑菌谱测定结果抑菌带宽度(mm)

2.1.2菌株GY30无菌发酵液对植物病原真菌孢子萌发作用的抑制作用

GY30菌株的无菌发酵液对番茄早疫病菌和小麦根腐病菌的孢子萌发有较强的抑制作用。对照组的孢子萌发较快，孢子萌发率随时间迅速提高，5h小麦根腐病菌和番茄早疫病菌孢子的萌发率分别达到91.24％和96.89％。GY30菌株无菌发酵液处理的小麦根腐病菌和番茄早疫病菌孢子萌发率明显低于对照组，萌发速度较慢，5h后孢子的萌发率为分别为35.90％和58.00％。结果见表4。

表4 GY30菌株无菌发酵液对2种真菌孢子萌发的影响

GY30菌株无菌发酵液不仅使小麦根腐病菌和番茄早疫病菌的孢子萌发率降低，同时也能抑制孢子芽管的生长，结果见表5。GY30菌株无菌发酵液处理的孢子芽管生长缓慢，处理5h后小麦根腐病菌和番茄早疫病菌的芽管长度分别为41.57μm和10.05μm，而对照组孢子芽管生长速度变快，5h小麦根腐病菌和菠菜早疫病菌孢子的芽管长度分别达到了175.78μm、25.97μm。

表5 GY30菌株无菌发酵液对小麦根腐病菌和番茄早疫病菌分生孢子芽管长度的影响

2.1.3菌株GY30耐盐性测定结果

菌株GY30在不同盐度条件下发酵液中菌落数不同，盐浓度为3％，发酵液的菌落数最高，为3.6×10⁹cfu/mL，随着盐浓度提高，菌落数减少，盐度为5％时菌落数为2.3×10⁸cfu/mL，盐浓度为10％仍能生长，发酵液的菌落数为1.2×10⁸cfu/mL，说明GY30菌株具有较高的耐盐性，结果见表6。

表6 GY30菌株耐盐性试验结果

2.2 GY30菌株产芽孢培养基优化

2.2.1基础培养基的筛选

由图1可知，GY30菌株应用6号培养基进行发酵得到的发酵液细菌数和芽孢产率最高，分别为2.5×10⁹个细胞/mL和82.33％，其次是7号培养基，发酵液的细菌数和芽孢率分别为2.25×10⁹个细胞/mL和81％。8号培养基，发酵液的细菌数和芽孢率最低，分别为1.72×10⁹个细胞/mL和74.33％。所以将6号培养基作为GY30菌株的产芽孢基础发酵培养基。

2.2.2产芽孢发酵培养基优化单因素试验

(1)碳源种类筛选

由图2所示，GY30菌株在6号米糠为碳源的培养基中细菌总数和芽孢率最多，分别为2.85×10⁹个细胞/mL和88.33％，其次是以1号为碳源的基础培养基，细菌总数为2.65×10⁹个细胞/mL，芽孢产率82％。因此，选择6号米糠作为产芽孢培养基的最优碳源。

(2)碳源浓度筛选

由图3可见，碳源的浓度在0.15％～0.25％时，细菌总数和芽孢产率随浓度增加不断增加，碳源浓度为0.25％时达到最高，分别为2.7×10⁹个细胞/mL和91％；浓度超过0.25％时，细菌总数和芽孢产率开始下降，所以选择0.2％、0.25％、0.3％为正交试验的碳源浓度的3个水平。

(3)氮源种类筛选

由图4可见，以1号氮源花生饼粉为氮源的培养基的细菌总数和芽孢产率最高，分别为2.73×10⁹个细胞/mL和86.67％，其次是6号氮源豆饼粉培养基，细菌总数为1.97×10⁹个细胞/mL，芽孢产率为76.33％，4、7号为氮源的GY30菌株发酵液芽孢产率较低。因此，选择1号花生饼粉作为产芽孢发酵培养基的氮源。

(4)氮源浓度筛选

由图5可见，氮源的浓度在0.5％～1.5％时，随浓度增加细菌总数明显增加，芽孢产率较稳定；浓度为1.5％时，细菌总数最高，达2.73×10⁹个细胞/mL，芽孢产率为92.67％；浓度高于2.5％时，细菌总数和芽孢产率开始下降，因此选择1％、1.5％、2％作为正交试验氮源的3个浓度水平。

(5)无机盐种类筛选

由图6可知，GY30菌株在添加7号(NaCl+MnSO₄)无机盐的培养基中发酵，其细菌总数和芽孢产率达到最高，分别为2.77×10⁹个细胞/mL和86.67％，添加13号无机盐的发酵液细菌总数最少为1.17×10⁹个细胞/mL，选择7号无机盐(NaCI+MnSO₄)为GY30菌株产芽孢发酵培养基的无机盐。

(6)无机盐浓度筛选

由图7所示，无机盐的浓度在0.01％～0.05％时，随浓度增加细菌总数逐渐增加，芽孢产率无明显差别，无机盐浓度为0.05％时，细菌总数最高为2.9×10⁹个细胞/mL，芽孢产率为78％，浓度超过0.05％时，细菌总数和芽孢产率明显下降。综合考虑，选择0.02％、0.05％、0.1％三个浓度作为正交试验无机盐浓度的3个水平。

2.2.3产芽孢发酵培养基优化的正交试验

正交试验结果表明，极差值为R_B＞R_c＞R_A，表明影响发酵的因素顺序为B＞C＞A，即氮源的影响最大，其次是无机盐，最后是碳源。由均值K得到的最佳组合是2号试验组合A₁B₂C₂，其细菌总数和芽孢率均最高分别为4.17×10⁹个细胞/mL和88.33％。结果见表7和图8。

表7 GY30菌株发酵培养基正交试验设计L₉(3³)及试验结果

因此确定产芽孢发酵培养基配方为：米糠0.2％，花生饼粉1.5％，无机盐0.05％(NaCl 0.025％，MnSO₄0.025％)。

2.3产芽孢摇瓶发酵条件的优化

2.3.1接种量

实验结果表明，摇瓶接种量对GY30菌株的细菌总数和芽孢产率有明显的影响，接种量为6％时发酵液的细菌总数和芽孢率最高，分别为4.18×10⁹个细胞/mL和85.33％。随接种量的增大细菌总数和芽孢产率减少。因此GY30菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳接种量为6％。

2.3.2 pH值

实验结果表明，pH5～7时细菌总数和芽孢产率随pH增大而增大，在pH7时的细菌总数和芽孢率最高，分别为4.48×10⁹个细胞/mL 84.33％，pH大于7时，细菌总数和芽孢产率下降。所以，GY30菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳pH为7。

2.3.3发酵时间

如图9所示，在0～4h时细菌总数增加缓慢为迟滞期，4h后细菌总数快速增加进入对数生长期，28h细菌总数达到最高，进入稳定期此时芽孢开始形成，32h后芽孢快速增长，到52h细菌总数开始下降，进入衰退期，此时芽孢率达到最大值为91.33％。因此GY30-2菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳发酵时间为52h。

2.3.4装液量

实验结果表明，装液量为30～60mL时，随装液量增多细菌总数和芽孢率增加，装液量在60mL时细菌总数和芽孢率最高，分别为4.98×10⁹个细胞/mL和91.67％，装液量大于60mL时细菌总数减少。因此将60mL作为GY30菌株的摇瓶产芽孢发酵的装液量。

2.3.5温度

由图10所示，发酵温度在24℃～30℃之间，随温度上升细菌总数和芽孢产率增加，30℃时细菌总数和芽孢率均达到最高，分别为5.37×10⁹个细胞/mL和90.67％，高于30％时细菌总数和芽孢产率明显下降，因此，GY30菌株的摇瓶产芽孢发酵最适温度为30℃。

2.3.6摇床转速

实验结果表明，当转速为140～180r/min时，随着转速增大，细菌总数和芽孢产率增加，180r/min时细菌总数和芽孢产率最高，分别达到5.68×10⁹个细胞/mL和92.33％。超过180r/min细菌总数和芽孢产率明显下降。因此，180r/min为GY30菌株摇瓶产芽孢发酵最佳摇床转速。

综合GY30菌株摇瓶发酵条件优化结果，认为该菌株摇瓶发酵的最佳条件为：接种量6％，pH为7，温度为30℃，摇床转速为180r/min，在优化的培养基和发酵条件下，细菌总数和芽孢率分别达到5.68×10⁹个细胞/mL和92.33％，高于已报道的解淀粉芽孢杆菌的发酵水平。

2.4 GY30菌株产芽孢培养基和摇瓶发酵条件优化验证试验

由图11所示，A是GY30菌株在基础培养基和最初始酵条件下发酵结果，B是GY30菌株在优化过后的培养基和发酵条件下的发酵结果，B的发酵液细菌总数和芽孢产率分别为5.6×10⁹个细胞/mL和91.67％，A的发酵液细菌总数和芽孢产率分别为2.37×10⁹个细胞/mL和87％，GY30菌株在优化后的培养基和发酵条件下发酵液的细菌总数和芽孢率明显提高。

2.5优化的菌株GY30产芽孢培养基配方特异性验证

实验结果表明，3个菌株在3种不同培养基及其不同发酵条件下的细菌总数及其芽孢率都明显不同，GY30菌株在优化后的培养基中细菌总数和芽孢产率最高，分别为5.78×10⁹个细胞/mL和93.33％，表明GY30菌株最适合的产芽孢发酵培养基为1号优化培养基。海洋细菌GM-1-1菌株在2号培养基与发酵条件下进行发酵，细菌总数和芽孢产率最高，分别为6.1×10⁹个细胞/mL和89％，海洋多黏类芽孢杆菌GY40菌株在3号培养基中细菌总数和芽孢产率最高，分别为3.83×10⁹个细胞/mL和100％，表明不同种类的细菌或同一种类的不同菌株其产芽孢的发酵培养基和培养条件有所不同，发酵培养基和培养条件具有菌株的特异性。

2.6 GY30菌株产芽孢发酵工艺的放大

2.6.1 GY30菌株在500L发酵罐中的发酵结果

GY30菌株在32℃条件下发酵0-8h发酵液中细胞总量增加缓慢，为迟滞期，8h时后菌量迅速增加，进入对数生长期，发酵罐中产生泡沫，20h时菌体数目增加缓慢，进入稳定前期，菌体开始形成芽孢，36h时菌体数目达到最高，菌量达到1.16×10¹⁰个/mL，且菌体大量形成芽孢，芽孢率达85％。结果见图12。

2.6.2 GY30菌株在1吨发酵罐中的发酵结果

在1吨发酵罐中GY30菌株在不同温度下发酵水平明显不同。30℃条件下，GY30菌株0-16h内发酵液中菌体数目增加较少，为迟滞期，16-44h菌体数目增加较快，为对数生长期，44h菌体数目达到最高，为1.2×10¹⁰个/mL，其后进入稳定期。36h开始形成芽孢，其后芽孢率快速增加，44h时达到最高，为91％。

32℃条件下，GY30菌株0-8h内发酵液中菌体数目增加较少，为迟滞期，8h后菌体数目快速增加进入对数生长期，36h菌体数目达到最高，为1.2×10¹⁰个/mL，其后进入稳定期。32h开始形成芽孢，40h时芽孢率达91％。结果见图13。

结果表明，发酵温度提高到32℃迟滞期由16h缩短到8h，稳定期由44h提前到36h，芽孢形成由36h提前到32h。结果表明，32℃发酵有利于缩短周期，但菌体总数无明显变化。提高温度可以缩短发酵时间，但细菌总数和芽孢率并未增加。

2.7 GY30菌株菌粉的制备

2.7.1载体的筛选

不同载体与海洋细菌GY30菌株都有较好的生物相容性，添加载体的发酵液平板菌落计数均大于空白对照组，添加硅藻土的发酵液活菌含量最高，为4.68×10⁹cfu/g，其次是皂土，发酵液含菌量为3.35×10⁹cfu/ml。

不同载体对海洋细菌GY30菌株发酵液的吸附效果不同，硅藻土、皂土的吸附量较高，分别为1.85ml/g、1.36ml/g，其次是可溶性淀粉、玉米淀粉和稻壳粉，结果见表8。可选择硅藻土、皂土、稻壳粉作为GY30菌株制备不同用途粉剂的载体。

表8添加不同载体海洋细菌GY30菌株发酵24h的菌落数及其吸附量

2.7.2 GY30菌株不同菌粉的制备

(1)板框过滤法

根据不同载体与GY30菌株的生物相容性及其吸附性能测定结果，选择硅藻土作为板框过滤制备菌粉的载体。GY30菌株发酵液经过硅藻土絮凝处理后，板框过滤得到的菌泥的含菌量为58.5×10¹⁰cfu/g，含水量59.83％，菌泥干燥后得到菌粉，将干燥后的菌粉采用平板菌落计数法测定菌粉的含菌量为81.2×10¹⁰cfu/g，含水量为5.68％，记为GY30G。结果见表9。本试验所制备的解淀粉芽孢杆菌的菌粉GY30G含菌量明显高于已报道的解淀粉芽孢杆菌菌粉的菌体含量。

表9 GY30菌株菌粉制备检测结果

(2)喷雾干燥法

不同助干剂和进风温度对喷雾干燥后菌粉中菌体存活率的影响

将筛选出的与GY30菌株相容性和吸附性比较好的载体皂土、硅藻土、玉米淀粉和可湿性淀粉作为助干剂与GY30菌株发酵液混合，在不同的进风温度下进行喷雾干燥，观察样品的成粉情况发现，以皂土和硅藻土为助干剂时，干粉收集量较多，跑粉较少，温度为110℃时样品在喷雾塔周围粘壁较多，成粉较差，温度高于120℃时成粉状态较好；以玉米粉和可溶性淀粉为助干剂时，干粉收集量较少，跑粉严重。

喷雾干燥选用的助干剂种类和进风温度对GY30菌株成粉状况、菌体存活率和水分含量有明显影响，不同助干剂在相同的进风温度下菌体存活率和含水量不同，供试的4种助干剂中，硅藻土在140℃以下时菌体存活率最高，其次是皂土，但140℃以下时菌粉含水量均高于6％，进风温度为160℃时菌粉含水量低于6％，但所形成的菌粉中菌体存活率明显不同，皂土作为助干剂的菌粉活菌率明显高于硅藻土，温度高于160℃时菌粉中的活菌数下降结果见表10。

因此认为适合GY30菌株采用喷雾干燥法制备菌粉的适合助干剂为皂土，进风温度为160℃。

表10不同助干剂和进风温度喷雾干燥后菌粉中菌体存活率和水分含量

助干剂皂土的添加量对菌体存活率和含水量的影响

助干剂皂土的添加量不同，对所形成的菌粉菌体存活率有明显影响，皂土添加量在3％-7％时随着皂土添加量的增加菌粉中菌体存活率提高，7％时存活率最高，为45.8％，添加量为8％时菌体存活率下降。助干剂皂土的添加量对所形成的菌粉的含水量有一定影响，但供试的所有添加量所形成的菌粉其含水量都低于国家标准要求的6％。皂土添加量在3％-6％时随着皂土添加量的增加菌粉中含水量有所增加，皂土添加量为6％时菌粉含水量最高为5.95％，皂土添加量为7％和8％时菌粉含水量下降为4.95％。综合实验结果认为GY30菌株发酵液采用喷雾干燥法制备菌粉时助干剂皂土的添加量为7％。结果见图14。

综合上述试验结果认为GY30菌株采用喷雾干燥法制备菌粉的条件为：皂土作为助干剂，用量为7％，喷雾塔进风温度为160℃。

综合以上结果认为GY30菌株通过喷雾干燥制备菌粉的条件为：皂土为助干剂，添加量为7％，进风温度为160℃。所制备的菌粉记为GY30Z。

(3)稻壳粉直接吸附

将稻壳粉与发酵液按质量体积比1∶1的比例加入到含菌量为1.2×10¹⁰cfu/mL发酵液中，完成吸附干燥至含水量低于10％，过100目筛得到菌粉，记为GY30D，用稀释涂布的方法检测菌粉的含菌量到达1.13×10¹⁰cfu/g。

2.8 GY30菌株菌粉对2种植物病原真菌的毒力测定结果

采用含毒介质法测定了GY30菌株通过喷雾干燥制备的菌粉GY30Z和板框过滤法制备的菌粉GY30G对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌的毒力。

2.8.1对水稻纹枯病菌的毒力测定

在1-500μg/L浓度范围内GY30菌株菌粉GY30G的浓度对数与对水稻纹枯病菌的抑菌率几率值呈直线关系，结果见表11。计算其毒力回归方程为y＝0.890x+3.957，相关系数为R²＝0.889，根据该方程计算的EC50值为14.82μg/L，EC90值为407.29μg/L。y＝0.3709x+4.4448，R²＝0.9382

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表11菌粉GY30G对水稻纹枯病菌的毒力测定结果

2.8.2对小麦赤霉病菌的毒力测定结果

在0.05-5mg/L浓度范围内GY30菌株菌粉GY30G的浓度对数与小麦赤霉病菌的抑菌率几率值呈直线关系，结果见表12。计算其毒力回归方程为y＝0.622x+5.521，相关系数为R²＝0.933，根据该方程计算的EC50值为0.1455mg/L，EC90值为16.65mg/L。

表12菌粉GY30G对小麦赤霉病菌的毒力测定结果

2.9 GY30菌株不同菌粉的促生防病效果

不同处理的水稻播种后于5月28日开始出苗，5月31日齐苗，6月19日基质直接育苗的空白对照出现叶瘟及纹枯病，6月20日GY30不同处理的试验小区补施尿素(每畦1kg)，基质直接育苗的空白对照试验小区用三环唑+井冈霉素喷雾进行防病处理。6月26日不同处理水稻幼苗用GY30D菌粉进行蘸根处理，机播移栽，行株距：28cm×12cm，茎蘖苗为1.97万穴/亩，湿润灌溉，基底肥N、P、K各15％，复合肥50kg/667m²，7.20日用尿素(含N46％)进行追施拔节孕穗肥，用量为15kg/667m²，定期考察水稻生长情况。

2.9.1 GY30菌株菌粉对水稻幼苗促生作用

以稻壳粉为载体制成的GY30D菌粉处理水稻种子和拌土处理苗床营养土，对水稻幼苗生长具有明显的促进作用，GY30D菌粉处理苗床上幼苗明显高于壮秧剂处理和空白对照，地上部生长发育较快，6月13日苗高达到了20cm，已进入2叶1心期，根部盘根较好，而壮秧剂拌土和空白对照苗高分别为14cm和10C、cm，为1叶1心期，空白对照盘根较散。6月19日空白对照出现了零星的水稻叶瘟病和纹枯病，幼苗发育较慢，叶色较浅，而GY30D菌粉处理以及壮秧剂拌土处理的幼苗地上部生长、和根部发育状态较好，叶色深绿，无病害发生。移栽后的7月8日GY30D菌粉处理以及壮秧剂拌土处理的幼苗地上部生长、和根部发育状态一致，开始分蘖，叶色正常，白根多，苗高明显高于空白对照，说明GY30D菌粉处理种子和拌土可以促进水稻幼苗的生长，并能降低苗期病害的发生，可以作为水稻育苗处理剂使用。结果见表12。说明以稻壳粉为载体的GY30D菌粉对水稻幼苗的生长具有明显的促进作用，可进一步加工为微生物肥料。

表13不同处理水稻苗高、根系及地上部生长情况

2.9.2 GY30菌株可湿性粉剂对水稻的防病保产作用

以硅藻土为载体通过板框过滤法制备的菌粉GY30G和以皂土为助干剂通过喷雾干燥制备的菌粉GY30Z添加不同的助剂制芽孢含量为10¹⁰cfu/g的可湿性粉剂，按不同用量进行田间药效试验。结果表明，不同用药量的GY30G和GY30Z可湿性粉剂以及井冈霉素田间喷雾对水稻产量构成具有一定影响，对最高茎蘖数、亩穗数和穗粒数无明显影响，对千粒重的影响较为明显，不同用药量的千粒重都明显高于空白对照，用药量40g/667m²以下千粒重高于空白对照低于井冈霉素对照，用药量为60g/667m²和70g/667m²千粒重高于空白对照和井冈霉素对照。说明其提高产量主要是通过提高水稻的干粒重而实现的。结果见表14。

表14不同浓度的GY30G和GY30Z可湿性粉剂剂田间喷雾对水稻产量构成影响

不同用药量的GY30G和GY30Z可湿性粉剂田间喷雾对水稻纹枯病都具有一定的防治效果，用药量越高防病效果越好。用药量为40g/667m²以下时防病效果低于对照20％的井冈霉素，用药量50g/667m²防病和保产效果明显与井冈霉素基本一致，无显著差异，用药量为60g/667m²和70g/667m²防病和保产效果均无显著差异。二种方法制备的菌粉加工成可湿性粉剂的防病保产效果一致。结果见表15。

表15不同浓度的GY30G和GY30Z可湿性粉剂剂田间喷雾防治水稻纹枯病田间药效试验结果

因而认为GY30G和GY30Z可湿性粉剂的田间喷雾最适用药量为60g/667m²。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点：

1、本发明提供了一种新的来自海洋的菌株，该菌株具有陆源微生物不具有的较强耐盐性，生长温度低、抑菌作用强抑菌范围广、易培养的优点；

2、本发明所提供的产芽孢发酵培养基配方简单，原料主要为农产品下脚料，价格低廉，来源广泛，菌株生长速度快，发酵温度低，发酵时间短，发酵条件易于控制，发酵芽孢产量高，减少了原料成本，降低了发酵能耗，提高了发酵生产效率，发酵生物量为1.2×10¹⁰个/mL，芽孢率达到91％以上。

3、本发明方法制得的菌粉芽孢含量高，杂菌含量低，保质期长，以硅藻土为载体通过板框过滤制备的菌粉GY30G的含菌量达81.2×10¹⁰cfu/g，含水量为5.68％，明显高于已报道菌粉的活菌数，可加工成不同的制剂。发酵液用稻壳粉为载体直接吸附制备得到菌粉GY30D活菌数达1.13×10¹⁰cfu/g。

4、本发明方法中，发酵液、菌粉GY30G和GY30Z对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌具有很好的抑制作用植。对水稻纹枯病菌菌毒力回归方程为为y＝0.890x+3.957，相关系数为R²＝0.889，根据该方程计算的EC50值为14.82μg/L，EC90值为407.29μg/L。对小麦赤霉病菌的毒力回归方程为y＝0.622x+5.521，相关系数为R2＝0.933，根据该方程计算的EC50值EC50值为0.1455mg/L，EC90值为16.65mg/L。

5、菌粉GY30D通过种子处理、拌土和蘸根处理，对水稻幼苗生长具有明显的促进作用，可进一步加工成微生物肥料用于水稻的种植。以菌粉GY30G和GY30Z为主要成份制备的可湿性粉剂田间喷雾对水稻纹枯病的防效达75％以上，高于生产上防治水稻纹枯病的特效药井冈霉素的效果，并具有保产作用，可以用于加工各种剂型的微生物农药用于水稻纹枯病的防治。

附图说明

图1为GY30菌株在不同产芽孢培养基中的细菌总数和芽孢产率图；

图2为不同碳源的GY30菌株发酵液细菌总数和芽孢产率图；其中：注：1蔗糖、2麦芽糖、3麸皮、4葡萄糖、5玉米粉、6米糠；

图3为不同碳源浓度下GY30菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率图；

图4为不同氮源中的GY30菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率图；其中：注：1花生饼粉、2胰蛋白胨、3硫酸铵、4酵母粉、5牛肉膏、6黄豆饼粉、7尿素；

图5为不同浓度氮源下GY30菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率图；

图6为不同无机盐的GY30菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率图；其中：1MnSO₄+MgCl₂、2CaCl₂+MnSO₄、3CaCO₃+MnSO₄、4KH₂SO₄+MnSO₄、5K₂HSO₄+MnSO₄、6ZnSO₄+MnSO₄、7NaCl+MnSO₄、8MgCl₂、9MnSO₄、10CaCl₂+MgCl₂、11CaCO₃+MgCl₂、12NaCl+MgCl₂、13ZnSO₄+MgCl2、14KH₂SO₄+MgCl₂；

图7为不同浓度无机盐下GY30菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率图；

图8为GY30菌株发酵培养基正交试验设计L₉(3³)及试验结果

图9为不同时间下GY30-2菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率

图10为不同温度下GY30菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率

图11为GY30菌株优化前后发酵液的细菌总数和芽孢产率；其中：A为基础培养基在初始发酵条件下发酵，B为优化后的培养基在最佳发酵条件下发酵；

图12为GY30菌株在500L发酵罐中的生长曲线和芽孢形成曲线图；

图13为GY30菌株在30℃和32℃条件下在1吨发酵罐中发酵的生长曲线图；

图14为皂土添加量对菌粉中活菌存货率的影响图。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种源自海洋的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY30菌株，其保藏号为：CGMCC NO.14480。

所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株的产芽孢发酵培养方法，其步骤如下：

(1)将GY30菌株接种到PDA培养基上活化培养，在无菌条件下用接种环挑取GY30菌株于装有种子液培养基的培养器中，28℃，180r/min振荡培养；调整菌液浓度为10⁹个细胞/mL，作发一级种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L；

(2)将一级种子液按6％的接种量接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，32℃，180r/min发酵培养12-14h，制备成二级种子液。发酵培养基配方为：米糠0.2％，花生饼粉1.5％，无机盐NaCl 0.025％，MnSO₄0.025％，pH7.0。

(3)将二级种子液按接种量为5％-10％接种于装有产芽孢发酵培养基的1吨发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为140～180r/min，在0～12h时通气量为14m³/h，12h后通气量调整为30m³/h，发酵时间为36～44h，发酵温度30℃～32℃，得发酵液；产芽孢发酵培养基配方为：米糠0.2％，花生饼粉1.5％，无机盐NaCl 0.025％，MnSO₄0.025％，pH7.0。

利用所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法步骤如下：将解淀粉芽孢杆菌GY30菌株在发酵罐中前述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用硅藻土为载体，并增加氯化钙和磷酸氢二钠进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到GY30菌粉。

具体是：产芽孢发酵培养得到的发酵液温度降低20℃以下后将载体硅藻土缓慢加入到发酵液中，搅拌速度为150r/min，加完后继续搅拌30min，静置1-2h；

所制得的发酵液、GY30菌粉可以作为有效成份用于制备防治水稻纹枯病的药物或者药物组合物。

实施例2，利用实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其步骤如下：将解淀粉芽孢杆菌GY30菌株在发酵罐中按权利要求2所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用皂土为助干剂进行喷雾干燥，得到GY30菌粉。皂土的用量为发酵液7％，喷雾干燥时喷雾塔进风温度为160℃。

所制得GY30菌粉可以作为有效成份用于制备防治水稻纹枯病的药物或者药物组合物。

实施例3，利用实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其步骤如下：将解淀粉芽孢杆菌GY30菌株在发酵罐中按权利要求2所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用稻壳粉为载体吸附干燥，至含水量低于10％，过100目筛即得GY30菌粉。稻壳粉与发酵液的质量体积比为1∶1。

所制得的GY30菌粉可以作为有效成份用于制备水稻微生物肥料。

Claims

1.一种源自海洋的解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) GY30菌株，其特征在于，其保藏号为：CGMCC NO. 14480。

2.权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌GY30菌株的产芽抱发酵培养方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）将GY30菌株接种到PDA培养基斜面上活化培养18h,在无菌条件下用接种环挑取GY30菌株于装有60mL种子液培养基的250 mL三角瓶中，28°C, 180 r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁹个细胞/mL,作为一级种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖 20g/L、马铃薯 200g/L、水 1L；

（2）将一级种子液按6%的接种量接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，32°C, 180r/min发酵培养12-14h,制备成二级种子液;发酵培养基配方为：米糠0.2%,花生饼粉 1.5%,无机盐 NaCl 0.025%, MnSO₄0.025%, pH7.0;

（3）将二级种子液按接种量为5%-10%接种于装有产芽抱发酵培养基的发酵罐进行产芽抱发酵培养，搅拌速度为140〜180r/min,在0~12 h时通气量为14m³/h, 12h后通气量调整为 30m³/h,发酵时间为36〜44h,发酵温度30°C〜32°C,得发酵液；产芽抱发酵培养基配方为：米糠 0.2%,花生饼粉 1.5%,无机盐 NaCl 0.025%, MnSO₄ 0.025%, pH7.0。

3.利用权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特征在于，其步骤如下：将解淀粉芽抱杆菌GY30菌株在发酵罐中按权利要求2所述的方法进行产芽抱发酵培养，得到的发酵液用硅藻土为载体，并增加氯化钙和磷酸氢二钠进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到GY30菌粉。

4.根据权利要求3所述的解淀粉芽抱杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特征在于：产芽抱发酵培养得到的发酵液温度降低20°C以下后将载体硅藻土缓慢加入到发酵液中，搅拌速度为150r/min,加完后继续搅拌30min,静置l-2h；

吸附过程中按发酵液体积的2%加入氯化钙，按体积的3%加入磷酸氢二钠；

氯化钙先和磷酸氢二钠分别用少量热水溶解，搅拌转速为100r/min,完全溶解，溶液温度降到40°C后，分别加入到载体吸附的发酵液中，继续搅拌20min,转速150r/min,后静置30- 60min；

吸附絮凝好的GY30菌株发酵液转入板框压滤机中，利用压力将发酵液压缩进300目的筛布中，发酵液中的水挤压出后，再通过空气压缩机吹入空气，使板框内部压力达到0.3MPa, 连续吹l0 min,干燥至含水量低于10%,得到GY30菌粉。

5.利用权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特征在于，其步骤如下：将解淀粉芽抱杆菌GY30菌株在发酵罐中按权利要求2所述的方法进行产芽抱发酵培养，得到的发酵液用皂土为助干剂进行喷雾干燥，得到GY30菌粉。

6.根据权利要求5所述的解淀粉芽抱杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特征在于：皂土的用量为发酵液7%,喷雾干燥时喷雾塔进风温度为160°C。

7.利用权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特征在于，其步骤如下：将解淀粉芽抱杆菌GY30菌株在发酵罐中按权利要求2所述的方法进行产芽抱发酵培养，得到的发酵液用稻壳粉为载体吸附干燥，至含水量低于10%,过100目筛即得GY30菌粉。

8.根据权利要求7所述的解淀粉芽抱杆菌GY30菌株制备GY30菌粉的方法，其特征在于：稻壳粉与发酵液的质量体积比为1:1。

9.权利要求2所述的方法所制得的发酵液或者权利要求3-6任一项所述的方法所制得的GY30菌粉作为有效成份在制备防治水稻纹枯病的药物或者药物组合物中的用途。

10.权利要求7或8所述的方法所制得的GY30菌粉作为有效成份在制备微生物肥料中的用途。