CN109306330A - 生防细菌株解淀粉芽胞杆菌的发酵培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生防细菌解淀粉芽胞杆菌的发酵培养方法，包括：将解淀粉芽孢杆菌接种到最适KB液体培养基中进行发酵培养，即得。本发明在最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合的优化筛选基础上进行了培养基成分响应面试验，最终确定了KB培养基的最佳组成。在确定了最佳培养基的配方组成后，本发明进一步对显著影响发酵产物中生防细菌芽孢杆菌活菌数的培养温度、初始pH值、接种量以及装液量的参数进行了优化。本发明采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对生防细菌进行发酵培养，结果发现优化后活菌数为1.8×10⁹cfu/mL，是优化前的初始培养基及初始发酵条件下培养的发酵液活菌数的8.18倍。

Description

生防细菌株解淀粉芽胞杆菌的发酵培养方法

技术领域

本发明涉及生防菌株的发酵培养方法，本发明进一步涉及解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的发酵培养基及其发酵方法，属于解淀粉芽胞杆菌的发酵制备领域。

背景技术

番茄的灰霉病和叶霉病在番茄的生产过程中极为常见，给番茄的生产造成巨大的经济损失。目前，两种病害主要使用化学农药进行防治。近年来长期施用农药产生的危害受到极大的关注。相比而言，微生物农药具有无残留无公害等优点，是取代化学农药的首选。因此应用有益微生物防治番茄灰霉病和叶霉病的前景十分广阔。

目前，用于防治番茄灰霉病和叶霉病的多数菌株抑菌谱单一，仅对其中的一种病害有效，能够同时防治两种病害的菌株较少，目前尚未有同时防治番茄灰霉病和叶霉病的微生物菌剂上市应用。但是，两种病害在生产过程中经常同时发生，因此，研究兼防灰霉病和叶霉病的生防菌株具有重要意义。

近几年生物发酵工程在农业领域的应用十分广泛，主要是通过优化发酵工艺增加菌量及发酵代谢产物用于增产、防病等方面的研究。包括两方面：一是培养基成分的优化，二是发酵条件的优化。采用适合的优化方法，在提高生产效率的同时还能降低生产成本，应用性更强(陈坚，刘立明，堵国成，等.发酵过程优化原理与技术[M].北京：化学工业出版社，2009：1-5.)。

培养基能为微生物的生长提供必须的营养和必要的生长环境。其中碳源和氮源对微生物的生长和繁殖尤为重要(姚文兵.生物技术制药概论[M].中国医药科技出版社，2010.)。碳源能为微生物的生长提供物质和能量(蒋新龙.发酵工程[M].杭州：浙江大学出版社，2011，61.)。常用的碳源主要有谷物淀粉(如玉米粉、马铃薯淀粉等)、蔗糖、糖蜜等。氮源(包括有机氮和无机氮)为微生物细胞和代谢物提供氮素，对微生物的繁殖及芽孢的形成有着重要的作用(梁宇.生防枯草芽胞杆菌S-16液体发酵条件的优化[D].内蒙古农业大学，2015.)。氮源按能否直接被菌体利用可分为速效氮和迟效氮。速效氮利于菌体的生长，迟效氮利于代谢产物的形成(张嗣良.发酵工程原理[M].北京：高等教育出版社，2013，42-43.)。C/N对微生物的生长代谢产生直接的影响，过大和过小均影响微生物的繁殖和代谢。合适的C/N对微生物的生长代谢非常重要(钱风光，陈守文，蔡皓.生防菌枯草芽胞杆菌BS-5在3L发酵罐中的发酵工艺优化[J].中国生物防治，2009，25(1)：73-78.)。无机盐是组成酶或辅酶的有效成分，对生物大分子和细胞结构的稳定性起到一定的维持作用，能够缓冲和调节菌体与培养基之间关系(杜娟，孙佰平，张学坤，等.正交设计优化以沼液为基质的枯草芽胞杆菌S37最优发酵培养基[J].石河子大学学报(自然科学版)，2012，30(6)：678-682.)。除此之外，发酵条件对微生物的影响也较大。合适的培养条件有利于提高发酵产量和质量(张文芝，郭坚华.微生物发酵工艺优化研究进展[J].广东农业科学，2013，40(6)：114-117.)。

微生物的发酵过程中影响的因素较多，发酵工艺的优化决定着发酵水平高低(TANG X J，HE G Q，CHEN Q H，et al.Medium optimization for the pro-duction ofthermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 usingresponsesurface methodology[J].Bioresour Technol，2004，93(2)：175-181.)，一些试验技术和设计方法在培养基成分及培养条件的优化组合试验中得到广泛的应用。传统的优化法当试验因素较多以及考虑各因素之间交互作用时，试验次数就会增多，导致试验结果不准确。为了弥补缺陷，应用统计软件(诸如SAS、SPSS等统计软件)进行辅助试验优化得到了广泛的应用。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)对于番茄灰霉病和叶霉病有确切的防治功效，但是采用现有的发酵培养基和发酵条件对解淀粉芽胞杆菌进行发酵培养，发酵产物中活菌数较低，这极大的限制了解淀粉芽胞杆菌在防治番茄灰霉病和叶霉病中的应用，有待改进。

发明内容

本发明的主要目的是对解淀粉芽胞杆菌的发酵培养基和发酵条件进行优化，优化后的发酵培养基和发酵条件能够非常显著的提高解淀粉芽胞杆菌的活菌数。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种生防细菌解淀粉芽胞杆菌的发酵制备方法，包括：以KB液体培养基为初始发酵培养基，将解淀粉芽胞杆菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养，即得。

本发明以NYD、PPM、KB以及LB这四种培养基分别作为解淀粉芽胞杆菌Ba发酵培养的初始发酵培养基，结果发现解淀粉芽胞杆菌Ba在KB液体培养基中，30℃连续培养30h，菌数最大，为2.89×10⁸cfu/mL。抑菌活性最强，抑菌距离达到7.11mm。芽胞生成率最高，为66.67％。因此,本发明选择KB培养基作为解淀粉芽胞杆菌发酵制备的初始发酵培养基。

在确定了KB培养基为解淀粉芽胞杆菌Ba株的最优初始发酵培养基的基础上，本发明进一步对KB培养基中的最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合进行了优化筛选。

最适碳源的优化试验发现，Ba株以可溶性淀粉为碳源时，两项指标均达到最大值，其次是麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，因此选择可溶性淀粉为Ba株的最适碳源。

最适氮源的优化试验结果发现，以菌量为指标，从大到小排序前三的为牛肉膏、花生饼粉和黄豆饼粉。以抑菌活性为指标，排序为前三的为花生饼粉、牛肉膏和酵母粉。考虑成本等因素选择花生饼粉作为最适氮源。

最适无机盐的优化试验结果发现，综合两项指标的结果分析，按照从大到小排序，Ba株无机盐筛选排序为氯化钙＞磷酸氢二钠＞磷酸二氢钾＞NaCl＞硫酸镁＞硫酸铁＞硫酸铜＞硫酸锰。

最适无机盐组合的优化试验发现，将生防细菌Ba株的碳源和氮源选用筛选出的最佳碳氮源，无机盐按照排序结果，分别设置前一、二、三、四和五种组合。结果发现，Ba株为前三种组合，分别是氯化钙，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾。

在最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合的优化筛选结果的基础上，本发明进行了培养基成分响应面试验，最终确定了解淀粉芽胞杆菌Ba株的KB培养基的最佳组成为：可溶性淀粉4.4％，花生饼粉1.31％，磷酸氢二钠0.04％，氯化钙0.3％，磷酸二氢钾0.15％，余量为水。优化后菌量的OD₆₀₀值为1.411。与模拟值相差4.07％。

在确定了最佳培养基的配方组成后，本发明进一步对显著影响解淀粉芽胞杆菌Ba株发酵产物中活菌数的培养温度、初始pH值、接种量以及装液量的参数进行了优化。

根据培养温度对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株生长的优化试验结果可见，菌株Ba在37℃培养时，菌体密度和发酵液抑菌圈直径均达最大值，因此37℃作为菌株Ba的最适培养温度。

根据初始pH值对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株生长的优化试验结果可见，当发酵培养基的初始pH为6.5时，菌株的两项指标均达到最大值。因此，本发明确定发酵培养基的最佳起始pH值为6.5。

根据接种量对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株生长的影响试验结果可见，当接种量为2％和3％，生防细菌的菌量和发酵液抗菌活性较高，其中，3％接种量时为最高，因此，本发明最终确定生防菌株的3％接种量为最佳接种量。

根据装液量对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株生长的影响试验结果可见，当装液量小于10ml和大于90mL时，两项指标均较低，当装液量为30mL时两项指标的值较高，因本发明确定10ml-90mL/250mL为较为适宜的装液量，其中30mL/250mL为最佳装液量。

本发明采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对生防细菌进行发酵培养，结果发现优化后活菌数为1.8×10⁹cfu/mL，是采用优化前的初始培养基及初始发酵条件下培养的发酵液的8.18倍，试验结果试验，采用本发明优化的最佳培养基以及最适的发酵培养基条件能够极其显著的提高生防细菌的活菌数。

附图说明

图1生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株的生长曲线。

图2生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株的菌量与吸光值相关性的测定结果。

图3不同初始培养基对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株生长的影响试验结果。

图4生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株的碳源利用情况图。

图5生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株的氮源利用情况图。

图6生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株对无机盐的利用情况图。

图7生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株对无机盐组合的利用情况图。

图8蔗糖和酵母粉交互影响生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株菌量的响应面图。

图9蔗糖和氯化钙交互影响生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株菌量的响应面图。

图10酵母粉和氯化钙交互影响生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株菌量的响应面图。

图11培养温度对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株发酵的影响。

图12pH值对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株发酵的影响。

图13接种量对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株发酵的影响。

图14装液量对生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株发酵的影响。

图15生防细菌解淀粉芽胞杆菌Ba株的发酵培养基优化前后活菌数的比较。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料来源:

解淀粉芽胞杆菌Ba株购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号是ACCC10147.

试验例1生防菌株解淀粉芽胞杆菌Ba生长曲线的测定试验

测定试验的结果如图1所示，生防细菌菌量增长的大致趋势均为“S”型曲线，即菌量随培养时间的增加而增长。在0-9h，由于细菌刚被接入培养液中，菌量基数小，需要一定时间的调整以适应生长环境，导致菌株的繁殖速度缓慢，因此菌量增长缓慢；连续培养9-30h后，一方面由于菌株逐渐调整好了自身代谢，菌量也积累到了一定的水平，并且菌株的生长状态良好。另一方面生长环境营养较充足，生长条件适宜，因而菌株迅速繁殖，菌量急剧上升，达到对数生长期；30h之后，进入增殖后期，菌量最大；30-48h期间，由于营养物质的耗尽，菌株产生的次生代谢产物抑制菌株的生长，导致其增长速度骤减而趋于平稳，因而菌量变化趋于稳定，进入平稳期。从上述分析中可以判断18-30h为对数生长末期，此阶段为最佳的接种时期，因此确定18h为最佳接种种龄；48h为测定菌数的最佳时期，此时菌量最大。

试验例2生防菌株解淀粉芽胞杆菌Ba菌量与吸光值相关性的测定试验

细菌在生长繁殖过程中，培养时间逐渐延长，菌液变得越来越浑浊，测定吸光度能体现其浊度，若吸光值与菌株数量呈现线性关系。就可以测定吸光值代替菌数。测定结果如图2所示，生防菌的菌数与测定的OD₆₀₀值均呈现良好的线性关系，菌数越大，OD₆₀₀值越大，因此通过测定发酵液的OD₆₀₀值能够准确的反映出菌株的数量。

试验例3生防菌株解淀粉芽胞杆菌Ba初始发酵培养基的筛选试验

试验结果为图3和表1所示。生防菌株Ba在KB液体培养基中，30℃连续培养30h，菌数最大，为2.89×10⁸cfu/mL。抑菌活性最强，抑菌距离达到7.11mm。芽胞生成率最高，为66.67％。因此选择KB培养基。

表1 不同培养基对四株生防细菌芽胞形成的影响

试验例4发酵培养基成分的优化

1最适碳源的筛选试验

筛选试验的结果如图4所示。Ba以可溶性淀粉为碳源时，两项指标均达到最大值，其次是麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，因此选择可溶性淀粉为Ba的最适碳源。

2最适氮源的筛选试验

筛选试验的结果如图5所示，Ba的氮源筛选中，以菌量为指标，从大到小排序前三的为牛肉膏、花生饼粉和黄豆饼粉。以抑菌活性为指标，排序为前三的为花生饼粉、牛肉膏和酵母粉。考虑成本等因素选择花生饼粉作为最适氮源。

3最适无机盐的筛选试验

筛选试验的结果如图6所示，综合两项指标的结果分析，按照从大到小排序如下。Ba无机盐筛选排序为氯化钙＞磷酸氢二钠＞磷酸二氢钾＞NaCl＞硫酸镁＞硫酸铁＞硫酸铜＞硫酸锰。

4最适无机盐组合的确定

将生防细菌的碳源和氮源选用筛选出的最佳碳氮源，无机盐按照排序结果，分别设置前一、二、三、四和五种组合。结果如图7所示，Ba为前三种组合，分别是氯化钙，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾。

5培养基成分响应面试验

(1)Plackett-Burman试验确定显著影响因素

按照表2进行试验，由表3分析可知，可溶性淀粉、花生饼粉和磷酸氢二钠的“Prob>F”＜0.05，对菌株Ba的菌量影响显著，是显著影响因素。其他因素均影响不显著。得到的回归方程如下：

Eq.(3)R₁＝1.15+0.20A+0.27B+0.078D-0.17E+0.096G

从方程Eq.(3)中可以得出，显著影响因素可溶性淀粉和花生饼粉的预测模型系数为正值，在最陡爬坡实验中应增量。磷酸氢二钠为负值，对菌量具有负效应，应减少含量。非显著影响因素中，系数均为正值，在后续试验中均取“+1”水平。

表2 菌株Ba的Plackett-Burman试验设计及结果

表3 菌株Ba的Plackett-Burman试验设计分析结果

(2)菌株Ba的最陡爬坡试验

选取各显著因素的低水平为爬坡起点，根据每个因素影响效应的不同进行步长设计。

按表4试验设计，由表5可知，OD₆₀₀的值先增大后减小，在第3组试验中，可溶性淀粉3.6％，花生饼粉1.1％，磷酸氢二钠0.06％时，OD₆₀₀最大，故以第3组试验为中心点。

表4 菌株Ba的最陡爬坡路径步长设计

表5 菌株Ba的最陡爬坡路径实验设计与结果

(3)菌株Ba的中心组合试验

根据Ba的最陡爬坡试验结果，以可溶性淀粉3.6％，花生饼粉1.1％，磷酸氢二钠0.06％为中心点(0)进行响应面分析，见表6，重复5次。

表6 Ba的中心组合设计因子水平设计表

按照表7设计进行20组试验，发酵48h，测定OD₆₀₀值，3次重复，用Design Expert8.0.6软件预测结果的最佳OD₆₀₀值，见表8。

表7 Ba的响应面分析法中心组合设计与结果

对中心组合设计试验进行回归分析，预测三个独立变量因子对菌株数量影响，通过以下多元二次方程：

Eq.(7)

R₂＝1.50+0.076A+0.083B+0.08C+0.11AB-0.15AC-0.087BC-0.22A²-0.19B²-0.078C²

如表8所示，该模型的决定系数(R²＝0.9633)以及调整决定系数(R² _adj＝0.9303)接近1，说明观测值和预测值高度相关。回归模型极显著(p<0.0001)，拟合度还是比较高的，能较好的反应各因素与响应值之间的关系。表中各项均影响显著。

表8 Ba的中心组合设计二次模型的方差分析

注：A：可溶性淀粉；B：花生饼粉；C：磷酸氢二钠；R²＝0.9633；R²adj＝0.9303

Note:A:soluble starch；B:peanut meal；C:disodium hydrogen phosphate；R²＝0.9633；R²adj＝0.9303

用3D响应面图形来表示回归方程(Eq.(7))，根据图8可见，菌量随可溶性淀粉和花生饼粉含量的升高呈先升高后下降的趋势，具有最大值。两者对菌量的影响相当。表明两者在高浓度时均抑制细菌的生长繁殖。

根据图9可见，菌量随可溶性淀粉和磷酸氢二钠含量的升高呈先升高后下降的趋势，具有最大值。表明两者在高浓度时均抑制细菌的生长。

根据图10可见，菌量随花生饼粉和磷酸氢二钠含量的升高呈先升高后下降的趋势，具有最大值。表明两者在高浓度时均抑制细菌的生长。

用Design-Expert软件对各菌株的显著因素的最佳值和菌量的最大值进行优化。重复3次。

菌株Ba预测值(OD₆₀₀值)为1.45171，优化后配方为：可溶性淀粉4.4％，花生饼粉1.31％，磷酸氢二钠0.04％，氯化钙0.3％，磷酸二氢钾0.15％，余量为水。优化后菌量的OD₆₀₀值为1.411。与模拟值相差4.07％。证明此模型可靠。

试验例5发酵条件的优化

1培养温度对生防细菌生长的影响

根据图11可见，菌株Ba在37℃培养时，菌体密度和发酵液抑菌圈直径均达最大值，因此确定37℃作为菌株Ba的最适培养温度。

2初始pH对生防细菌生长的影响

根据图12可见，当pH为6.5时，菌株Ba的两项指标均达到最大值，因此，选择发酵培养基的起始pH值为6.5。

3接种量对四株生防细菌生长的影响

根据图13可见，接种量为2％和3％，生防细菌的菌量和发酵液抗菌活性均较高。因此，菌株Ba选3％为最适接种量。

4装液量对生防细菌生长的影响

根据图14可见，当装液量小于10ml和大于90mL时，两项指标均较低，当Ba的装液量为30mL时两项指标的值较高，因此Ba选择30mL为最佳装液量。

试验例6菌株Ba发酵液优化前后活菌数的比较试验

本试验分为2组，试验1组将生防菌株Ba按照优化前的KB液体培养基以及优化前的发酵培养条件进行培养；其中，优化前的KB液体培养基组成如下：蛋白胨20.0g，甘油10ml，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄1.5g，蒸馏水1000ml，培养基的初始pH7.0；优化前的发酵培养条件如下：初始发酵培养基的装液量为50mL/250mL，菌株的接种量为5％，30℃连续培养30h；

试验2组将生防菌株Ba在优化后的KB液体培养基以及优化的发酵培养条件中进行培养，其中，优化后的KB液体培养基组成是：可溶性淀粉4.4％，花生饼粉1.31％，磷酸氢二钠0.04％，氯化钙0.3％，磷酸二氢钾0.15％，余量是水；发酵培养基的起始pH值为6.5，初始发酵培养基的装液量为30mL/250mL，生防菌株的接种量为3％，培养温度37℃，连续培养30h。

比较试验的结果如图15所示，优化后活菌数为1.8×10⁹cfu/mL，是优化前的8.18倍。

Claims (10)

1.生防细菌解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的发酵制备方法，其特征在于，包括：以KB液体培养基为初始发酵培养基，将解淀粉芽孢杆菌Ba株接种到初始发酵培养基中进行发酵培养，即得。

2.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述KB液体培养基中的碳源为可溶性淀粉。

3.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述KB液体培养基中的氮源为花生饼粉。

4.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述KB液体培养基中的无机盐组合是氯化钙，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。

5.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述KB液体培养基的组成为：可溶性淀粉4.4％，花生饼粉1.31％，磷酸氢二钠0.04％，氯化钙0.3％，磷酸二氢钾0.15％，余量是水。

6.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养温度为20℃-37℃。

7.按照权利要求6所述的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养温度为37℃。

8.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述初始发酵培养基的初始pH值为6.5。

9.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌Ba株按照2-3％的接种量接种到初始发酵培养基中进行发酵培养。

10.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，初始发酵培养基的装液量10ml-90mL/250mL，优选为30mL/250mL。