CN110241059A - 一株低温纤维素降解细菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株低温纤维素降解细菌，属于微生物技术领域，该菌株MG‑1为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)，保藏编号为CGMCC No.18079。本发明提供的MG‑1菌株可以在4℃‑35℃下良好生长并分泌滤纸酶、内切‑β‑1,4‑葡聚糖酶、外切‑β‑1,4‑葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶等纤维素酶。在16℃条件下培养30天，菌株MG‑1对于玉米秸秆的降解率达到了22.30％，可用于低温地区玉米秸秆还田促腐菌剂研发的菌种资源。

Description

一株低温纤维素降解细菌

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株低温纤维素降解细菌。

背景技术

玉米是我国种植面积最大的旱田作物，玉米种植面积超过5亿亩，产量突破1.9亿吨，仅次于水稻。我国幅员辽阔，玉米种植形式多样。最重要的种植形式还是春、夏玉米。北方春播玉米区，以东北3省、内蒙古和宁夏为主，种植面积稳定在650多万公顷，占全国36％，总产2700多万吨，占全国的40％。

玉米秸秆含有丰富的营养和可利用的化学成分，是工、农业生产的重要生产资源。除用作畜牧业饲料的原料外，还是农业生态系统中一种十分宝贵的生物质能资源。将玉米秸秆还田可以充分利用秸秆中养分资源、改良土壤。还田后的秸秆在土壤微生物作用下发生腐解，秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素等成分转化为植物易于吸收的简单化合物，其他部分经转化成为腐殖质，从而改善土壤理化性质，提高土壤肥力，进而提高作物的产量和质量。

我国北方玉米收割时期一般是深秋季节，气温偏低，常温微生物无法在冷凉气候条件下对秸秆进行快速和彻底腐熟，容易给下茬农作物带来不良影响。因此，寻找一种在低温条件下可以加速玉米秸秆分解的微生物具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株低温纤维素降解细菌，低温环境下，该菌株在生长繁殖过程中可产生多种纤维素酶，分解玉米秸秆。

为了实现上述目的，本发明采用的一个技术方案是：一株低温纤维素降解细菌，其特征在于所述低温纤维素降解细菌命名为MG-1，鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)，其保藏编号为CGMCC No.18079，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年7月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。

菌株MG-1的形态特征：菌体形态呈杆状，革兰氏染色反应呈阴性。

菌株MG-1的生理生化特性：接触酶试验结果为阴性，明胶水解试验结果为阴性，淀粉水解试验结果为阴性，柠檬酸盐试验结果为阳性，吲哚试验结果为阴性，硝酸盐还原试验结果为阳性。

菌株MG-1的16SrDNA序列：

TGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGTCACCTGCCTCCTTACGGTTAGCACAGTGCCTTCGGGCAGAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCACACTCGCGTGCTTGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGCTTATCACTGGCAGTCCCTTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAAGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATCCGGTCCAGCCGAACTGAAAGACACATCTCTGTGTCCGCGACCGGTATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAAGAGTAAACTCCCCGACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGTCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTACCATACTCAAGACTTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGGGGTTGAGCCCCGGGATTTCACCCCTGACTTAAAAATCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGTTACCGTCATTATCTTCACCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCTCATCCTTTGCCGATAAATCTTTCCCCCGAAGGGCACATACGGTATTAGCAGTCGTTTCCAACTGTTGTTCCGTAGCAAAAGGTAGATTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTCCCCTTGCGGGGCGCTCGACTTGCATGTGTTAAGCCTGCCGCCAGCGTTCGTTCTGAGCCAGGATCAAACTCTA。

菌株MG-1的分子生物学鉴定结果：通过16S rDNA序列比对，与Ochrobactrumgallinifaecis strain Iso 196同源性为95％以上，菌株MG-1的16SrDNA序列系统进化树显示菌株MG-1和Ochrobactrum gallinifaecis同源。

本发明提供的菌株MG-1，在4-35℃条件下培养均能分泌四种纤维素酶，包括滤纸酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。四种纤维素酶活力的变化趋势均为4℃-25℃呈现上升状态，25℃达到顶点，25℃-35℃四种酶活力呈下降状态，25℃为最适产酶温度，该菌产酶属低温产酶范畴。

经过测定，在以下不同温度的四种纤维素酶活力为：

4℃下：滤纸酶活力13.88U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力10.46U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力13.09U/mL，β-葡萄糖苷酶活力6.46U/mL；

16℃下：滤纸酶活力46.90U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力36.48U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力46.67U/mL，β-葡萄糖苷酶活力24.56U/mL；

25℃下：滤纸酶活力63.42U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力39.52U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力89.69U/mL，β-葡萄糖苷酶活力51.50U/mL；

35℃下：滤纸酶活力38.63U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力25.86U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力50.74U/mL，β-葡萄糖苷酶活力21.07U/mL。

菌株MG-1在未经优化的培养条件下，于16℃下经过30天对玉米秸秆的降解率为22.30％。

本发明的有益效果是：菌株MG-1筛选自10℃自然条件下，能分泌多种纤维素酶，具有降解天然纤维素的能力。菌株MG-1在低温及未经优化的培养条件下可以有效降解玉米秸秆。

附图说明

图1为菌株MG-1的菌体形态光学显微镜照片；

图2为菌株MG-1的16SrDNA PCR产物电泳图；

图3为菌株MG-1的16SrDNA序列；

图4为菌株MG-1的基于16SrDNA序列的系统进化树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一株低温纤维素降解细菌，具体内容如下：

所用培养基：

富集培养基(Hutchinson秸秆培养基)：KH₂PO₄ 1.0g，NaCl 0.1g，FeCl₃·6H₂O0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaNO₃ 2.5g，CaCl₂·6H₂O 0.1g，用蒸馏水定容至1L，每100mL培养基加入约为1.0g玉米秸秆作为唯一碳源。秸秆段的预处理方法为：将长度约3cm的秸秆段用蒸馏水浸泡过夜，去除可溶性有机物，冲洗数次，约55℃下烘干备用。

分离纯化培养基[羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基]：CMC-Na 10.0g，KNO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 1.5g，刚果红0.2g，琼脂粉13.0g，用蒸馏水定容至1L。

液体产酶发酵培养基：K₂HPO₄ 13.3g，KH₂PO₄ 4.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，(NH₄)₂SO₄0.5g，玉米秸秆粉5g，用蒸馏水定容至1L。

秸秆降解培养基：同富集培养基

1、菌株MG-1的筛选与鉴定

菌株MG-1是在气温10℃时，从沈阳农业大学食用菌厂堆放的蘑菇渣中分离筛选获得。筛选按照以下方法进行：称取10.0g蘑菇渣样品置于90mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，充分静置，用移液枪吸取上清液1mL至装有100mL富集培养基的250mL三角瓶中，置于16℃恒温培养箱中静止培养，每天定期观察秸秆段状态，待秸秆段开始松散变软、培养液颜色变深后，振荡摇匀培养物，充分静置，取上清液5mL转接入装有100mL富集培养基的250mL三角瓶中，同样在16℃恒温培养箱中静止培养，如此转接5代。取第5代的培养液梯度稀释，分别取稀释度10^-2-10^-5的培养液0.1mL涂布于CMC-Na培养基平板上，在16℃下培养15天，将具有明显透明圈的菌落转接到CMC-Na培养基平板上进行分离纯化8-10次，将纯化后的菌落用无菌水制成菌悬液，进行梯度稀释后取稀释度10^-2-10^-5的培养液0.1mL涂布于CMC-Na培养基平板上，16℃下培养观察透明圈形成情况，待透明圈明显后用直尺测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，计算D/d数值，MG-1菌株的D/d为0.4-0.6，在同时筛选的菌株中处于高水平，说明该菌具有较高的秸秆降解能力，且具有较好的低温适应性。

对菌株MG-1进行形态特征和生理生化特性鉴定：对16℃下培养至对数期的菌体进行革兰氏染色试验，在16×100倍显微镜下观察菌体形态，呈杆状，进一步观察菌体颜色，呈红色，故MG-1为革兰氏阴性菌，如图1所示。根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》对菌株MG-1进行生理生化特性试验，主要进行了接触酶试验；明胶液化试验；淀粉水解试验；柠檬酸盐利用试验；吲哚实验；硝酸盐还原试验。结果见表1。

表1菌株MG-1的生理生化特性

表1显示，接触酶试验结果为阴性；明胶试验结果为阴性，菌株MG-1不水解明胶；淀粉水解试验阴性，菌株MG-1不水解淀粉；与柠檬酸盐反应为阳性；吲哚试验为阴性；硝酸盐还原试验结果呈阳性，菌株MG-1与硝酸盐反应。

对菌株MG-1进行分子生物学鉴定：取CMC-Na培养基16℃下培养7d的培养物，提取菌株MG-1的基因组DNA，对16SrDNA进行PCR扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图2)，样品送至上海生物技术有限公司进行16SrDNA基因测序(图3)。将菌株MG-1 16S rDNA的测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对，结果显示，菌株MG-1与Ochrobactrum gallinifaecisstrain Iso 196同源性为95％以上。选择序列相似性较高的菌株，用MEGA7.0构建系统发育树(图4)，图4显示菌株MG-1和Ochrobactrum gallinifaecis同源，且系统进化距为73，因此，菌株MG-1归属于苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)。

2、菌株MG-1分泌纤维素酶能力的测定

采用DNS显色法，参照国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的方法进行粗酶液酶活力的测定，测定滤纸酶活力、内切-β-1,4-葡聚糖酶活力、外切-β-1,4-葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力。

酶活力单位U的定义为在一定条件下，每分钟产生1μg还原糖(以葡萄糖计)为一个活力单元，以每毫升发酵液所含酶活力单位(U)的量表示纤维素酶活力的大小。酶活力计算公式为：

主要测定步骤为：

①葡萄糖标准曲线绘制：取9只试管，依次分别加入1.0mg/mL葡萄糖溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL，用蒸馏水定容至1mL。每管再加入2.0mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，摇匀，煮沸10min，立即用自来水冷却，加蒸馏水稀释5倍，摇匀。在紫外分光光度计下，用蒸馏水调零，在540nm处测量OD值。以葡萄糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。

②用接种环挑取菌株MG-1菌苔1-2环接入装有100mL液体产酶发酵培养基的250mL三角瓶中，于16℃恒温培养箱中培养3天，制成种子液。取5mL种子液接种于装有100mL液体产酶发酵培养基的250mL三角瓶中，分别在35℃、30℃、25℃、20℃、16℃、13℃、10℃、7℃、4℃下培养7d，取培养液至50mL离心管中，4℃，8000r/min，离心15min，上清液即为粗酶液。

③测定纤维素酶活力，根据公式计算纤维素酶活力。

测定结果如表2所示。

表2菌株MG-1不同温度下四种纤维素酶活力

菌株MG-1在4℃-35℃条件下均能分泌滤纸酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，四种酶活力的变化趋势为4℃-25℃呈现上升状态，其中，16℃时四种纤维素酶活力增加幅度较大，至25℃时各项酶活力达到最高，25℃-35℃四种酶活力呈现下降状态，25℃为菌株MG-1最适产酶温度，该菌产酶属低温产酶范畴。

4℃下四种酶活力为：滤纸酶活力13.88U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力10.46U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力13.09U/mL，β-葡萄糖苷酶活力6.46U/mL；

16℃下四种酶活力为：滤纸酶活力46.90U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力36.48U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力46.67U/mL，β-葡萄糖苷酶活力24.56U/mL。

25℃下四种酶活力为：滤纸酶活力63.42U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力39.52U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力89.69U/mL，β-葡萄糖苷酶活力51.50U/mL。

35℃下四种酶活力为：滤纸酶活力38.63U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力25.86U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力50.74U/mL，β-葡萄糖苷酶活力21.07U/mL。

3、菌株MG-1降解玉米秸秆能力的测定

在16℃下，将初筛菌株接入秸秆降解培养基中，静止培养期间经常摇动混匀，至30天，取出秸秆段，烘干称重，计算秸秆段培养前后的失重率，以不接种菌株的处理为空白对照。计算公式为：

(1)秸秆失重率(％)＝(W₁-W₂)/W₁×100

(2)玉米秸秆的降解率(％)＝菌株处理的玉米秸秆失重率-空白对照的玉米秸秆失重率

其中，W₁为秸秆降解前质量，W₂为秸秆降解后质量。

经过菌株MG-1处理的玉米秸秆失重率为29.07％，空白对照处理的玉米秸秆失重率为6.77％，菌株MG-1对玉米秸秆的降解率为22.30％。

本发明的有益效果：由于菌株MG-1(Ochrobactrum sp.)是从10℃自然堆放的蘑菇渣中筛选获得，经过16℃低温环境多次继代富集培养，以玉米秸秆为唯一碳源进行限制性碳源筛选，更大程度地保留了菌株MG-1(Ochrobactrum sp.)稳定的低温降解秸秆的天然特性。在16℃和培养条件未优化的情况下菌株MG-1(Ochrobactrum sp.)可以有效降解玉米秸秆，这为解决东北地区玉米秸秆原位还田提供了一株潜在的优良微生物资源，为后续微生物菌剂的开发提供了物质基础和技术支撑。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一株低温纤维素降解细菌，其特征在于所述低温纤维素降解细菌命名为MG-1，鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)，其保藏编号为CGMCC No.18079。

2.如权利要求1所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于其16SrDNA序列为：

TGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGTCACCTGCCTCCTTACGGTTAGCACAGTGCCTTCGGGCAGAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCACACTCGCGTGCTTGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGCTTATCACTGGCAGTCCCTTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAAGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATCCGGTCCAGCCGAACTGAAAGACACATCTCTGTGTCCGCGACCGGTATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAAGAGTAAACTCCCCGACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGTCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTACCATACTCAAGACTTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGGGGTTGAGCCCCGGGATTTCACCCCTGACTTAAAAATCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGTTACCGTCATTATCTTCACCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCTCATCCTTTGCCGATAAATCTTTCCCCCGAAGGGCACATACGGTATTAGCAGTCGTTTCCAACTGTTGTTCCGTAGCAAAAGGTAGATTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTCCCCTTGCGGGGCGCTCGACTTGCATGTGTTAAGCCTGCCGCCAGCGTTCGTTCTGAGCCAGGATCAAACTCTA。

3.如权利要求1所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于菌体形态呈杆状，革兰氏染色反应呈阴性。

4.如权利要求1所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于菌株的生理生化特性为接触酶试验结果为阴性，明胶水解试验结果为阴性，淀粉水解试验结果为阴性，柠檬酸盐试验结果为阳性，吲哚试验结果为阴性，硝酸盐还原试验结果为阳性。

5.如权利要求1所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于菌株的16SrDNA序列系统进化树显示菌株与Ochrobactrum gallinifaecis同源。

6.如权利要求1所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于4℃-35℃条件下，所述菌株液体培养物中含有四种纤维素酶，分别为滤纸酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。

7.如权利要求6所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于所述的四种纤维素酶活力的变化趋势均为4℃-25℃呈现上升状态，25℃达到顶点，25℃-35℃呈现下降状态。

8.如权利要求7所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于不同温度下所述的四种纤维素酶活力为：

4℃下：滤纸酶活力13.88U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力10.46U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力13.09U/mL，β-葡萄糖苷酶活力6.46U/mL；

16℃下：滤纸酶活力46.90U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力36.48U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力46.67U/mL，β-葡萄糖苷酶活力24.56U/mL；

25℃下：滤纸酶活力63.42U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力39.52U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力89.69U/mL，β-葡萄糖苷酶活力51.50U/mL；

35℃下：滤纸酶活力38.63U/mL，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力25.86U/mL，外切-β-1,4-葡聚糖酶活力50.74U/mL，β-葡萄糖苷酶活力21.07U/mL。

9.如权利要求1所述的低温纤维素降解细菌，其特征在于所述菌株在未经优化的培养条件下30天对玉米秸秆的降解率为22.30％。