CN109797121A - 一株降解纤维素的微生物菌株lm-1801及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，具体公开了一株高效降解纤维素的微生物菌株LM‑1801及其应用。所属微生物菌株LM‑1801为Lysinibacillus macroides，其保藏编号是CGMCC No.16870(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。菌株LM‑1801以玉米秸秆为底物时，纤维素降解率为58.13％，半纤维降解率为64.55％；β‑葡萄糖苷酶﹑内切葡聚糖酶酶和外切葡聚糖酶的酶活力分别为2.78ug/ml.min﹑0.97ug/ml.min和0.58ug/ml.min。将玉米秸秆和沙柳经过碱预处理(10％NaOH，80℃处理180min)后，玉米秸秆的纤维素降解率和半纤维素降解率分别达到50.30％和75.17％；沙柳的纤维素降解率和半纤维素降解率分别达到41.15％和88.83％。该菌株能够对富含纤维素的原料如玉米秸秆等农业废弃物进行发酵降解并产生乳酸与乙酸，这样可以减少农林废弃物的资源浪费和环境污染，有明显的经济和生态意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一株高效降解纤维素的微生物菌株及其应用。
背景技术
进入二十世纪以来，尤其是第二次世界战争以后，石油和煤炭在世界经济的发展中发挥着巨大的作用。但是，以石油和煤炭作为主要能源产生了严重的环境污染。另外，作为不可再生能源，石油和煤炭的储量有限，能源枯竭危机也困扰着人类。化石能源的衰竭以及全球对温室气体排放引起的环境问题的日渐关注，让节约能源、提高能源利用率及开发利用可再生能源成为世界能源的主旋律。生物质能源由生物质加工而成，被视为环境友好型能源，不仅能缓解能源供给矛盾，对于应对全球气候变化及可持续性发展都有着积极的推动作用。纤维素是自然界中含量最多的碳水化合物，每年有89％的生物质能未能被利用或者未能被有效利用(比如直接焚烧)。如果可以将这部分生物质可再生资源转变成可直接利用的能源，不仅可以减轻农林业废弃物对环境的污染达到保护环境的目的，更是对能源危机的缓解起到了重要的作用。
我国是一个传统的农业大国，每年有7亿吨作物秸秆、2亿吨林地废弃物、25亿吨畜禽粪便及大量有机废弃物，另外有1亿多公顷(稍少于现耕地面积)不宜垦为农田，但可种植高抗逆性能源植物的边际性土地。这些农林废弃物和边际性土地，为生物质产业提供了原料保障。近年来政府高度重视生物质转化发展和研究，颁布了《可再生能源产业发展指导目录》、《可再生能源法》等法规条例并制定了《可再生能源中长期发展规划》，大力发展可再生能源。生物质资源和能源将成为势不可挡的时代潮流，生物炼制提供了一条过渡到更节能环保和可持续发展的生物能源经济时代的途径。
能够降解木质纤维素的微生物种类繁多且分布广泛，它们可以将木质纤维材料转化为无机和有机化合物，如乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、二氧化碳和甲烷等。微生物降解纤维素是通过纤维素降解酶系的酶解作用。根据纤维素酶的结构特征和理化性质，一般纤维素酶包括内切葡聚糖酶(Endoglucanase，EC 3.2.1.4，简称EG)、纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91，又称外切葡聚糖酶，简称CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC 3.2.1.21，简称BGL)。纤维素酶主要是由微生物发酵而产生，纤维素酶作为一种可以降解纤维素的生物催化剂，在食品工业﹑畜牧业、纺织业、医药、生物转化和环境保护等行业中应用十分广泛。因此，筛选高效降解纤维素的菌株是进行生物质资源化利用和获得稳定纤维素酶的根本措施。
发明内容
本发明的目的是提供一株纤维素降解菌株LM-1801(Lysinibacillusmacroides)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。邮编：100101)。保藏日期为：2018年12月05日，保藏编号为：CGMCC NO：16870。
本发明还提供了菌株LM-1801在纤维素降解中的应用。
本发明还提供了将玉米秸秆和沙柳经过碱预处理(10％NaOH，80℃处理180min)后，玉米秸秆的纤维素降解率达到50.30％，半纤维素降解率达到75.17％；沙柳的纤维素降解率达到41.15％，半纤维素降解率达到88.83％。
本发明还提供了菌株LM-1801的最适生长温度为35-37℃，最适生长pH为6.0；以玉米秸秆为底物时，纤维素降解率为58.13％，半纤维降解率为64.55％；β-葡萄糖苷酶酶活力为2.78ug/ml.min，内切葡聚糖酶酶活力为0.97ug/ml.min，外切葡聚糖酶酶活力为0.58ug/ml.min，酶活力最适温度为37℃，最适pH为7.0。
本发明还提供了一种生产纤维素酶的方法，是用上述的菌株LM-1801发酵来制备纤维素酶。
本发明通过优化菌株LM-1801的培养条件，在以玉米秸秆为底物时，可获得较高的纤维素降解率和半纤维素降解率(纤维素降解率为58.13％，半纤维降解率为64.55％)，且稳定性较好。所述菌株LM-1801可广泛应用于降解纤维素和纤维素酶的生产，应用前景广阔。这是首次发现Lysinibacillus macroides具有纤维素降解能力。
附图说明
图1：菌株LM-1801最适生长pH值。
图2：菌株LM-1801最适生长温度。
图3：菌株LM-1801纤维素酶活力。
图4：以玉米秸秆为底物时，经菌株LM-1801发酵后的纤维素降解率﹑半纤维素降解率与发酵产物。
图5：将玉米秸秆和沙柳经过碱预处理(10％NaOH，80℃处理180min)后，经菌株LM-1801发酵后的纤维素降解率与半纤维素降解率。
具体实施方式
实施例1：菌株LM-1801的活化
菌株LM-1801来源于牛瘤胃，从牛瘤胃中筛选后利用以下培养基和培养条件进行培养活化。
液体培养基(10ml)：(1)基础培养基(5ml)：每50mL含NaHCO3 0.5g，蛋白胨0.1g，酵母提取粉0.1g；(2)矿物质液A(1.65mL)：每50mL含KH2PO4 0.15g，(NH4)2SO4 0.15g，NaCl0.3g，CaCl2·2H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 0.029g；(3)矿物质液B(1.65mL)：每50mL含K2HPO4·3H2O 0.198g；(3)半胱氨酸盐酸盐0.015g，葡萄糖0.05g
往配制好的液体培养基里按照5％的比例接入保存好的菌株。放入恒温振荡培养箱，37℃，180r/min活化培养。
固体培养基：(1)基础培养基(2.5ml)：每50mL含NaHCO3 0.5g，蛋白胨0.1g，酵母提取粉0.1g；(2)矿物质液A(0.825mL)：每50mL含KH2PO4 0.15g，(NH4)2SO4 0.15g，NaCl0.3g，CaCl2·2H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 0.029g；(3)矿物质液B(0.825mL)：每50mL含K2HPO4·3H2O 0.198g；(3)半胱氨酸盐酸盐0.0075g，琼脂0.1g，刚果红0.002g，羧甲基纤维素钠0.025g。在Hungate滚管中进行培养，放入恒温培养箱，37℃活化培养。
1.1菌种鉴定：对菌株进行16SrDNA扩增测序，然后将测序结果在NCBI-BLAST进行比对。
1.2菌株LM-1801最适生长pH的测定：将菌种以5％比例分别接入pH为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中37℃培养至对数期，每组三个平行样，测定每组菌液的OD540。即可确定菌种的最适生长pH。
1.3菌株LM-1801最适生长温度的测定：将LM和BF两株菌以5％比例分别接入pH为6.0的液体培养基中，分别置于27℃，32℃，37℃，42℃，47℃的恒温振荡培养箱中培养至对数期，每组三个平行样，测定每组菌液的OD540。即可确定菌种的最适生长温度。
实施例2：菌株LM-1801纤维素酶活力的测定
2.1菌株LM-1801β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法：取1.0的粗酶液，加入2.0ml0.5％的水杨苷溶液，50℃水浴10min后，加入1mlDNS试剂，充分混合在沸水浴中煮沸5min，冷却后用蒸馏水稀释至20ml，用分光光度计于波长530nm处测定吸光度值OD530，以加热灭活的粗酶液按照同样方法处理作为空白。
2.2菌株LM-1801内切葡聚糖酶酶活力测定方法
将2.1中的底物换为羧甲基纤维素钠溶液，50℃水浴时间换为30min即可。
2.3菌株LM-1801外切葡聚糖酶酶活力测定方法
将2.1中的底物换为微晶纤维素溶液，50℃水浴时间换为60min即可。
实施例3：菌株LM-1801纤维素降解率的测定
将发酵液离心处理后去上清，放入真空干燥机中，干燥完成后称取0.025g的玉米秸秆样品加入滚管中，滴加250ul的74％硫酸，30℃水浴1h，期间不断搅拌，反应结束后将滚管放入事先准备好的冰浴终止反应，在每个滚管中加入7ml蒸馏水稀释，每组三个平行样。然后将标样和样品一起放入高温高压灭菌锅中进行水解。水解60min，温度降到100℃迅速取出样品和标样。室温冷却后摇匀滚管(防止水解出来的单糖沉淀)，抽取1ml的液体用0.22um水系滤膜进行过滤，将样品加入高效液相色谱仪样品瓶中待测。
纤维素/半纤维素降解率
C1：剩余玉米秸秆中的葡萄糖含量，g/l；n1：剩余的玉米秸秆质量，g；0.025：加入的剩余玉米秸秆量，g；0.844：2g玉米秸秆中含有的葡萄糖量，g；玉米秸秆含有38％的葡萄糖
C2：剩余玉米秸秆中的木糖含量，g/l；n2：剩余的玉米秸秆质量，g；0.025：加入的剩余玉米秸秆量，g；0.533：2g玉米秸秆中木糖含量，g；玉米秸秆含有24％的木糖
实施例4：菌株LM-1801发酵产物的测定
抽取新鲜发酵液2ml加入60ul的10％硫酸，12000r/min，4℃离心5分钟，取上清1ml用0.22um水系滤膜过滤，将样品加入高效液相色谱仪样品瓶中待测。根据液相中产物的峰面积与标样峰面积的比值算出产物浓度：
C产物：发酵产物浓度；C标样：配制标样浓度
实施例5：将玉米秸秆和沙柳经过碱预处理(10％NaOH，80℃处理180min)后，经菌株LM-1801发酵后的纤维素降解率与半纤维素降解率的测定。
分别将2g秸秆与沙柳加入西林瓶中，然后以1；10固液比加入10％NaOH，80℃处理180min后，以处理后的玉米秸秆和沙柳为底物在37℃恒温振荡培养箱中发酵培养七天后，测定菌株的纤维素/半纤维素降解率；同样的，以未预处理的沙柳和玉米秸秆为底物，在37℃恒温振荡培养箱中培养7天后测定菌株的纤维素/半纤维素降解率。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古工业大学
<120> 一株降解纤维素的微生物菌株LM-1801及其应用
<130> 201812
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1355
<212> DNA
<213> Lysinibacillus macroides
<400> 1
gtttacaaac ttctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc 60
gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccggcttca tgtaggcgag ttgcagccta 120
caatccgaac tgagaacgac tttatcggat tagctccctc tcgcgagttg gcaaccgttt 180
gtatcgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc 240
atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctaaatgatg 300
gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag 360
ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcaccg ttgcccccga aggggaaact atatctctac 420
agtggtcaac gggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac 480
atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta 540
ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac 600
acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca 660
cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac cagaaagtcg ccttcgccac tggtgttcct 720
ccaaatctct acgcatttca ccgctacact tggaattcca ctttcctctt ctgcactcaa 780
gtcccccagt ttccaatgac cctccacggt tgagccgtgg gctttcacat cagacttaaa 840
ggaccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt 900
accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctaat aaggtaccgt caaggtacag 960
ccagttacta ctgtacttgt tcttccctta caacagagtt ttacgatccg aaaaccttct 1020
tcactcacgc ggcgttgctc catcaggctt tcgcccattg tggaagattc cctactgctg 1080
cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc 1140
ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggc 1200
ccatcctata gcgacagccg aaaccgtctt tcagtctttc accatgaagc aaaagagatt 1260
attcggtatt agccccggtt tcccggagtt atcccaaact atagggtagg ttgcccacgt 1320
gttactcacc cgtccgccgc taacgtcaaa ggagc 1355
Claims (9)
1.一株菌为Lysinibacillus macroides，菌株LM-1801，保藏编号为：CGMCC No.16870(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
2.由权利要求1所述菌株LM-1801经诱变或基因工程改造获得的突变菌。
3.权利要求1所述菌株LM-1801及权利要求2所述的突变菌的培养方法，其特征在于，实验室摇床培养方法：以2％-20％(v/v)接种到发酵培养基中，在30-38℃，100-250rpm振荡培养10小时及以上；发酵罐培养方法：以2％-20％(v/v)接种到发酵培养基中，在30-38℃，pH为6.0-7.6培养10小时及以上。
4.含有权利要求1所述菌株LM-1801或权利要求2所述的突变菌的发酵液或培养液。
5.由权利要求1所述菌株LM-1801制备或权利要求2所述的突变菌制备或由权利要求3所述方法制备得到的发酵液或培养液。
6.权利要求1所述的菌株LM-1801或权利要求2所述的突变菌或权利要求3所述的发酵液或培养液在纤维素降解方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：利用权利要求1所述菌株或权利要求2所述的突变菌扩繁的菌种或权利要求3所述的发酵液或培养液，对富含纤维素的物料进行处理。
8.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的菌株LM-1801或权利要求2所述的突变菌发酵来制备纤维素酶(包括β-葡萄糖苷酶，内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶)或乳酸或乙酸。
9.根据权利要求8所述的方法获得的纤维素酶(包括β-葡萄糖苷酶，内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶)及其应用。
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