CN102433262B - 一种适用于低温沼气发酵的复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种适用于低温沼气发酵的复合微生物菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于沼气低温发酵的复合微生物菌剂。由假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.4764、成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No.4765和成团泛菌(Pantoea agglomerans)三种菌的发酵液按重量比计，将三种菌分别发酵后的发酵液按1∶1∶1比例混匀，即为液体剂型。本发明的复合微生物菌剂可直接投加到沼气池，使得沼气池在冬季正常产气，具有广泛的应用价值。

Description

一种适用于低温沼气发酵的复合微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体说，涉及一种用于低温条件下产沼气并且能提高以牛羊粪及秸秆为原料的复合菌剂及其制备的技术领域。
背景技术
在可持续发展的理念下，我国政府把节能减排作为主攻方向，农村高度关注“三农”及“生态富民工程”建设。农村沼气已成为农村生态家园建设、社会主义新农村建设、实现农业资源循环利用和节能减排的重要纽带，与整个农村社会的经济发展有着密切的联系。
沼气是属于地面生物质能源，一般含甲烷(CH4)60％-70％，二氧化碳(CO2)25％-40％，H2S、N2、CO、H2等约占5％，主要是通过细菌发酵使植物秸秆和牲畜粪便的有机物还原成气体。沼气无色、无臭、无味，沼气在完全燃烧时火焰呈蓝色，温度可达1400-2000℃，并放出大量的热。燃烧后的产物是二氧化碳和水蒸气，不会产生严重污染环境的气体。1m3沼气的热值约18017KJ-25140KJ，相当于1kg原煤或0.74kg标准煤，是一种优质的气体燃料。沼气热效率比较稳定，使用方便，其技术经济性仅次于液化石油气。
沼气的制备主要是通过细菌发酵使植物秸秆和牲畜粪便的有机物还原成气体的厌氧发酵过程。在沼气制备过程中，厌氧消化过程是一个多菌群相互交替作用的复杂过程，参与代谢的微生物菌群也相当复杂，有水解性细菌、还原乙酸细菌、产甲烷菌等等。在一个能够正常进行发酵的沼气池中，不产甲烷菌对有机物分解利用的速度决定了产甲烷菌产甲烷的速度，为了进一步提高沼气产量，重要的不是产甲烷菌的继续富集，而是提高不产甲烷菌对有机物的水解速度。在水解细菌所产生的各种水解酶作用下，使大分子的蛋白质、脂肪、纤维素、淀粉水解为水溶性的酸、醇、糖等小分子化合物以及少量H2和CO2，然后进一步发酵形成乙酸盐等，为甲烷菌提供充足的营养物质，甲烷菌完成正常代谢后产出甲烷气体。因此，在酸化调节过程中，为了提高底物中有机物的降解效果，更好地为产甲烷菌提供甲烷合成底物，可添加微生物、酶、营养物质、代谢促进物、吸附剂、螯合剂等促进剂以提高沼气产量。
但由于目前我国大面积推广的户用沼气池几乎全部采用的是常温发酵模式，沼气池的产气情况受温度变化的影响很大，而北方地区冬季普遍寒冷漫长，沼气的生产存在产气率低、使用率低、原料分解率低、沼气使用综合效益差等问题，甚至在冬季会出现冻裂沼气池。有些地区冬季基本不产气，沼气池利用率50％，原料分解不到30％，沼气使用每年只有3个月。尤其在农牧区以羊粪为主的沼气发酵存在原料上浮、结壳及产气率低的问题。这种状况在一定程度上限制了北方地区沼气的发展。使北方沼气的普及和应用落后于南方地区，为此，在北方寒冷地区如何合理开发利用沼气是一个亟待解决的问题。
目前国内的户用沼气池一般是采取一些可提高产用沼气池冬季产气率和发挥综合效益的越冬保温增温措施，主要包括：
一是日光温室、养猪暖舍、厕所、沼气池“四位一体”模式；二是北方一般采用挖防寒沟，沟内填发酵物的方式对农村户用沼气池进行保温；三是调节发酵原料配比，改善微生物的食料结构；四是在使用管理方面做到勤出料、勤进料，每次进出料量要少，进料要适当添加一些热性原料，如经过沤制的作物秸秆、牛粪、马粪等，以提高发酵物浓度，采取以料补温的方法对沼气池料液升温。这些措施虽有一些效果，但仍难以满足需要，难以实现户用沼气池冬季正常产气。
今后通过为沼气池提供水解微生物的优势菌群，改善不产甲烷菌的代谢功能，是提高有机物分解利用率和沼气产量的一项重要措施。
现有技术表明，添加沼气发酵促进剂在沼气发酵中主要可以改善微生物营养状况、加速新陈代谢、改变沼气微生物占优势的种类，使产甲烷丝状菌属(Methanothrix)过渡为活性更强的产甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)；中国专利文件CN1888073(200510077792.3)公开了一种复合菌剂预处理秸秆的沼气发酵方法，复合菌剂为高温单胞菌、枯草芽孢杆菌、木霉菌和地衣芽孢杆菌，向润湿后的秸秆加入复合菌剂和作为秸秆堆沤的氮源碳酸氢铵并补加水，用塑料布覆盖堆沤，然后将堆沤好的秸秆入沼气池，同时加入碳酸氢氨和产甲烷接种物，密闭2-7天，即产沼气。预处理后的秸秆发酵速度和产气速度快，使初始产气时间缩短，产气率提高30％左右，能使所有玉米秸杆、稻草、麦杆等农作物秸秆作为沼气发酵的原料，适用范围广泛。该方法的局限性在于，一是侧重于分解秸秆不能解决用户沼气池冬季产沼气问题；二是该复合菌剂只能在预处理秸秆时使用，不能直接投入沼气池内促沼气生成，使用方法麻烦，限制了其推广。
经国内专利检索，尚未见有适用沼气低温发酵微生物菌种及推广应用的相关产品的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于低温沼气生产中适用的高效复合微生物菌剂及其制备方法，本发明的复合微生物菌剂可直接投加到沼气池，使得沼气池在冬季正常产气，具有较好的应用前景。
本发明的主要技术方案：根据外源酶类对低温下沼气发酵影响的研究，针对蛋白酶、糖化酶、木质素酶、纤维素酶、半纤维素酶、甲烷菌等进行研究；重点筛选水解菌、还原乙酸菌、产甲烷菌等，通过对羊粪、牛粪的木质素、纤维素、半纤维素及含氮量进行了测定分析，并对沼气发酵前后微生物作用效果进行对比分析，确定发酵菌种类型。并通过不同的驯化方式扩展菌株的温度适应范围，使其能够在较宽的温度范围内均具有较高的活性。同时利用生物技术手段对低温沼气发酵微生物菌群进行动态监测，并针对性的筛选优势菌株，同时结合菌剂接种实验结果，制定沼气低温发酵菌剂生物监测标准。
本发明具体提供了一种用于沼气低温发酵的复合微生物菌剂。所述的复合微生物菌剂由巴氏醋杆菌(Acetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)和成团泛菌(Pantoea agglomerans)三种菌的发酵液按重量比计，将三种菌分别发酵后的发酵液按1∶1∶1比例混匀，即为液体剂型。
具体的，本发明提供用于沼气低温发酵的假单胞菌(Pseudomonas sp.)。通过从羊粪沼气发酵反应器中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株产表面活性剂较高的菌株，编号为R1，菌落呈扩散状生长，半透明，最佳生长温度28℃，短杆状，革兰氏染色阴性；可在添加1％甲醇的培养基上生长。经形态、微生物学分类和16S rDNA特征序列分析鉴定，属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。通过对菌株发酵条件及酶学特性进行研究，结果表明：R1菌株的最佳生长培养基为PR培养基，在28℃，150rpm，培养48h，其能够产生一种生物表面活性剂。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，sManual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号为R1菌株为假单胞菌中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏号是CGMCC No.4764。经过16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号为R1的菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，以下简称假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCCNo.4764。
同时，本发明提供用于沼气低温发酵的成团泛菌(Pantoea agglomerans)。通过从羊粪沼气发酵反应器中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株产2，3丁二醇较高的菌株，编号为R4，菌落呈边缘整齐，表面较湿润；革兰氏阳性菌，短杆状，无芽孢，无荚膜；最佳生长温度28℃，柠檬酸盐利用试验、明胶水解试验、油脂水解、淀粉水解，尿素酶试验、硫化氢的产生试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验、甲基红试验结果均为阴性；己酰甲基甲醇(V-P)试验阳性；利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，乳糖产酸，利用淀粉产碱。经形态、微生物学分类和16S rDNA特征序列分析鉴定，属于成团泛菌(Pantoea agglomerans)。经摇瓶发酵条件优化试验研究。结果表明：R4菌株的最佳生长培养基为R4F培养基，28℃，150rpm，培养48h，其能够产生一种生物表面活性剂。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual ofSystematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号为R4菌株为成团泛菌中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏号是CGMCC No.4765。经过16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号为R4菌株为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)，以下简称成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No.4765。
其中，本发明采用的巴氏醋杆菌(Acetobacter)株菌为购买菌株，公众可通过市场途径购买获得。
进一步，本发明提供巴氏醋杆菌(Acetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.4764和成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No.4765三种菌的发酵液分别按斜面菌种培养活化、摇瓶培养、种子罐液体发酵培养、发酵罐液体发酵生产，生产条件如下：
假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.4764采用LB液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种200毫升接种至10升PR培养基中；发酵温度为28℃，并用NH4OH 28％溶液将pH恒定调节至6-8，优选6.8；搅拌速率为400rpm，通气量设定为0.4(V/V)；当生物量的浓度达到10g/L-40g/L时停上发酵。
成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No.4765采用R4F液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种250毫升接种至10升R4F培养基中；发酵温度为28℃，并用NH4OH 28％溶液将PH恒定调节至6-8，优选7.0；搅拌速率为100rpm，通气量设定为0.2(V/V)；当生物量的浓度达到10g/L-30g/L时停上发酵。
巴氏醋杆菌(Acetobacter)：用FC液体培养基培养24小时制备菌种，用上述菌种250毫升接种至10升FC培养基中。发酵温度为28℃，并用NH4OH 28％溶液将pH恒定调节至4-7，优选7.0。搅拌速率为150rpm，通气量设定为0.1(V/V)。当生物量的浓度达到10g/L至20g/L时(优选12g/L)停上发酵。
将上述三种制备好的发酵液按等体积混合，直接应用于沼气池。
以上三种菌的发酵液中有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上。
本领域熟知，沼气发酵的生物学过程由多菌种联合作用，可分为三个阶段，即水解阶段、产酸阶段、产气阶段。在农作物秸秆发酵产沼气过程中，纤维素类物质分解是关键，纤维素的破坏意味着复杂的有机物水解成相应的单体和无形体物质产生，这是最重要的物理性状变化。因此，本发明根据微生物菌株的特性和沼气发酵过程原理，研究、制备专用的高效环保微生物复合接种菌剂，同时提供利用微生物复合菌剂加速富含纤维素农作物秸秆进行分解的处理方法，有利于沼气发酵过程水解阶段进行，并加快产酸阶段和产气阶段实施，缩短产沼气时间，增加沼气产量，是十分必要的。
本发明通过对三种性能优异的微生物菌株的有机组合，制成的复合微生物菌剂，在较低的温度下具备较强的繁殖能力，而且对各类粗纤维和蛋白类大分子具有很强的消化能力。该复合微生物菌剂添加到沼气池中可以加速低温产沼气菌的富集，从而加速沼气池启动。
上述复合微生物菌剂的制备方法中未明确限定的均可按现有技术。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
1、本发明提供了一种用于沼气低温发酵的复合微生物菌剂的制取技术具有良好的重复性。
2、该复合微生物菌剂在低温下可明显提高沼气产量。只要沼气发酵装置中料液温度保持在大于10℃，以牛羊粪便为主要原料的沼气池，比不加菌剂的提高30％-50％以上。
3、该复合微生物菌剂的使用方法简单，而且该菌剂具有长效性。由于沼气池常年可以使用，每尸每年平均可节省几个月的生活用煤。
4、本发明对加该复合微生物菌剂后的沼渣测定结果表明，沼渣中氮、磷、钾及有机质含量都比较高，是一种很好的有机肥料，特别是对纤维素类农作物秸秆分解的微生物菌剂的制备；以及利用此专用复合菌剂作为接种菌剂，提供对农作物秸秆进行分解处理，加快发酵产沼气的应用方法。同时也可以用于对其它有机固体废物进行生物处理产沼气。
附图说明：
图1显示为不同菌剂处理产沼气率图。
图2显示为5L沼气羊粪产气图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：
主要试剂：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、淀粉、牛肉膏、蔗糖、Na2HPO4、NaCL、MgSO4·7H2O、K2HPO4、FeSO47H2O、MnSO4·H2O、NaNO3。
主要仪器：5升及10升发酵系统、摇床、PCR扩增仪、冷冻离心机、显微镜、生化培养箱、分析天平、超净工作台。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：菌株的筛选、驯化、选育及分类鉴定
在10℃条件下，对几个不同处理的羊粪沼气反应器优势微生物进行分离、筛选、培养、鉴定及回接实验验证，对其作用效果进行对比分析，确定发酵菌种类型。同时。利用分子生物学手段，对沼气发酵罐细菌及真菌优势菌群进行分离鉴定，对已发酵良好的羊粪沼气反应器进行样品的采集和DNA的提取，进行了微生物种群的16S rDNA及18S rDNA的鉴定及微生物多样性的比较、鉴定等研究，确定菌群类型。
最终确定了两株具有明显效果的菌株R1和R4菌。
通过从羊粪沼气发酵反应器中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株产表面活性剂较高的菌株，编号为R1，菌落呈扩散状生长，半透明，最佳生长温度28℃，短杆状，革兰氏染色阴性；可在添加1％甲醇的培养基上生长。经形态、微生物学分类和16S rDNA特征序列分析鉴定，属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。通过对菌株发酵条件及酶学特性进行研究，结果表明：R1菌株的最佳生长培养基为PR培养基，在28℃，150rpm，培养48h，其能够产生一种生物表面活性剂。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号为R1菌株为假单胞菌中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏号是CGMCC No.4764。经过16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号为R1的菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，以下简称假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.4764。
通过从羊粪沼气发酵反应器中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株产2，3丁二醇较高的菌株，编号为R4，菌落呈边缘整齐，菌落形态小而平、透明、白色、表面较湿润；革兰氏阳性菌，球状，呈单个或成双，有时呈短链状排列，无芽孢，无荚膜；最佳生长温度28℃，革兰氏阳性，柠檬酸盐利用试验、明胶水解试验、油脂水解、淀粉水解，尿素酶试验、硫化氢的产生试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验、甲基红试验结果均为阴性；己酰甲基甲醇(V-P)试验阳性；利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，乳糖产酸，利用淀粉产碱。经形态、微生物学分类和16S rDNA特征序列分析鉴定，属于成团泛菌(Pantoea agglomerans)。经摇瓶发酵条件优化试验研究。结果表明：R4菌株的最佳生长培养基为R4F培养基，28℃，150rpm，培养48h，其能够产生一种生物表面活性剂。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manualof Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号为R4菌株为成团泛菌中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏号是CGMCC No.4765。经过16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号为R4菌株为成团泛菌(Pantoea agglomerans)，以下简称成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCCNo.4765。
将上述菌的发酵液分别按斜面菌种培养活化、摇瓶培养、种子罐液体发酵培养、发酵罐液体发酵生产，生产条件如下：
假单胞菌(Pseudomonas sp.)采用LB液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种200毫升接种至10升PR培养基中；发酵温度为28℃，并用NH4OH 28％溶液将pH恒定调节至6-8，优选6.8；搅拌速率为400rpm，通气量设定为0.4(V/V)；当生物量的浓度达到10g/L-40g/L时停上发酵。
成团泛菌(Pantoea agglomerans)采用R4F液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种250毫升接种至10升R4F培养基中；发酵温度为28℃，并用NH4OH28％溶液将PH恒定调节至6-8，优选7.0；搅拌速率为100rpm，通气量设定为0.2(V/V)；当生物量的浓度达到10g/L-30g/L时停上发酵。
同时，R1菌株经16S rDNA序列测定，其序列在NCBI Genbank数据库中与已报道的Pseudomonas sp.菌株同源性高达98％，进一步确证提供的菌株R1为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
同时，R4菌株经16S rDNA序列测定，其序列在NCBI Genbank数据库中与已报道的Pantoea agglomerans菌株同源性高达99％，进一步确证提供的菌株R4为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。
实施例二：用于沼气低温发酵的复合微生物菌剂的制备
本发明提供巴氏醋杆菌(Acetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCCNo.4764和成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No.4765三种菌的发酵液分别按斜面菌种培养活化、摇瓶培养、种子罐液体发酵培养、发酵罐液体发酵生产，生产条件如下：
假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.4764采用LB液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种200毫升接种至10升PR培养基中；发酵温度为28℃，并用NH4OH 28％溶液将pH恒定调节至6-8，优选6.8；搅拌速率为400rpm，通气量设定为0.4(V/V)；当生物量的浓度达到10g/L-40g/L时停上发酵。
成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No.4765采用R4F液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种250毫升接种至10升R4F培养基中；发酵温度为28℃，并用NH4OH 28％溶液将PH恒定调节至6-8，优选7.0；搅拌速率为100rpm，通气量设定为0.2(V/V)；当生物量的浓度达到10g/L-30g/L时停上发酵。
巴氏醋杆菌(Acetobacter)：用FC液体培养基培养24小时制备菌种，用上述菌种250毫升接种至10升FC培养基中。发酵温度为28℃，并用NH4OH 28％溶液将pH恒定调节至4-7，优选7.0。搅拌速率为150rpm，通气量设定为0.1(V/V)。当生物量的浓度达到10g/L至20g/L时(优选12g/L)停上发酵。
LB培养基表面：培养基组分[g/ml]为每1000mL蒸馏水中加入3克牛肉膏；5克NaCL；10克蛋白胨；18-20克琼脂粉。
PR培养基：每1000mL蒸馏水中加入1克淀粉；5克Na2HPO4；5克酵母膏；10克蛋白胨；18-20克琼脂粉。
R4F培养基：每1000mL蒸馏水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；0.05克MgSO4·7H2O；0.5克K2HPO4；0.05克FeSO4·7H2O；0.05克MnSO4·H2O；20克蔗糖；18-20克琼脂粉。
R4G培养基表面：培养基组分[g/ml]为每1000mL蒸馏水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；10克蔗糖；2克NaNO3；0.5克MgSO4·7H2O；0.5克K2HPO4；18-20克琼脂粉。
FC培养基(g/L)：20克蔗糖，5克酵母膏，5克蛋白胨，2克Na2HPO4
将上述三种制备好的发酵液按等体积混合，可直接应用于沼气池。
实施例三：10℃、15℃-18℃、30℃下沼气发酵产气实验研究
进行了10℃、15℃-18℃(室温)、30℃条件下5L罐羊粪沼气发酵菌剂接种试验(添加5-10克菌剂)，对其产气条件及产气率进行了实验。结果为：只要沼气发酵装置中料液温度保持在大于10℃，以牛羊粪便为主要原料的沼气池，比不加菌剂的提高30％以上，参见附图1、2。

Claims (2)

1.一种用于沼气低温发酵的假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764。
2.一种用于沼气低温发酵的成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765。
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