CN105524858A - 一种有机废弃物的耐高温腐熟菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)H1-7，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC？NO：M2015174。H1-7菌剂在有机废弃物堆肥中的应用方法为将所述H1-7菌剂的发酵液和市售有机废腐熟剂按1:10～20的质量比混合，以0.2％～0.5％的接种量接入有机废弃物堆体发酵，可加快有机废弃物腐熟。本发明提供耐高温腐熟菌剂构成简单，制备方便，利于推广，在高温环境下能维持较好的降解效果，具有更强的环境适应性，加速了堆肥化进程。

Description

一种有机废弃物的耐高温腐熟菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵、废弃物资源化利用领域，特别涉及一种可以快速腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

有机废弃物包括作物秸秆、畜禽粪便、城市生活垃圾、污泥等。我国为农业大国，农业废弃物及畜禽粪便年产量达40亿吨以上，而城市生活垃圾年产量也达到了2.5亿吨以上，如此巨大的可再生资源，并未得到充分的利用。

目前，高温好氧堆肥逐渐成为处理有机废弃物的重要途径，可实现无害化、减量化和资源化。国内外学者针对堆肥腐熟菌剂开展了大量工作，并取得了丰厚的成果，但高温环境对腐熟菌剂的影响依旧值得深入探讨，堆肥化中有机废弃物主要降解过程在堆肥高温期，而高温环境抑制了大部分常温微生物，CN102010824、CN1772880等公布了多种由枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、酵母菌、小孢链霉菌、康宁木霉等微生物构成的复合微生物菌剂，但这些微生物活性在高温环境下会受到明显的抑制，大幅降低微生物活性，减缓腐熟进程，CN102851246公布了嗜热栖热菌在堆肥中的应用，栖热菌具有较好的温度适应性，但其生物量仅有10⁴～10⁶cfu/g，发酵周期长，产酶活性相对较低，不适合大规模推广。

在有机废弃物堆肥中接种耐高温菌剂，可有效提高有机质分解速率，缩短发酵周期，提高堆肥制品的质量。目前有机物料腐熟剂采用耐高温芽孢杆菌的报道并不多见。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有腐熟剂在有机废弃物处理中的应用缺陷，针对其升温慢、温度不稳定、微生物活性低及发酵周期长等问题，提供一种能耐受高温环境，且生物酶活性好的有机废弃物的腐熟菌剂。

本发明的另一目的是提供上述耐高温腐熟菌剂的应用。

一种腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，其特征在于：命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)H1-7，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2015174。

进一步地，所述H1-7菌剂，在55℃的环境中生长良好，55℃时的α-淀粉酶活可达62.1U/mL，蛋白酶活为673.2U/mL，纤维素酶活为6.75U/mL。

上述菌剂在有机废弃物堆肥中的应用。

进一步地，应用方法如下：将所述H1-7菌剂的发酵液和市售有机废腐熟剂按1:10～20的质量比混合，以0.2％～0.5％的接种量接入有机废弃物堆体发酵，可加快有机废弃物腐熟。

进一步地，所述H1-7菌剂发酵液的培养为：将H1-7菌株保藏斜面进行活化，挑取单菌落接入LB液体培养基，37℃恒温培养8-12h，种子液接入发酵培养基，起始pH6.5～8.0，装液量10～50mL，接种量0.1～5％，置于20～45℃恒温培养，转速100～240r/min，发酵24～48h。

进一步地，所述的发酵培养基为：葡萄糖1～25g/L，豆粕10～50g/L，K₂HPO₄0.1～2.5g/L，MgSO₄0.1～2.0g/L。

进一步地，所述市售有机废弃物腐熟剂，含有黑曲霉孢子10⁷个/g，解淀粉芽孢杆菌10⁸CFU/g。

本发明提供的有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，针对堆肥高温期温度大于55℃的特点，筛选能耐受55℃以上高温的芽孢杆菌，具有更好的微生物代谢活性，良好的产酶特性，有利于有机废弃物的分解。与现有有机废弃物微生物处理技术相比，本发明的有益效果表现在：1、通过堆肥初期接种耐高温菌剂，快速提高堆体温度，耐高温菌剂能在高温环境下能够维持较好的降解效果，具有更强的环境适应性，加速了堆肥化进程；2、本菌剂微生物构成简单，制备方便，利于推广。

附图说明

图1为本发明实施例提供的B.subtilisH1-7菌株16SrDNA序列分析。

图2为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理温度的变化。(注：CK：不接种微生物菌剂；T1：接种市售腐熟剂；T2：接种市售腐熟剂+耐高温腐熟剂。)

图3为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理微生物的变化。(注：实心图标为常温细菌(37℃培养)，空心图标为高温细菌(55℃培养))

图4为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理有机质的变化。

图5为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理种子发芽率的变化。

具体实施方式

现结合实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：本发明实施例提供的耐高温芽孢杆菌H1-7的筛选及鉴定

从自然堆肥及活性污泥中取样，利用梯度稀释涂布法分离微生物。将稀释涂布平板放置55℃培养箱恒温培养24h。挑选长势较快菌株分离纯化。用接种针将分离纯化菌株点接至淀粉平板、蛋白平板和纤维素刚果红平板上。培养24h后观察透明圈。通过测定透明圈与菌落直径比(见表1)进行初筛，初筛后进行液体产酶发酵复筛，从堆肥中获得8株降解淀粉、蛋白、纤维素效果较好的细菌(见表2)，其中H1-7菌株在55℃的环境下，产酶性能明显优于其他菌株，α-淀粉酶活可达62.1U/mL，蛋白酶活为673.2U/mL，纤维素酶活为6.75U/mL，对有机废弃物具有良好降解活性。

表1有机废弃物降解菌的筛选

表2各菌株生物酶活(培养温度：37℃)

H1-7为从土壤、自然堆肥及活性污泥中筛选所得，其温度耐受性好(在60℃的环境下可正常生长)，且在55℃条件下对淀粉、蛋白质及纤维素有较强的分解能力；筛选到的H1-7菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢，在LB平板上正反面均为白色，表面光滑，不透明，粘稠、挑之拉丝、圆形突起的菌落形态；序列见序列表1。

通过对H1-7菌株的16SrDNA序列分析，在GenBank核苷酸序列数据库中进行Blast比对搜索，选择与H1-7同源性较高的序列进行系统发育学分析，结果如图1所示。依据以上结果可以认为H1-7菌株为芽孢杆菌属，H1-7与枯草芽孢杆菌是同一种群菌株，并于2015年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2015174，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)。

H1-7菌株液体菌剂的培养：将H1-7菌株保藏斜面进行活化，挑取单菌落接入LB液体培养基，37℃恒温培养8-12h，种子液接入发酵培养基：葡萄糖1～25g/L，豆粕10～50g/L，K₂HPO₄0.1～2.5g/L，MgSO₄0.1～2.0g/L，起始pH6.5～8.0，装液量10～50mL(250mL锥形瓶)，接种量0.1～5％，置于20～45℃恒温培养，转速100～240r/min，发酵24～48h，得到H1-7菌剂的发酵液。所得H1-7的发酵液芽孢总数可达80×10⁸CFU/mL以上。

下面结合耐高温菌H1-7在有机废弃物堆肥中的应用实施例对本发明进一步详细说明。

实施例2本发明实施例提供的耐高温菌H1-7在餐厨垃圾秸秆混合堆肥中的应用

1、餐厨垃圾秸秆混合堆肥腐熟过程

将餐厨垃圾与秸秆(玉米秸秆、稻杆)按照湿基质比5：1进行混合，或根据物料理化性质调整C/N比例，使混合物料的C/N为25～35。

上述堆料制备方法，所述餐厨垃圾的粒径可为2～3cm；所述填料(稻杆、玉米秸秆等)的粒径为1～3cm。

将H1-7的发酵液和市售腐熟剂按1:10的质量比混合，按0.2％的接种量接入餐厨垃圾堆体中，堆体长宽高分别为1.5m×1.5m×1.0m，堆体含水率维持在60～65％，好氧堆肥发酵18d，即可腐熟。

上述市售腐熟剂为有机废弃物腐熟剂，其中黑曲霉孢子：10⁷个/g，解淀粉芽孢杆菌10⁹CFU/g。

每日测定堆体温度变化，定期取样(采用多点取样进行混合)。试验设置了3个处理，分别为处理1：不加任何微生物菌剂；处理2：添加0.2％的市售腐熟剂；处理3：按耐高温腐熟剂1份、市售腐熟剂10份的比例混合，添加0.2％混合腐熟剂。

测定项目：腐熟指标主要为温度、微生物、有机质、总钾和总磷、种子发芽率。

具体实验结果如下：

2.1温度

图2和表3为不同处理堆体的温度变化，T1和T2最高温度均为70℃，比CK高3℃，T2仅需1d快速升温至55℃，进入高温期，较CK组提前2d，且T2组高温期较CK组延长了3d，促进了堆肥腐熟。

表3不同处理堆体温度变化比较

2.2微生物含量

图3为堆肥过程中微生物的变化，由图3可知T2组微生物数量明显优于其他两组，堆肥第4d时T2组常温菌和耐高温菌(≥55℃)分别达到2.93×10⁸cfu/g和25.60×10⁸cfu/g，说明高温菌剂有利于堆肥中耐高温细菌的生长，从而加速有机质的降解。

2.3有机质含量

图4为堆肥过程中有机质的变化，由图4可知有机质含量随着堆肥发酵逐渐下降，CK、T1和T2三组堆体有机质分别由初始76.02％、74.74％和76.02％下降到堆肥结束的55.96％、55.45％和52.11％，分别下降了26.39％、25.81％和31.45％。

接种耐高温菌剂显著提高了餐厨垃圾有机质的降解率，并加速了其在高温期的降解速度。

2.4总钾和总磷

表4为堆肥过程中总钾和总磷的变化，堆肥结束时T2组总钾含量显著高于其他两组，总钾含量提高了135.53％；总磷含量也有一定的提高，结果说明接种耐高温腐熟剂能显著提高堆料的总钾含量，提高堆肥营养成分。

表4堆肥过程中不同处理总钾和总磷的变化

2.5种子发芽率(GI值)

图5为堆肥过程中不同处理GI的变化，在堆肥第18d时进入腐熟期，此时CK、T1和T2的GI分别为75.93％、88.83％和100.29％。T1、T2组较CK组分别提高了16.99％和32.08％。说明在堆肥中添加耐高温菌剂可加速度堆肥中植物毒害物质的降解，促进堆肥腐熟。

实施例3本发明实施例提供的耐高温菌H1-7在果蔬废弃物堆肥中的应用

将本发明中的耐高温菌剂应用于果蔬废弃物堆肥中，选取平菇渣为辅料，将果蔬废弃物与辅料按照C/N为25～30的范围进行混合，含水率维持在55％～65％之间，堆料接种市售腐熟剂，充分混合后，将本发明中所述H1-7发酵液和市售腐熟剂按照1:20的质量比复配，按照0.2％的接种量接种于堆料内，充分混匀，每隔3～4d翻堆一次，12～15d即可完全腐熟。有机质降解率提高了30％，堆料总氮含量大于2％，较对照组提高了25％。堆料腐殖质含量大于50g/Kg，较对照组提高了16％，堆肥营养成分显著提高。作为有机肥施用到小白菜种植中，小白菜鲜重增加40％，干重增加45％以上。

实施例4本发明实施例提供的耐高温菌H1-7在畜禽粪便堆肥中的应用

将本发明中的耐高温菌H1-7应用于猪粪与玉米秸秆的混合堆料中，将本发明中所述H1-7发酵液和市售腐熟剂按照1:10的质量比复配，按照0.5％的接种量接种于堆料内，充分混匀，控制堆肥含水率在55％～65％之间，堆肥初期每3天翻堆一次，腐熟期每5～7天翻堆一次，堆肥经15d～20d发酵即可腐熟，无臭味，质地松软。有机质降解率提高了38％，堆料总氮含量大于2％，较对照组提高了30％。堆料腐殖质含量大于50g/Kg，较对照组提高了24％，堆肥营养成分显著提高。作为有机肥施用到小白菜种植中，小白菜鲜重增加50％，干重增加55％以上。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>湖北大学

<120>一种有机废弃物的耐高温腐熟菌剂及其应用

<130>2015

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1430

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）

<400>1

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Claims (7)

1.一种腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，其特征在于：命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)H1-7，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2015174。

2.根据权利要求1中所述的菌剂，其特征在于：所述H1-7菌剂，在55℃的环境中生长良好，55℃时的α-淀粉酶活可达62.1U/mL，蛋白酶活为673.2U/mL，纤维素酶活为6.75U/mL。

3.权利要求1或2中所述菌剂在有机废弃物堆肥中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于方法如下：将所述H1-7菌剂的发酵液和市售有机废腐熟剂按1:10～20的质量比混合，以0.2％～0.5％的接种量接入有机废弃物堆体发酵，可加快有机废弃物腐熟。

5.如权利要求4中所述的应用，其特征在于：所述H1-7菌剂发酵液的培养为：将H1-7菌株保藏斜面进行活化，挑取单菌落接入LB液体培养基，37℃恒温培养8-12h，种子液接入发酵培养基，起始pH6.5～8.0，装液量10～50mL，接种量0.1～5％，置于20～45℃恒温培养，转速100～240r/min，发酵24～48h。

6.如权利要求5中所述的应用，其特征在于：所述的发酵培养基为：葡萄糖1～25g/L，豆粕10～50g/L，K₂HPO₄0.1～2.5g/L，MgSO₄0.1～2.0g/L。

7.如权利要求4中所述菌剂的应用，其特征在于：所述市售有机废弃物腐熟剂，含有黑曲霉孢子10⁷个/g，解淀粉芽孢杆菌10⁸CFU/g。