CN111748499A - 一种枯草芽孢杆菌bs40-4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，具体公开一种枯草芽孢杆菌BS40‑4及其应用。所述枯草芽孢杆菌BS40‑4的菌株保藏号为CGMCC No.19757。该菌株具有极端高温活性，能在110℃的高温下保持生长，且其适宜生长温度范围较广，可在30‑100℃保持较高活性并且具有很强的对抗外界有害因子(高温、强酸、强碱等)或不良刺激的能力，能够在较宽的pH(4.0‑12.0)环境中生存并保持较高活性，故可应用于有机废弃物的腐熟发酵。

Description

一种枯草芽孢杆菌BS40-4及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌BS40-4及其应用。

背景技术

随着我国畜禽养殖业生产规模的日益发展，畜禽粪污也成为环境污染的因素之一，因此，畜禽粪污的高效处理成为当下解决有机废弃物污染问题的关键。高温堆肥工艺是禽畜粪便资源化的重要途径之一，其机理是利用微生物在适宜条件下的代谢作用，实现有机质的氧化、矿化以及芳香化。畜禽粪污物种含有大量难以降解的大分子木质纤维素，因此，传统的对畜禽粪污进行堆肥的过程多考虑纤维素的降解程度以及腐熟程度。然而畜禽粪污物中除含有大量难以降解的木质纤维素之外，其还含有未分解和利用的淀粉、脂肪以及蛋白质等复杂大分子物质，且畜禽粪污的酸碱变化较大、盐度高成分及其复杂，利用传统的好氧堆肥技术对复杂的畜禽粪污进行腐熟无法实现畜禽粪污的高效腐熟。且传统的好氧微生物的腐熟温度偏低、腐熟周期长，腐熟过程易产生大量渗滤液造成二次污染。

针对成分复杂的畜禽粪污等有机废弃物，为了提高其腐熟效果，出现了包含多种菌株复配的菌剂，但是由于不同菌株的环境耐受性和最适生存条件存在差异，通过多种微生物复配得到的菌剂的效果并不理想。

发明内容

针对现有传统的好氧微生物对成分复杂的畜禽粪污等有机废弃物腐熟存在的腐熟周期长、腐熟温度低、降解效率差以及易产生二次污染的问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌BS40-4及其应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种枯草芽孢杆菌BS40-4，菌株保藏号为CGMCC No.19757，该菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2020年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

相对于现有技术，本发明提供的枯草芽孢杆菌BS40-4具有极端高温活性，能在110℃的高温下保持生长，且其适宜生长温度范围较广，可在30-100℃保持较高活性。同时，本发明提供的枯草芽孢杆菌BS40-4具有很强的对抗外界有害因子(高温、强酸、强碱、高盐度)或不良刺激的能力，能够在较宽的pH(4.0-12.0)环境中生存并保持较高活性。

除具有极端环境生长活性的特点之外，本发明提供的枯草芽孢杆菌BS40-4还同时兼具显著的纤维素酶活性、蛋白酶活性、脂肪酶活性和淀粉酶活性，可广泛用于畜禽粪便、作物秸秆等农业有机废弃物为原料的好氧堆肥中，提高堆肥的效率。因此，本发明的枯草芽孢杆菌BS40-4用于成分复杂的畜禽粪污等有机废弃物的腐熟发酵中时，可显著提高堆肥温度、延长发酵的高温期、缩短发酵周期。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌BS40-4在有机废弃物的腐熟发酵中的应用。

由于枯草芽孢杆菌BS40-4兼具较高的纤维素酶活性、蛋白酶活性、脂肪酶活性和淀粉酶活性，可使有机废弃物堆肥达到高度腐熟度，无渗滤液渗出。对于成分复杂的有机废弃物，无需多种菌株的复配且无需考虑多种菌种的生长环境，一种菌株即可达到良好的堆肥效果，具有极高的应用价值。

本发明还提供了包含所述枯草芽孢杆菌BS40-4的固体菌剂，所述固体菌剂包括吸附载体和所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉。

优选的，所述吸附载体为可溶性淀粉或碳酸钙。

优选的，所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉由所述枯草芽孢杆菌BS40-4的发酵菌液经喷雾干燥得到。

优选的，所述固体菌剂中的所述枯草芽孢杆菌BS40-4活菌数为1×10⁸CFU/g-5×10¹⁰CFU/g。

优选的，所述固体菌剂还包括由质量比为4-8:1-3:1-3的N、P₂O₅和K₂O组成的无机营养物，所述无机营养物的加入量为所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉质量的4-9倍。

本发明还提供了包含所述枯草芽孢杆菌BS40-4的液体菌剂，所述液体菌剂包括营养液和所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌体。

优选的，所述营养液中包含由质量比为4-8:1-3:1-3的N、P₂O₅和K₂O组成的无机营养物，所述无机营养物在所述液体菌剂中的质量浓度为10-20％。

优选的，所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌体是通过所述枯草芽孢杆菌BS40-4发酵液经板框过滤得到。

优选的，所述液体菌剂中的所述枯草芽孢杆菌BS40-4活菌数为1×10⁸CFU/mL-5×10¹⁰CFU/mL。

本发明还提供了利用所述固体菌剂进行有机废弃物堆肥的方法，具体是将堆肥原料粉碎后，在70-100℃下进行水解，再加入所述堆肥原料质量0.1-0.3％的所述固体菌剂，混合均匀，进行发酵。

本发明提供的利用所述固体菌剂进行有机废弃物堆肥的方法中，在堆肥原料中接入菌剂之前在70-100℃下进行水解，可进一步缩短腐熟时间，在保持较高腐熟程度的条件下，可使整个腐熟周期缩短至10天。

优选的，所述堆肥原料中的含水量为50-70％。

优选的，所述水解时间为2-10h。

优选的，在所述发酵过程中进行间歇式曝气，所述间歇式曝气的方式为连续曝气30-120min后停30-40min；所述连续曝气过程中每立方米所述堆肥原料的曝气量为50-200L/min。

本发明还提供了利用所述液体菌剂进行有机废弃物堆肥的方法，具体是将堆肥原料粉碎后，在70-100℃下进行水解，再加入所述堆肥原料质量0.1-0.3％的所述液体菌剂，混合均匀，进行发酵。

优选的，所述堆肥原料中的含水量为50-70％。

优选的，所述水解时间为2-10h。

优选的，在所述发酵过程中进行间歇式曝气，所述间歇式曝气的方式为连续曝气30-120min后停30-40min；所述连续曝气过程中每立方米所述堆肥原料的曝气量为50-200L/min。

附图说明

图1是本发明实施例1中菌株BS40-4的菌落形态图；

图2是本发明实施例1中菌株BS40-4的显微镜观察图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.1菌株的分离

从河北省石家庄市奶牛养殖厂采集牛粪-秸秆堆肥产物样品，用稀释涂平板的方法通过LB培养基(配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L)进行分离，得到45个菌株，将其进行5次平板传代后，获得稳定遗传的单克隆菌株，并在-80℃进行保存。

将分离的45个单克隆菌株用纤维素刚果红培养基(配方：硝酸钠1.0g，磷酸氢二钠1.2g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，酵母浸出粉0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，刚果红0.2g，纤维素粉5.0g，琼脂15.0g，pH 7.0±0.1，1000ml蒸馏水，121℃高压灭菌15min)，在50℃恒温箱中培养72h，根据培养基菌落的透明圈指数(透明圈直径D/菌落直径d≥4)，分离筛选耐高温、分泌纤维素酶且活性高的菌株，获得21株具有耐高温、高活性纤维素酶的菌株，于-80℃保存。

将初筛获得的21株具有耐高温、高活性纤维素酶的菌株从-80℃取出，分别划线接种于LB平板上进行活化，50℃培养24h。用接种环刮去LB平板上的菌落并接种于装有50ml的LB液体培养基的三角瓶中，50℃、200r/min摇床培养24h。分别取上述培养液1mL接种于秸秆培养基(配方：粉碎玉米秸秆2g、尿素3g、(NH4)₂SO₄ 6g、蛋白胨3g、CaCl₂ 0.1g、MgSO₄·7H₂O0.5g、K₂HPO₄ 1g、NaCl 0.1g、FeSO₄·7H₂O 0.05g、MnSO₄·7H₂O 0.016g、ZnSO₄·7H₂O0.014g、CoCl₂·6H₂O 0.037g、蒸馏水1000mL，pH 7.0±0.1，121℃高压灭菌30min)，50℃恒温箱中培养10d，检测秸秆的降解情况，有6株具有耐高温、高活性纤维素酶的菌株的秸秆降解率如表1所示，将其中玉米秸秆降解最佳的菌株BS40-4，于-80℃保存。所述秸秆降解率(％)＝(W₀-W_i)/W₀×100％，W₀代表接种菌株前培养基中秸秆的干质量(g)；W_i代表培养结束后培养基中秸秆的干质量(g)。

表1

1.2菌株BS40-4的16S rRNA鉴定

取-80℃保存的BS40-4菌株在LB固体培养基上50℃培养2天。观察菌落形态，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，如图1所示；显微镜观察细胞形态，细胞呈杆状，直径0.6μm-1.0μm，长1.5μm-2.0μm，芽孢中生，椭圆，如图2所示。

提取BS40-4菌株的基因组DNA，以BS40-4菌株的基因组DNA为模版，用16SrRNA通用引物的上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′和下游引物1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。电泳检测扩增产物纯度和大小，将扩增长度正确的PCR产物送上海生工进行测序，测序序列如SEQ ID NO:3，并在NCBI进行BLAST比较分析，根据BLAST结果，该BS40-4菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus s ubtilis的16SrRNA基因序列的相似性为100％。

综合菌落形态及和16SrRNA序列，可以确定本发明BS40-4菌株属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，命名为枯草芽孢杆菌BS40-4，并于2020年04月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.19757。

1.3枯草芽孢杆菌BS40-4的生理特征鉴定

将-80℃保存的枯草芽孢杆菌BS40-4划线接种于LB平板上，50℃培养24h。用接种环刮去LB平板上的BS40-4菌落并接种于装有50ml的LB液体培养基的三角瓶中，50℃、200r/min摇床培养24h。

取上述1ml BS40-4的LB培养液，接种至纤维素刚果红固体培养基上，分别在20℃、30℃、50℃、60℃、75℃、90℃、100℃和110℃的温度条件下培养3d，观察不同温度条件下菌株BS40-4的生长状况，结果如表2所示：

表2不同温度下BS40-4的生长状况

注：+表示可以生长(固体培养基上有菌落)，++生长状况良好(固体培养基上的菌落数在10-50个)，+++生长旺盛(固体培养基上的菌落数大于50个)。

由表2可知，枯草芽孢杆菌BS40-4能在高温条件下的纤维素刚果红培养基上生长良好，属于耐高温菌。

取上述1ml的BS40-4的LB培养液，分别接种至pH为4.5、6.0、7.5、9.0、10.5和11.5的纤维素刚果红固体培养基上，50℃培养3d，观察不同温度条件下BS40-4的生长状况，结果如表3所示：

表3不同pH下BS40-4的生长状况

注：+表示可以生长(固体培养基上有菌落)，++生长状况良好(固体培养基上的菌落数在10-50个)，+++生长旺盛(固体培养基上的菌落数大于50个)。

由表3可知，枯草芽孢杆菌BS40-4能在极端pH条件下的纤维素刚果红培养基上生长良好，属于耐酸碱菌。

1.4枯草芽孢杆菌BS40-4的产酶活性鉴定

对枯草芽孢杆菌BS40-4菌株的产脂肪酶的能力进行验证：将BS40-4菌株活化后接种至营养肉汤培养基中(蛋白胨10g/L、牛肉粉浸出粉3g/L、氯化钠5g/L，pH值7.2±0.2)，50℃培养24h。采用碱滴定法测定培养液中脂肪酶的活力。经测定，培养液中脂肪酶的活力为10.2U/mL。

将BS40-4菌株活化后接种至50mL脱脂奶粉培养基中(蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、脱脂奶粉1.5g、蒸馏水1000ml)中，50℃培养24h。采用Folin-酚法测定混合物中蛋白酶的活力。经测定，混合物中蛋白酶的活力为20.7U/mL。

将BS40-4菌株活化后接种至淀粉培养液中(蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml)，50℃培养24h。采用DNS法测定混合物中淀粉酶的活力。经测定，培养液中淀粉酶的活力为48.7U/mL。

将BS40-4菌株活化后接种至纤维素培养液中(蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、羧甲基纤维素钠5g、蒸馏水1000ml)，50℃培养24h。采用CMC糖化力法测定混合物中纤维素酶的活力。经测定，培养液中纤维素酶的活力为102.8U/mL。

通过枯草芽孢杆菌BS40-4的产酶活性鉴定可知，该枯草芽孢杆菌BS40-4兼具高产脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力。

实施例2

制备枯草芽孢杆菌BS40-4的固体菌剂

将实施例1中保藏的枯草芽孢杆菌BS40-4依次进行：

菌种活化：将-80℃保存的BS40-4菌株划线接种于LB平板上，50℃培养24h。

一级种子培养：用接种环刮去LB平板上的BS40-4菌落并接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，50℃、200r/min摇床培养24h。

二级种子发酵：将上述一级种子培养液按10％的接种量接种于装有10L的LB液体培养基的种子罐中，50℃、200rpm/min发酵1d。

扩大培养：将得到的二级种子发酵液按5％的接种量接种于装有50L的LB液体培养基的发酵罐中，50℃、200rpm/min发酵2d。

喷雾干燥：将枯草芽孢杆菌BS40-4的扩大培养液进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉。

将得到的枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉与可溶性淀粉混合，使其中的活菌数达到1×10⁹CFU/g，再加入菌粉质量5倍的无机营养物(3:1:1的N、P₂O₅和K₂O)，混合均匀，得到枯草芽孢杆菌BS40-4固体菌剂。

实施例3

制备枯草芽孢杆菌BS40-4的液体菌剂

将实施例2中得到的枯草芽孢杆菌BS40-4的扩大培养液通过板框过滤的方法得到枯草芽孢杆菌BS40-4菌体。

将得到的枯草芽孢杆菌BS40-4菌体加入营养液中(含有质量浓度为10-20％的无机营养物，无机营养物中N、P₂O₅和K₂O的质量比为3:1:1)，使其中的活菌数达到1×10⁹CFU/mL，得到枯草芽孢杆菌BS40-4液体菌剂。

实施例4

以新鲜猪粪和玉米秆秸为原料，利用实施例2中的固体菌剂进行堆肥，具体方法为：

原料预处理：新鲜猪粪(含水率73.5％)，秸秆(含水率6.9％)，秸秆经过粉碎处理，粉碎成粒径≤50mm的颗粒；将新鲜猪粪加热至90℃，保温5h，然后与粉碎后的秸秆按照质量比为4:1(猪粪：秸秆)混合，接种固体菌剂，接种量为发酵原料质量的0.2％；混合后原料的初始C/N比为25，含水率为60％；混合物料在发酵过程中进行间歇式曝气，每立方米原料的曝气量为100L/min，连续曝气80min后停30min。

发酵过程中，发酵第二天温度就达到了45℃，高温期维持时间为8天，发酵过程的最高温度达到96℃。

发酵过程结束之后，发酵产物经微生物检测，其大肠杆菌和蛔虫卵的杀灭率均达到100％。

发酵产物呈松散状态且没有任何氨臭味，其C/N比为12.3，含水率为30％，种子发芽率为99％，无渗滤液产生。

实施例5

以新鲜猪粪和玉米秆秸为原料，利用实施例3中的液体菌剂进行堆肥，具体方法为：

原料预处理：新鲜猪粪(含水率73.5％)，秸秆(含水率6.9％)，秸秆经过粉碎处理，粉碎成粒径≤50mm的颗粒；将新鲜猪粪加热至90℃，保温5h，然后与粉碎后的秸秆按照质量比为4:1(猪粪：秸秆)混合，接种液体菌剂，接种量为发酵原料质量的0.2％；混合后原料的初始C/N比为25，含水率为60％；混合物料在发酵过程中进行间歇式曝气，每立方米原料的曝气量为100L/min，连续曝气80min后停30min。

发酵过程中，发酵第二天温度就达到了45℃，高温期维持时间为8天，发酵过程的最高温度达到99℃。

发酵过程结束之后，发酵产物经微生物检测，其大肠杆菌和蛔虫卵的杀灭率均达到100％。

发酵产物呈松散状态且没有任何氨臭味，其C/N比为12，含水率为28％，种子发芽率为99％，无渗滤液产生。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科技大学 河北昊源环境工程有限公司 河北研用环境科技有限公司

<120> 一种枯草芽孢杆菌BS40-4及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 27f

<400> 1

agagtttgat cctggctc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 1492r

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1049

<212> DNA

<213> 16SrRNA

<400> 3

agaacagatt tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt tctgtccatt 60

gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc 120

aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc 180

atgcaccacc tgtcactctg cccccgaagg ggacgtccta tctctaggat tgtcagagga 240

tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt 300

gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag 360

tgcttaatgc gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc 420

gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc 480

agcgtcagtt acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc 540

atttcaccgc tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc 600

aatgaccctc cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgccctgcga 660

gccctttacg cccaataatt ccggacacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 720

cacgtagtag ccgtgccttt tctgataagg taccgtcaaa ggtaccggcc tattcgaacg 780

gtacttgttc ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg 840

cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 900

gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg 960

ttgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt 1020

ggtagccgaa gccacctttt atgtttgaa 1049

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌BS40-4，其特征在于：菌株保藏号为CGMCC No.19757。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BS40-4在有机废弃物的腐熟发酵中的应用。

3.包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BS40-4的固体菌剂，其特征在于：包括吸附载体和所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉。

4.如权利要求3所述的固体菌剂，其特征在于：所述吸附载体为可溶性淀粉或碳酸钙；和/或

所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉由所述枯草芽孢杆菌BS40-4的发酵菌液经喷雾干燥得到；和/或

所述固体菌剂中的所述枯草芽孢杆菌BS40-4活菌数为1×10⁸CFU/g-5×10¹⁰CFU/g；和/或

所述固体菌剂还包括由质量比为4-8:1-3:1-3的N、P₂O₅和K₂O组成的无机营养物，所述无机营养物的加入量为所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌粉质量的4-9倍。

5.包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BS40-4的液体菌剂，其特征在于：包括营养液和所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌体。

6.如权利要求5所述的液体菌剂，其特征在于：所述营养液中包含由质量比为4-8:1-3:1-3的N、P₂O₅和K₂O组成的无机营养物，所述无机营养物在所述液体菌剂中的质量浓度为10-20％；和/或

所述枯草芽孢杆菌BS40-4菌体是通过所述枯草芽孢杆菌BS40-4发酵液经板框过滤得到；和/或

所述液体菌剂中的所述枯草芽孢杆菌BS40-4活菌数为1×10⁸CFU/mL-5×10¹⁰CFU/mL。

7.利用权利要求3或4所述的固体菌剂进行有机废弃物堆肥的方法，其特征在于：将堆肥原料粉碎后，在70-100℃下进行水解，再加入相当于所述堆肥原料质量0.1-0.3％的所述固体菌剂，混合均匀，进行发酵。

8.如权利要求7所述的进行有机废弃物堆肥的方法，其特征在于：所述堆肥原料的含水量为50-70％；和/或

所述水解时间为2-10h；和/或

在所述发酵过程中进行间歇式曝气，所述间歇式曝气的方式为连续曝气30-120min后停30-40min；所述连续曝气过程中每立方米所述堆肥原料的曝气量为50-200L/min。

9.利用权利要求5或6所述的液体菌剂进行有机废弃物堆肥的方法，其特征在于：将堆肥原料粉碎后，在70-100℃下进行水解，再加入相当于所述堆肥原料质量0.1-0.3％的所述液体菌剂，混合均匀，进行发酵。

10.如权利要求9所述的进行有机废弃物堆肥的方法，其特征在于：所述堆肥原料的含水量为50-70％；和/或

所述水解时间为2-10h；和/或

在所述发酵过程中进行间歇式曝气，所述间歇式曝气的方式为连续曝气30-120min后停30-40min；所述连续曝气过程中每立方米所述堆肥原料的曝气量为50-200L/min。

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