CN108441437A - 一种复合菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种降解吲哚的微生物复合菌剂，该复合菌剂由产碱菌(Alcaligenes sp.)1‑C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)3‑RC5两株细菌组成。所述菌株分离自养鸡场废弃物，其中，产碱菌(Alcaligenes sp.)1‑C51已经在2017年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15137；谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)3‑RC5已经在2017年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15136。本发明提供的菌株和复合菌剂，可高效降解吲哚，涉及的菌株具有较广的温度、pH和盐度适应性，复合菌剂可用廉价原料通过共发酵的方式制备，因此在畜禽业除臭以及废弃物无害化处理方面具有应用前景。

Description

一种复合菌剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域。
背景技术
我国畜禽养殖业的生产经营方式正逐渐向规模化、集约化养殖方向发展，在生产大量产品满足市场需求的同时，产生了大量的废弃物。养殖期间及废弃物堆放过程中恶臭气体的排放，严重污染了养殖场周边环境，对动、植物及人体健康构成危害。
吲哚是养殖场排放的恶臭的主要成分之一，可抑制植物色素合成，并对动物和微生物具有毒性并有致癌、致突变作用，是近年来逐渐引起关注的新兴环境污染物。
处理恶臭气体的方法分为物理法、化学法和生物法。生物降解法因具有操作简单、无二次污染等优势，成为污染物的控制与环境修复的有效方式。但目前发现的降解吲哚的菌株效率有限，且尚无以较低成本获得大量功能菌株的培养方法阐明。因此，开发高效、低成本的吲哚降解微生物制剂，具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的是提供两种降解吲哚的菌株和含两菌株的复合菌剂，所述菌株及复合菌剂可高效去除吲哚，从而达到对畜禽废弃物除臭的效果。
本发明提供的复合菌剂，由产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5两株细菌组成。其中，产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51已于2017年12月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为：CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.15137，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5已于2017年12月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为：CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.15136，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述两个菌株分离自畜牧废弃物样品。
产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51具有以下特性：
在LB固体培养基上的菌落形态为乳白色，光滑湿润，稍隆起，圆形；革兰氏染色菌体呈红色，为革兰氏阴性菌，短杆状；有氧化酶活性；具有硝酸盐还原活性，可将硝酸盐还原为氮气；不产吲哚；可发酵葡萄糖；水解左旋氨酸、尿素；可利用苹果酸和苯乙酸；具有酯酶(C4)、亮氨酸氨基肽酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性。
谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5有以下特性：
在LB固体培养基上的菌落呈黄色，光滑湿润，圆形；革兰氏染色菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌，杆状；具有硝酸盐还原活性，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐；无氧化酶活性；不产吲哚；可发酵葡萄糖；可利用葡萄糖、阿拉伯糖、D-麦芽糖、葡萄糖酸钾、苹果酸枸橼酸钠和苯乙酸；具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、酯酶(C14)、亮氨酸氨基肽酶、缬氨酸氨基肽酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶活性。
本发明提供的复合菌剂中产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5的有效菌数量比例为17-75％：25-83％。
优选地，所述产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5的有效菌数量比为17-25％：75-83％。
本发明还提供了一种复合菌剂的制备方法。其制备方法包括如下步骤：
将上述产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5接种于LB固体培养基，控制培养温度为28-35℃，培养时间12-16h，刮取菌苔用ddH20制成菌悬液，将产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5以1-3:1-5的比例混合作为种子液；将种子液以1％的体积比接入发酵培养基，培养条件为初始pH6-10，温度30-35℃，振荡速度为130-220rpm，培养时间为24h，所得的培养液即为复合菌剂。
优选地，产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5接入比例为1:3，培养温度为35℃，振荡速度为160rpm，初始pH调节为7。
进一步地，所述LB固体培养基包括如下成分：蛋白胨8-12质量份，酵母提取物4-6质量份，氯化钠8-12质量份，琼脂粉15-20质量份,蒸馏水970-980质量份。
进一步地，所述的发酵培养基配方为：玉米浆干粉15-25质量份，糖蜜15-25质量份，蒸馏水970-980质量份。
本发明的有益效果为：
1.产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5对不同环境有较好的适应性。
2.在自然环境中具有比较广泛的分布，具有环境生态安全性。
3.复合菌剂中两种微生物协同作用，实现了对吲哚的高效降解，降解效率相对于已有单一菌株具有明显优势。
4.通过低成本培养基对复合菌剂中涉及的菌株进行共发酵，所得的培养液中细胞浓度较高，大大降低了去除畜牧废弃物中吲哚的成本，为畜牧废弃物除臭提供了切实可行的方法技术。
附图说明
图1为产碱菌1-C51对不同浓度吲哚的降解效果图。
图2为谷氨酸杆菌3-RC5对不同浓度吲哚的降解效果图。
图3为产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5在不同温度下对吲哚的降解效果图。
图4为产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5在不同初始pH下对吲哚的降解效果图。
图5为产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5在不同NaCl浓度下对吲哚的降解效果图。
图6为产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5混合菌剂对吲哚的降解效果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便更好地阐述本方面的方案及其各方面的优点。应当指出，以下描述的具体实施方式和实施例的目的仅为说明，并不是对本发明的限制。
实施例1
产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5的富集培养及分离纯化
产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5菌株分离自农场鸡粪样品。
(1)取5g农场鸡粪样品悬浮于50mL无机盐液体培养基中。无机盐液体培养基配方为磷酸二氢钾0.2质量份、磷酸氢二钾0.8质量份、氯化钠5质量份、氯化亚铁0.001质量份、氯化镁1质量份、氯化钙0.05质量份，蒸馏水970-980质量份。
(2)加入0.1mM吲哚，调节初始pH为7.0，30℃、160rpm培养7天。
(3)将所得培养液以1％的接种量接种于新的无机盐液体培养基，重复步骤(2)中的操作4次，逐渐提高吲哚浓度至0.5mM，对降解吲哚的菌进行富集。
(4)将上述最终培养液进行10梯度稀释，取10-5-10-7稀释度的各0.1mL涂布于加0.5mM吲哚的无机盐固体培养基。30℃静置培养3-4天，挑取单菌落于无机盐固体培养基划线分离，纯化三次。无机盐固体培养基配方为上述无机盐液体培养基中加入15质量份的琼脂粉。
(5)对纯化后的菌落测定对吲哚的降解性能，选择降解率高的菌株，从而得到菌株1-C51和3-RC5。
实施例2
产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5的观察、鉴定和种属分析。
将经分离纯化的菌株1-C51和3-RC5分别接种于LB固体培养基，30℃培养24小时。挑取少量菌体制备透射电子显微镜样本，经负染后进行观察。LB培养基配方为蛋白胨10质量份，酵母提取物5质量份，氯化钠10质量份。LB固体培养基在液体培养基基础上加入15质量份琼脂粉。
产碱菌1-C51在电镜下呈短杆状，细胞大小为0.9×1.5-2.0μm，有鞭毛。谷氨酸杆菌3-RC5呈杆状，细胞大小为1.2×2.1-3.7μm，有鞭毛。
将产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5接种于LB固体培养基，30℃培养12小时，挑取菌苔少量于500μL ddH2O并打散细胞成为菌悬液。采用煮沸裂解法提取菌株的DNA，将菌悬液放入沸水中煮10min，使细胞裂解，8000rpm离心5min后取上清液作为菌株16S rRNA基因扩增的模板。
PCR反应体系为模板DNA 1.5μL、10×扩增缓冲液5μL、dNTP混合物2μL、Taq DNA聚合酶0.5μL、上下游引物27F/1492R各1μL、ddH2O 39μL。所述引物序列为27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’以及1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR反应程序为94℃5min，94℃30s，54℃50s，72℃1.5min，循环30次，72℃8min，4℃保存。
按照Trans pEASY-T1克隆试剂盒说明将PCR产物与pEASY-T1载体连接。
将连接产物转入感受态细胞Trans-T1，均匀涂布菌液与含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基平板，37℃培养12h，挑取平板上生长的白色单克隆，接种于液体LB培养基(AMP+)中，37℃、160rpm培养6h。
将上述液体培养液8000rpm/min离心5min，弃去上清后用ddH2O洗涤两次并重悬细胞，用上述煮沸法提取单克隆的基因组DNA作为模板，用引物M13Forward Primer和M13Reverse Primer对目的片段进行扩增，以鉴定阳性克隆。所述引物序列为：M13ForwardPrimer:5’-TGACCGCAGCAAAATG-3’；M13Reverse Primer:5’-GTCCTTTGTCGATACTG-3’。PCR反应体系和PCR反应程序如上文所述。
对PCR产物进行测序，将所得序列在EzTaxon数据库(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对，寻找相似序列。用软件MEGA 6.0对相似性较高的序列进行分析，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，确定两菌株的系统发育地位。
菌株1-C51经测序后得到的16S rRNA基因片段序列长度为1489bp，提交NCBIGenBank数据库，登录号为MG738330，该序列与Alcaligenes faecalis subsp.faecalisNBRC 1311菌株的相似性最高，达98.70％，系统发育分析表明，菌株1-C51也与Alcaligenesfaecalis subsp.faecalis NBRC 1311聚类在一起，因此确定菌株1-C51为产碱菌属菌株。
菌株3-RC5的16S rRNA基因片段序列长度为1437bp，提交NCBI GenBank数据库，登录号为MG738331，该序列与Glutamicibacter soli SYB2菌株的相似性最高，达100％，系统发育分析表明，菌株3-RC5也与Glutamicibacter soli SYB2聚类在一起，因此确定菌株3-RC5为谷氨酸杆菌属菌株。
实施例3
产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5对吲哚的降解能力
将产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5接种于LB固体培养基，30℃培养24小时，分别挑取菌苔于去离子水，将细胞打散混匀后作为菌悬液，控制菌悬液OD值为1.0±0.02。
在无机盐培养基中加入吲哚，使其终浓度为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM，调节初始pH为7.0，按体积分数1％分别加入上述菌悬液，30℃、160rpm/min培养5天，定期取样，经8000rpm/min离心5min后取上清作为待测样品。
无机盐培养基配方如实施例1所述。LB培养基配方如实施例2所述。
通过高效液相色谱对上清样品中吲哚浓度的测定，由此检测菌株1-C51和3-RC5对吲哚的降解效果(附图1、2)。
图1、2的结果表明：
菌株1-C51分别在12h、24h、48h内将0.5mM、1mM、1.5mM的吲哚完全降解。随吲哚浓度的升高，菌株对吲哚的降级效率逐渐降低。5d内1-C51对2mM的吲哚降解率为77.81％，对2.5mM吲哚降解率为47.10％。
菌株3-RC5分别在12h、36h、60h内将0.5mM、1mM、1.5mM的吲哚完全降解。随吲哚浓度的升高，菌株对吲哚的降解效率逐渐降低。5d内1-C51对2mM的吲哚降解率为67.38％，对2.5mM吲哚降解率为58.28％。
实施例4
不同温度产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5对吲哚的降解
按实施例3所述制备菌株1-C51和3-RC5菌悬液。
在无机盐液体培养基中加入吲哚作为唯一碳源、氮源，吲哚浓度为0.5mM。按体积比1％的接种量分别接入菌悬液，初始pH为7.0，静置培养，控制温度为22℃、26℃、30℃、35℃、40℃和45℃。培养至相同时间对培养液进行取样，经8000rpm/min离心5min后取上清作为待测样品，通过高效液相色谱对上清样品中吲哚浓度的测定。
无机盐培养基配方如实施例1所述。
图3的结果表明：
菌株1-C51和菌株3-RC5对温度适应性较好，不同温度对菌株降解吲哚的效果有一定影响，但均可在22-35℃范围降解内将0.5mM吲哚完全降解。菌株1-C51在30℃条件下降解效率最高，菌株3-RC5在22-35℃范围内降解效率较为稳定(附图3)。
实施例5
不同pH条件下产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5对吲哚的降解
按实施例3所述制备菌株1-C51和3-RC5菌悬液。
在无机盐培养基中加入吲哚作为唯一碳源、氮源，吲哚浓度为0.5mM。按体积比的接种量1％分别接入菌悬液，培养温度为30℃，转速为160rpm，分别将初始pH调节为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。培养至相同时间对培养液进行取样，经8000rpm/min离心5min后取上清作为待测样品，通过高效液相色谱对上清样品中吲哚浓度的测定。
无机盐培养基配方如实施例1所述。
图4的结果表明，不同初始pH对菌株1-C51降解吲哚的效果有一定影响，但菌株1-C51和菌株3-RC5对pH的适应性较好，在pH6.0-8.5范围内都能降解吲哚。菌株1-C51在pH为7.5-8.5范围时降解效果较好，菌株3-RC5对吲哚的降解效果几乎不受pH影响(附图4)。
实施例6
不同NaCl浓度下产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5对吲哚的降解
按实施例3所述制备菌株1-C51和3-RC5菌悬液。
在无机盐培养基中加入吲哚作为唯一碳源、氮源，吲哚浓度为0.5mM。分别加入NaCl,使培养基中NaCl的质量分数分别为0、1％、2％、3％、4％。按体积比的接种量1％分别接入OD值为1±0.02的菌悬液，培养温度为30℃，初始pH为7.0，转速为160rpm，培养至相同时间对培养液进行取样，经8000rpm/min离心5min后取上清作为待测样品，通过高效液相色谱对上清样品中吲哚浓度的测定。
无机盐培养基配方如实施例1所述。
图5的结果表明，NaCl浓度的升高会影响吲哚的降解效率，但菌株1-C51在NaCl浓度为0-3％范围内都能将吲哚完全降解。菌株3-RC5在NaCl浓度为0-1％范围内降解效率较高(附图5)。
实施例7
产碱菌1-C51、谷氨酸杆菌3-RC5及其二者混合对吲哚的降解效果
按实施例3所述制备菌株1-C51和3-RC5菌悬液，将OD值为1±0.02的两菌株菌悬液等体积混合，将单菌种菌悬液和等体积混合菌悬液分别作为降解吲哚的接种液。
在无机盐培养基中加入吲哚，使其终浓度为1mM、1.5mM、2mM、2.5mM，调节初始pH为7.0，按体积分数1％在各体系中加入上述单菌种菌悬液和等体积混合菌悬液，30℃、160rpm/min培养7天，每间隔12h取样500μL，经8000rpm/min离心5min后取上清作为待测样品。通过高效液相色谱对上清样品中吲哚浓度的测定，对比混合菌剂和单一菌株对吲哚的降解效果。
无机盐培养基配方如实施例1所述。
结果如表1所示，加入单菌种菌悬液和混合菌悬液的实验组都能将1mM和1.5mM的吲哚完全降解，但混合菌降解相同浓度的吲哚所需时间少于任一单一菌株。吲哚浓度为2mM和2.5mM时，单一菌株在7天内不能将吲哚完全降解，但混合菌在4天内能实现吲哚的完全降解。因此，菌株1-C51和3-RC5混合对吲哚的降解效率要优于单一菌种，一方面可以降解更高浓度的吲哚，另一方面对于低浓度的吲哚的降解速度更快。
表1加入不同菌株降解吲哚所用的时间
实施例8
产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5不同比例混合对吲哚的降解效果
按实施例3所述制备菌株1-C51和3-RC5菌悬液，将两菌株的菌悬液按照3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5的细胞数量比例混合,作为降解吲哚的接种液。
在无机盐培养基中加入吲哚，使其终浓度为1.5mM，调节初始pH为7.0，按体积分数1％在各体系中加入上述菌悬液，30℃、160rpm/min培养48h，在培养34h和48h时取样500μL，经8000rpm/min离心5min后取上清作为待测样品。通过高效液相色谱对上清样品中吲哚浓度的测定，由此检测菌株1-C51和3-RC5混合菌剂对吲哚的降解效果。
无机盐培养基配方如实施例1所述。
结果表明，在初始接入菌悬液中产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5的混合比例为17-75％：25-83％(即3:1-1:5)的范围内，两菌株混合后都能在48h内将1.5mM吲哚完全降解。两菌株比例在17-25％：75-83％(即1:3-1:5)时，吲哚的降解速率较快(表2)。
表2产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5不同比例混合对吲哚的降解效果
实施例9
产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5复合菌剂的制备
按实施例3所述制备菌株1-C51和3-RC5菌悬液。
分别按1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的菌体数量比例将菌株1-C51和3-RC5的菌悬液混合，作为发酵种子液。按1％体积比将混合种子液接种于发酵培养基。培养基配方为玉米浆干粉20g/L，糖蜜20g/L。调节初始pH为7.0。液体培养过程中，控制温度为30-35℃，转速为130-190rpm，振荡培养24h，所得到的培养液即复合菌剂。通过稀释涂布平板法对菌剂中细胞密度进行计数，结果如表3所示。
表3产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5不同接种比例发酵后的细胞密度
接种比例(1-C51：3-RC5) 细胞密度(×1010CFU/mL)
1:1 1.25±0.04
2:1 1.34±0.18
3:1 1.47±0.03
4:1 1.74±0.04
5：1 1.61±0.16
实施例10
产碱菌1-C51和谷氨酸杆菌3-RC5复合菌剂的应用
按实施例9将菌株1-C51和3-RC5混合培养，得到的培养液即为两菌株共发酵获得的复合菌剂。将复合菌剂以0.01％的接种量接入含有1mM吲哚的无机盐液体培养基，30℃、160rpm/min培养24h，定期取样500μL，经8000rpm/min离心5min后取上清作为待测样品。通过高效液相色谱对上清样品中吲哚浓度的测定，由此检测复合菌剂对吲哚的降解效果。
所述无机盐液体培养基配方如实施例1所述。
结果表明，所述复合菌剂在24h内将1mM吲哚完全降解。
以上对本发明的具体实施方式进行了详尽描述，需要理解的是，在不脱离本发明原理的前提下进行的若干改进和修饰，也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51，其保藏编号为CGMCC No.15137。
2.一株谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5，其保藏编号为CGMCCNo.15136。
3.权利要求1或/和2所述的菌株在制备的降解吲哚制剂中的应用。
4.一种复合菌剂，其特征在于，其活性成分包括：产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51、谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5；
所述的产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5的有效菌数量比为17-75％：25-83％。
5.一种复合菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
将产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5接种于LB固体培养基，控制培养温度为28-35℃，培养时间为12-16h；
挑取菌苔于ddH2O制备菌悬液；
将产碱菌(Alcaligenes sp.)菌株1-C51和谷氨酸杆菌(Glutamicibacter sp.)菌株3-RC5以1-3:1-5的菌体数量比例混合作为种子液；
将种子液以1％的体积比接入发酵培养基；
初始pH为6-10，培养温度为30-35℃，转速为130-220rpm，振荡培养24h，所得到的培养液即为所述复合菌剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的LB固体培养基为：蛋白胨8-12质量份，酵母提取物4-6质量份，氯化钠8-12质量份，琼脂粉15-20质量份，蒸馏水970-980质量份。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下成分：玉米浆干粉15-25质量份，糖蜜15-25质量份，蒸馏水970-980质量份。
8.根据权利要求4所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的细胞密度为1.25-1.74×1010CFU/mL。
9.权利要求4所述的复合菌剂在制备降解吲哚制剂或除臭中的应用。
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