CN112725215A - 一种拮抗梨火疫病原菌的复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开拮抗梨火疫病菌复合菌剂、其制备方法及应用，通过对采用贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)按照特定质量比例混合，形成用于拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂。本发明的优点在于，该高效拮抗梨火疫病原菌的复合菌剂对梨火疫病原菌具有明显的抑菌效果，这对于防治梨火疫病原菌导致的相关病害的具有广泛的实用价值。

Description

一种拮抗梨火疫病原菌的复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵的研发技术领域。具体地，本发明涉及一 种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂及其制备方法与 应用的技术领域。
背景技术
梨火疫病最早于1780年发生于美国东北部纽约州，是世界上最 早发现的细菌性植物病害。病原菌为Erwinia amylovora，属于肠杆 菌科，欧文氏菌属，革兰氏阴性菌。病原菌寄主范围很广，涉及40 多个属220种植物。可以侵染花、叶片、嫩梢、幼果、枝条和树干，引起花序枯死、枯枝、果实腐烂和整株死亡。梨火疫病菌传播途径 十分广泛，苗木、风、雨、鸟类、昆虫及人为因素均可引起该病原 菌的传播。病原菌一旦入侵，能在寄主植物上终身定殖，进而扩散 蔓延，迅速流行，难以控制和根除，造成严重的经济损失。
梨火疫病的防治以化学农药为主，虽然有一定防效，但易造成农药残留， 危害人体健康，破坏生态平衡，且长期使用农药防治火疫病，极易使病原菌 产生耐药性。美国使用链霉素防治梨火疫病50年后，出现了抗链霉素的 梨火疫病菌株，增加了火疫病防治难度。生物防治利用微生物产生的次 生代谢产物防治病害，可有效解决农药残留问题，不会使病原菌产生耐药 性且对人体无害，也不会造成环境污染。研究表明，Pantoea agglomeransE352可通过产生聚酮地非西丁、二肽巴氏有效抑制梨火疫病菌 Erwinia amylovora的生长繁殖，但其不易在田间定殖，尤其在盐碱环 境中更难以生存。芽胞杆菌可耐高温、低温、紫外线和盐碱，具有较强的 生存和定殖能力，能够产生具有抗菌、增产的次生代谢产物，是开发生物农药 的重要资源。
本发明创造性的提出了能够与梨火疫病原菌Erwinia amylovora产 生拮抗作用的菌株及形成复合菌剂的技术方案，能够提升抵御感染梨 火疫病风险的能力。
发明内容
针对现有技术中在防治梨火疫病原菌Erwinia amylovora的方式 多采用化学制剂，危害人体健康，破坏生态平衡，且长期使用极易产生耐 药病原菌的技术现状，现有技术也尚未见有针对复合菌剂协同抑制梨 火疫病原菌的报道。本发明旨在提供一种拮抗梨火疫病原菌的复合菌 剂制备方法及应用，对防治梨火疫病具有广泛的实用价值。
本发明提供一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌 剂，复合菌剂由贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类 芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌 (Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)发酵混合液构成。
进一步的，本发明还提供了上述一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂的制备方法，具体的采用以下步骤制备获得:
(1)选取低温保存的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、 多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆 菌(Bacillus methylotrophicus)中的分别接种至NA培养基平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至NB培养液中；选取低温保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 接种至MRS固体培养基平板，30℃培养24h左右，待长出单菌落， 挑取单菌落接种至MRS培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化 培养12h或24h，吸取0.5mL种子液；
(2)将步骤(1)中获得的种子液分别接种至相应的液体培养基， 于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数达到2×109cfu/mL；
(3)将步骤(2)获得的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、 多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆 菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌剂按照特定质量比进行复配，制备获得拮抗Erwiniaamylovora的复合菌剂。
本发明中，拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂由 贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌 (Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)， 复合菌剂按照质量比为(2-6):(3-1):2:1混合获得。
优选的，拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂由贝 莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌 (Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)、和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)， 复合菌剂按照质量比为4:2:2:1混合获得。
本发明中，采用的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多 粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌 (Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)均为农业部允许使用的无害安全菌株，普通技术人员可 以通过中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)公众渠道获得。， 贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌 (Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的 培养基及扩大培养方法都是本领域普通技术人员通过公知常 识获得。
进一步，本发明提供的上述一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂用于制备抑制梨火疫病原菌活性药物中的应 用。
进一步的，本发明提供的上述一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂用于制备防治梨火疫病药物中的的应用。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果:
本发明旨在提供一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复 合菌剂及其制备方法与应用，以贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基 营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)混合，创造性的提供一种拮抗梨火疫 病原菌Erwiniaamylovora的复合菌剂及其制备方法与应用，与现有 技术相比，该菌剂对梨火疫病原菌Erwinia amylovora有较好的抑制作 用。且对环境生态平衡不具有破坏性，这对于防治制备梨火疫病药物 中害具有广泛的实用价值。
附图说明
图1所示为部分菌株平板对峙实验结果图。
其中，图a所示为复合菌剂拮抗效果；图b所示为单一菌剂拮抗 效果。
图2所示为拮抗菌与其相近标准菌株16S rRNA基因序列构建 的系统发育树。
图3所示为拮抗菌生长曲线图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施 例。
本发明中涉及的材料和设备：
本发明所采用的材料为：病原菌：Erwinia amylovora Ea-1由吉尔 吉斯斯坦国立农业大学提供，寄主为梨。
土壤样品：2019年6月，采用随机取样法，对新疆库尔勒、库 车、阿克苏、轮台等地区的盐碱土壤(土壤层5-20cm)进行采样， 获得样品100余份。
蒙金娜无机磷细菌培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4 0.3g，MnSO4·4H2O0.03g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaCl 0.3g， Ca3(PO4)2 10.0g，去离子水1000mL，琼脂粉17g。
硝酸盐细菌培养基：蔗糖5g，MgSO4 0.5g，CaCO3 0.1g，Na2HPO4 2g，FeCL3 0.005g，钾长石粉1g，去离子水1000mL，琼脂粉17g。
营养琼脂(NA)培养基、营养肉汤(NB)培养基、MRS培养 基、琼脂粉等均为国产分析纯试剂，引物、dNTPs、Taq酶等试剂均 购自上海生工生物技术服务有限公司。
本发明所采用的设备为：恒温摇床、培养皿、无菌操作台、牛津 杯、PCR仪、水浴锅、高压灭菌锅、酶标仪、分光光度计、电泳仪、 电泳槽、微波炉、紫外凝胶成像仪。
本发明中选用的所有材料、试剂及仪器都为本领域熟知选用的， 但不限制本发明的实施。
实施例一：一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂
本发明提供一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌 剂由贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌 (Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 混合组成。
一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂的制备方 法，具体的采用以下步骤制备获得:
(1)选取低温保存的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、 多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆 菌(Bacillus methylotrophicus)中的一种或几种分别接种至NA 培养基平板，30℃培养12h，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至NB培养液中；选取低温保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)接种至MRS固体培养基平板，30℃培养24h，待长出单 菌落，挑取单菌落接种至MRS培养液中，于30℃160rpm恒温摇床 中活化培养12-24h，取0.5mL种子液；
(2)将步骤(1)中获得的种子液分别接种至相应的液体发酵培 养基，于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数分别达到 2×109cfu/mL；
(3)将步骤(2)获得的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、 多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、甲基营养型芽胞杆 菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)按照特定质量比进行复配，制备获得拮抗Erwiniaamylovora的复合菌剂。
实施例二：拮抗Erwinia amylovora的菌种初筛
病原菌的活化：将病原菌划线接种于NA培养基上，28℃条件下培 养约12h，挑取单菌落接种于30mL无菌NB培养基中，28℃160rpm恒 温摇床中培养12h后，梯度稀释至2×105cfu/mL，取100μL菌悬液涂布 于NA培养基。
土壤微生物的分离：称取5g土样溶解于50mL去离子无菌水中， 30℃160rpm恒温摇床中振荡活化30min，梯度稀释至10-3、10-4，取 100μL涂布于含有病原菌的培养基平板上，30℃条件下培养12-24h， 对产生抑菌圈的菌进行纯化与保藏。
对已有的乳酸菌，划线接种于MRS固体培养基，30℃培养至长 出单菌落，挑取单菌落接种至MRS液体培养基，发酵培养12-24h， 取1mL发酵液备用。将上述涂有病原菌的平板中心放置1个无菌牛 津杯，吸取150μL准备好的拮抗菌发酵液加入牛津杯中，28℃恒温 培养箱中放置培养24-36h，观察拮抗效果。
通过上述方法，共获得了36株对梨火疫病原菌Erwinia amylovora具 有潜在拮抗作用的菌。
实施例三：拮抗Erwinia amylovora的菌种复筛
利用牛津杯扩散法对拮抗菌的抑菌能力再次进行验证，并根据抑 菌圈直径与菌落的直径比值的大小来比较各待测菌株拮抗能力的强 弱。
将初筛到的芽胞类拮抗菌接种至NB液体培养基，乳酸菌类拮抗 菌接种至MRS液体培养基，于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h， 取1mL发酵液备用。在涂布了100μL病原菌(浓度为2×105cfu/mL) 的NA培养基上，放置2个无菌牛津杯备用。吸取150μL拮抗菌发 酵液加入牛津杯中，28℃恒温培养箱中放置培养24-36h，观察拮抗效 果。
结果表明，36株菌均有拮抗效果。采用抑菌圈直径(D)与菌落直 径(d)比值(D/d)的大小来比较菌抑菌能力的强弱，其中11株菌D/d 值>1.5，分别命名为AE1-AE11，结果如表1所示。其中，AE2的抑菌 作用最强，抑菌圈直径(D)与菌落的直径(d)比值为3.53；其次为AE7、 AE9、AE10、AE1、AE11和AE6，D/d值均大于2.50。
表1：平板对峙法菌株抑菌圈抑菌圈直径(D)与菌落直径(d)比值
菌株编号 D/d
AE1 2.94±0.25
AE2 3.53±0.31
AE3 2.40±0.20
AE4 1.83±0.11
AE5 1.74±0.17
AE6 2.68±0.15
AE7 3.38±0.29
AE8 1.92±0.11
AE9 3.23±0.38
AE10 3.17±0.38
AE11 2.93±0.26
注：D表示抑菌圈直径，d表示菌落直径，D/d值越大表明拮抗作用越强。
实施例四：拮抗Erwinia amylovora的菌种分子鉴定
采用三线划板法将拮抗菌接种于相应培养基，置于30℃恒温培养 箱12-24h。挑取单菌落接种至相应液体培养基，采用细菌基因组提取 试剂盒提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，细菌16S rRNA通 用引物27F、1492R为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系50μL： 模板DNA2μL，PCR预混液25μL，27F和1492R(10μmol/L)各1μL， ddH2O补充至50μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，57℃30s， 72℃1.5min，30个循环；72℃5min。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检验， 获得大小约1500bp的目的条带。切胶纯化回收目的条带，送往北京鼎国 生物技术有限公司进行序列测定。所得序列通过NCBI数据库进行 BLAST比对，通过MEGA7.0软件对分离的拮抗菌及模式菌序列进行 系统发育分析。
对上述11株梨火疫病原菌的拮抗菌进行16S rRNA测序分析，将测 得的菌株序列提交至GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)， 进行Blast比对。根据比对结果，结合相似度最高的模式菌株构建系统发 育树，如附图2所示。通过比对及系统发育树可知，所得的11株菌分 别归属于细菌域的厚壁菌门的2个属。具体结果如表2所示，9株为芽 胞杆菌属(Bacillus)，分别为：贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基 营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)、解淀粉芽胞杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)； 2株菌为乳杆菌属，初步鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
表2：拮抗菌的分子鉴定
供试菌株 比对结果 同源性(％)
AE1 Bacillus velezensis 99.79
AE2 Bacillus velezensis 99.64
AE3 Bacillus amyloliquefaciens 99.93
AE4 Bacillus velezensis 100
AE5 Bacillus subtilis 99.81
AE6 Bacillus velezensis 99.72
AE7 Paenibacillus polymyxa 99.66
AE8 Bacillus velezensis 99.92
AE9 Bacillus methylotrophicus 99.80
AE10 Lactobacillus plantarum 99.82
AE11 Lactobacillus plantarum 99.95
实施例五：拮抗Erwinia amylovora的菌种生理生化鉴定
挑选平板对峙实验D/d比值大于2.5的AE1、AE2、AE6、AE7、 AE9、AE10、AE11菌株进行生理生化鉴定，以麦氏比浊法为参照， 制备0.5麦氏比浊的菌悬液，以细菌微量检定管生理生化指标测定。参照 《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》进行归类判定。挑 取单菌落接种于高压灭菌后的蒙金娜无机磷培养基(硅酸盐细菌培养 基)中后，置于30℃恒温培养箱中培养7d左右，取出观察有无溶磷 圈(油滴状菌落)出现。
对上述筛选的7株菌株的生理生化特征进行分析，结果如表3 所示，7株菌均为革兰氏阳性菌，均可利用D-葡萄糖且接触酶呈阳性 性，氧化酶、硫化氢产气、吲哚试验呈阴性，但对鼠李糖、甲基红、甘 露醇的利用存在一定差异。除AE10、AE11外，5株芽胞杆菌属菌还 可利用L-阿拉伯糖、明胶，水解淀粉、硝酸盐还原试验、VP试验 均呈阳性。
表3:拮抗菌的生理生化特征
Figure BDA0002765460500000111
Figure BDA0002765460500000121
对上述筛选的7株菌的生长特性进行分析，结果如表4所示。生长 温度实验结果表明，7株菌均可在20-40℃条件下生长；但仅有菌AE10 在10℃条件下也可生长；4株菌可在50℃条件下生长，分别为:AE1、 AE2、AE6和AE9。耐盐实验结果表明，7株菌均可耐受2％-7％的NaCl； 4株菌可耐受9％的NaCl，分别为:AE1、AE2、AE7和AE9；仅有2株菌 可耐受10％的NaCl，分别为:AE2、AE7。pH实验结果表明，7株菌均 可在pH5-9条件下生长；仅有1株菌在pH10条件下生长，为AE2。
表4：拮抗菌的生长特性
Figure BDA0002765460500000122
Figure BDA0002765460500000131
实施例六：拮抗Erwinia amylovora的菌种生长曲线测定
挑取单菌落菌株接入30mL相应液体培养基中培养12-24h后，取 600μL菌液接入60mLNB培养基中放入30℃160rpm恒温摇床中培养， 每2h测试其OD600值，每处理设置3组平行。
对上述7株具有较强抑菌作用的菌的生长曲线进行分析，结果如附 图3所示。实验结果表明：7株菌中，AE2生长速率最快，AE6生长速 率最慢；总体来看，芽胞菌前期生长较快，乳酸菌前期生长较慢，但后 期OD值可以达到与芽胞杆菌生长同等水平，或高于芽胞杆菌OD值。
实施例七：拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂
基于上述实施例一到六，选取筛选所得低温保存的贝莱斯芽胞杆 菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌菌株分别接种于NB液体 培养基，植物乳杆菌接种于MRS液体培养基，30℃160rpm恒温摇 床中活化培养12-24h，取0.5mL种子液分别接种于相应发酵培养基， 于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数分别达到 2×109cfu/mL；将获得的贝莱斯芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营 养型芽胞杆菌和植物乳杆菌发酵菌液按照2∶3∶2∶1质量比进行复 配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂。
实施例八：拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂
基于上述实施例一到七，选取筛选所得低温保存的贝莱斯芽胞杆 菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌菌株分别接种于NB液体 培养基，植物乳杆菌接种于MRS液体培养基，30℃160rpm恒温摇 床中活化培养12-24h，取0.5mL种子液分别接种于相应发酵培养基， 于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数分别达到 2×109cfu/mL；将获得的贝莱斯芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营 养型芽胞杆菌和植物乳杆菌发酵菌液按照4∶1∶2∶1质量比进行复 配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂。
实施例九：拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂
基于上述实施例一到八，选取筛选所得低温保存的贝莱斯芽胞杆 菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌菌株分别接种于NB液体 培养基，植物乳杆菌接种于MRS液体培养基，30℃160rpm恒温摇 床中活化培养12-24h，取0.5mL种子液分别接种于相应发酵培养基， 于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数分别达到 2×109cfu/mL；将获得的贝莱斯芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营 养型芽胞杆菌和植物乳杆菌发酵菌液按照4∶2∶2∶1质量比进行复 配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂。
实施例十：拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂
基于上述实施例一到九，选取筛选所得低温保存的贝莱斯芽胞杆 菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌菌株分别接种于NB液体 培养基，植物乳杆菌接种于MRS液体培养基，30℃160rpm恒温摇 床中活化培养12-24h，取0.5mL种子液分别接种于相应发酵培养基， 于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数分别达到 2×109cfu/mL；将获得的贝莱斯芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营 养型芽胞杆菌和植物乳杆菌发酵菌液按照4∶3∶2∶1质量比进行复 配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂。
实施例十一：拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂
基于上述实施例一到十，选取筛选所得低温保存的贝莱斯芽胞杆 菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌菌株分别接种于NB液体 培养基，植物乳杆菌接种于MRS液体培养基，30℃160rpm恒温摇 床中活化培养12-24h，取0.5mL种子液分别接种于相应发酵培养基， 于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数分别达到 2×109cfu/mL；将获得的贝莱斯芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌、甲基营 养型芽胞杆菌和植物乳杆菌发酵菌液按照6∶1∶2∶1质量比进行复 配，制备获得拮抗Erwinia amylovora的复合菌剂。
实施例十二：复合菌剂抗菌效果测定
基于上述实施例一到十一，选取实施例七至实施例十一中制备获 得的拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂，分别编组1-5 组，利用平板对峙法对拮抗菌的抑菌能力再次进行验证，并根据抑菌 圈直径与菌落的直径比值的大小来比较各待测菌株拮抗能力的强弱。 在涂布了100μL病原菌(浓度为2×105cfu/mL)的NA培养基上，放 置2个无菌牛津杯备用。吸取150μL拮抗菌发酵液加入牛津杯中， 28℃恒温培养箱中放置培养24-36h，观察拮抗效果。
表5：平板对峙法复合菌剂抑菌圈直径(D)与菌落直径(d)比值
Figure BDA0002765460500000151
Figure BDA0002765460500000161
注:D表示抑菌圈直径，d表示菌落直径，D/d值越大表明拮抗作用越强。
结果表明，复合菌剂抑菌效果中抑菌圈直径(D)与菌落直径(d)比值 (D/d)的大小均比单独菌株强，其中，复合菌剂按照贝莱斯芽胞杆菌、 多粘类芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌和植物乳杆菌发酵菌液按照4： 2∶2∶1质量比进行复配时获得的复合菌剂，抑菌圈直径(D)与菌落的 直径(d)比值为4.02，抑菌作用最强。
可见本发明所提供的是四种菌种构成的组合菌剂对于Erwinia amylovora具有较好的抑制作用，其中贝莱斯芽胞杆菌、多粘类芽胞 杆菌、甲基营养型芽胞杆菌、植物乳杆菌按照4∶2∶2∶1的质量 比复配制备的复合菌剂具有最佳的抑菌效果。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发 明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱 离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂，其特征在于，所述的复合菌剂中包含有效成分选自贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)组成的混合复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂的制备方法，其特征在于，采用以下步骤制备获得：
(1)选取低温保存的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)分别接种于NA平板，30℃培养1-2d，挑取单菌落接种至NB液体培养基，160rpm恒温摇床中培养12h，取0.5mL种子液；选取低温保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)接种至MRS固体平板，30℃培养1-2d，挑取单菌落接种至MRS液体培养基，于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，取0.5mL种子液；
(2)将步骤(1)中获得的种子液分别在于相应发酵培养基，于30℃160rpm恒温摇床中培养12-24h，活菌数分别达到2×109cfu/mL；
(3)将步骤(2)获得的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)按照特定质量比进行复配，制备获得拮抗Erwiniaamylovora的复合菌剂。
3.根据权利要求2所述的拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述的复合菌剂由贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)复合菌剂按照质量比为(2-6):(3-1):2:1混合获得。
4.根据权利要求3所述的拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂，其特征在于，所述的有效成分贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)复合菌剂按照质量比为4∶2∶2：1混合获得。
5.权利要求1至4任一项所述所述的拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂用于制备抑制梨火疫病原菌活性药物中的应用。
6.权利要求1至5任一项所述所述的拮抗梨火疫病原菌Erwinia amylovora的复合菌剂用于在制备防治梨火疫病原菌药物中的应用。
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