CN110343645A - 一株菌株短小芽孢杆菌sem-7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株短小芽孢杆菌SEM‑7及其应用，属于微生物应用技术领域，所述短小芽孢杆菌的保藏编号为CDMCC No：60106；所述短小芽孢杆菌可以有效吸附重金属镉和铬，降低土壤中可溶性重金属镉和铬的含量；同时所述短小芽孢杆菌还可以溶解钾长石，解钾能力高于市售的解钾菌肥。

Description

一株菌株短小芽孢杆菌SEM-7及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一株短小芽孢杆菌SEM-7及其应用。

背景技术

我国土壤重金属污染形势严峻。近年来，我国土壤重金属污染事件不断发生，不仅对耕地与农产品质量构成严重威胁，还直接损害了人民群众的身体健康，影响基本的社会生活。建设土壤重金属污染治理试点示范工程，加强修复技术体系研究和推广应用，防控和修复土壤重金属污染，提高土壤环境质量，保障生态环境与食物安全，已成为国家重大现实需求。

目前，世界都面临着重金属污染的难题，国内外治理土壤重金属污染的途径主要是将重金属从土壤中去除，以及改变重金属在土壤中的价态和形态，降低其在环境中的迁移以及生物有效性。前者主要适用于重金属污染严重的土壤，后者主要适用于轻、中度重金属污染的土壤。重金属的治理和修复方法主要有化学修复法、物理修复技术、生物修复技术、农业生态修复技术、联合修复技术等。

生物修复是利用生物技术治理污染土壤的一种新方法，利用生物削减净化土壤中的重金属或降低重金属毒性。生物修复包括植物修复技术和微生物吸附技术，目前已成为当前环境保护工程科学和技术研究的一个新热点。微生物修复是利用微生物(细菌、藻类和酵母等)来减轻或消除重金属污染，微生物修复的机理包括:①通过微生物作用，改变重金属在土壤中的化学形态，使重金属固定或解毒，降低其在土壤环境中的移动性和生物可利用性；②通过微生物吸收、代谢达到对重金属的削减、净化与固定作用。与物理、化学修复方法相比，应用环境生物修复技术处理污染物时，最终产物大都是无害、稳定的物质，不破坏植物生长所需的土壤环境，可以使污染物完全从环境中去除，处理时间短，并且投资少，不会产生二次污染，操作简单。

但是目前关于处理重金属污染的微生物菌株的筛选及其土壤环境对菌株修复作用的影响还有待于进一步研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株短小芽孢杆菌SEM-7及其应用；所述短小芽孢杆菌SEM-7来源于蚕沙，具有较好的高温耐受性，可以有效吸附重金属镉和铬，降低土壤中可溶性重金属镉和铬的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株短小芽孢杆菌SEM-7(Bacillus pumilus)，所述短小芽孢杆菌的保藏编号为CDMCC No：60106。

本发明提供了所述的短小芽孢杆菌SEM-7在处理土壤重金属污染中的应用。

优选的，所述重金属包括镉和铬。

优选的，所述短小芽孢杆菌SEM-7为固体菌粉或液体发酵菌液。

优选的，所述短小芽孢杆菌SEM-7为液体发酵菌液时，所述短小芽孢杆菌SEM-7的浓度为(2～3)×10⁸cfu/mL。

优选的，所述重金属镉的浓度为40～60mg/mL。

优选的，所述重金属的铬浓度为80～120mg/mL。

本发明提供了所述的短小芽孢杆菌SEM-7在溶解钾长石中的应用。

优选的，所述短小芽孢杆菌SEM-7溶解钾长石的温度为28～32℃。

优选的，所述短小芽孢杆菌SEM-7溶解钾长石的温度为30℃。

本发明的有益效果：本发明提供的短小芽孢杆菌SEM-7来源于蚕沙，具有较好的高温耐受性，可以有效吸附重金属镉和铬，降低土壤中可溶性重金属镉和铬的含量；对重金属镉的吸附效率达49.9％，对重金属铬的吸附效率达34.8％，有效降低了溶液中重金属镉和铬的含量；同时所述短小芽孢杆菌还可以溶解钾长石，解钾能力高于市售的解钾菌肥。

生物保藏说明

本发明提供的短小芽孢杆菌SEM-7(Bacillus pumilus)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60106，保藏日期为2016年11月14日，保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510075。

具体实施方式

本发明提供了一株短小芽孢杆菌SEM-7(Bacillus pumilus)，所述短小芽孢杆菌的保藏编号为CDMCC No：60106。

本发明中，所述短小芽孢杆菌SEM-7是从蚕沙中分离纯化后得到，所述短小芽孢杆菌SEM-7的菌落形态如下：菌落淡黄色，圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐。本发明所述短小芽孢杆菌SEM-7为革兰氏阳性菌株，菌体椭圆形，短杆状。本发明所述短小芽孢杆菌SEM-7的16srDNA的部分可变区序列测序结果通过NCBI/blast比对后发现与T246株的16s序列同源性最高，达99.79％以上，确定为短小芽孢杆菌。

本发明还提供了所述的短小芽孢杆菌SEM-7在处理土壤重金属污染中的应用。

在本发明中，所述重金属优选的包括镉和铬；本发明提供的所述短小芽孢杆菌SEM-7能够吸附镉和铬；在本发明所述的应用过程中，所述待吸附重金属镉的浓度优选为40～60mg/mL，更优选为50mg/mL；所述待吸附重金属的铬浓度优选为80～120mg/mL，更优选为100mg/mL。在本发明中，所述短小芽孢杆菌SEM-7在应用过程中，优选为固体菌粉或液体发酵菌液；当所述短小芽孢杆菌SEM-7为液体发酵菌液时，所述短小芽孢杆菌SEM-7的浓度优选为(2～3)×10⁸cfu/mL。

在本发明中，所述短小芽孢杆菌SEM-7固体菌粉通过以下方法制备获得：将所述芽孢杆菌SEM-7活化后进行连续两级发酵、浓缩获得浓缩菌液；将所述浓缩菌液与载体混合后喷雾干燥获得所述芽孢杆菌SEM-7固体菌粉。

在本发明中，将所述短小芽孢杆菌SEM-7接种于NB液态培养基中培养12～16h获得一级种子液；所述培养的温度优选为37℃，所述培养的转速优选为200rpm；所述培养的时间优选为14h。

本发明在得到一级种子液后，将所述一级种子液转接于NB液态培养基中培养8～12h获得二级种子液。本发明中，所述一级种子液转接的接种量优选为0.7％～1％(v/v)；所述培养优选的在发酵罐中进行，所述培养的过程中进行通气，所述通气的通气比优选为1:1；所述培养的温度优选为37℃，所述培养的转速优选为200～400rpm，更优选为300rpm；所述培养的时间优选为10h。在本发明中，所述二级种子液的OD₆₀₀优选为0.8～0.9；所述二级种子液中活菌含量优选为10⁷cfu/mL。

本发明在获得所述二级种子液后，将所述二级种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养获得发酵菌液。在本发明中，所述二级种子液的接种量优选为0.5～1％(v/v)；所述发酵培养优选的在发酵罐中进行，所述发酵培养的过程中罐压优选的维持在0.05Mpa；所述发酵培养过程中进行通气，所述通气的通气比优选为1:(1～1.5)；所述发酵培养的温度优选为37℃，所述发酵培养的转速优选为200～400rpm，更优选为300rpm；所述发酵培养的时间优选为45～55h，更优选为50h。在本发明中，所述发酵菌液中短小芽孢杆菌SEM-7活芽孢含量优选为5～6×10⁹cfu/mL。在本发明中，所述发酵培养基以水为溶剂，每升优选的包括以下质量浓度的组分：玉米粉10～20g，葡萄糖2.5～7.5g，豆饼粉15～25g，蚕蛹粉2.5～7.5g，CaCO₃ 4～6g，(NH₄)₂SO₄ 0.5～1.25g，K₂HPO₄ 0.2～0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.4g，MnSO₄·H₂O 0.1～0.4g。所述发酵培养基在使用前优选的经过高温湿热灭菌；所述高温湿热灭菌的温度优选为121℃，所述高温湿热灭菌的时间优选为20min。

本发明在获得所述发酵菌液后，将所述发酵菌液浓缩获得浓缩菌液。在本发明中，所述浓缩的倍数优选为10～20倍；所述浓缩的方法优选为碟片离心或微滤；本发明对所述碟片离心或微虑的具体参数设置没有特殊限定，采用常规的参数设置实现上述倍数的浓缩即可。

本发明在获得所述浓缩菌液后，将所述浓缩菌液与载体混合后喷雾干燥获得所述短小芽孢杆菌SEM-7固体菌粉。在本发明中，所述载体优选为轻质碳酸钙；所述浓缩菌液与轻质碳酸钙的质量比优选为(95～105):3，更优选为100:3。在本发明中，所述喷雾干燥的进风口温度优选为180～200℃，所述喷雾干燥的出风口温度优选为80～85℃。在本发明中，所述短小芽孢杆菌SEM-7固体菌粉中含水量小于5％(W/W)，所述短小芽孢杆菌SEM-7菌粉中活芽孢数优选为(1～3)×10¹¹cfu/g，更优选为2×10¹¹cfu/g。

本发明还提供了所述的短小芽孢杆菌SEM-7在溶解钾长石中的应用。在本发明中，所述短小芽孢杆菌SEM-7能够以钾长石为唯一钾源生长繁殖，将钾长石中的难溶钾转化为可溶性钾。在本发明中，所述短小芽孢杆菌SEM-7溶解钾长石的温度优选为28～32℃，更优选为30℃。在本发明具体实施过程中，优选的将所述短小芽孢杆菌SEM-7接种到以钾长石为唯一钾源的培养基中培养测定所述小芽孢杆菌SEM-7的解钾能力；所述培养的温度优选为30℃，所述培养的时间优选为3～5d，更优选为4d；所述培养过程中，优选的伴随震荡，所述震荡的转速优选为150～250rpm，更优选为200rpm。本发明在所述培养结束后，优选的进行固液分离，收集上清液，测定所述上清液中有效钾的浓度，从而确定所述短小芽孢杆菌SEM-7的解钾能力。在本发明中，所述上清液中的有效钾浓度的测定优选的采用原子发射光谱法进行。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)样品稀释：从发酵腐熟的蚕沙堆肥中取样，称取5g溶解到装有45mL无菌水的三角瓶中，150rpm振荡器振荡成均匀的10^-1稀释液，然后用1mL移液枪吸取该稀释液1mL至装有9mL无菌水的试管中，充分摇匀，即制成10^-2的样品稀释液，并依次稀释至10^-6，分别获得10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的样品稀释液。

(2)培养基准备：

解钾筛选培养基：葡萄糖10.0g，NH₄NO₃ 3.0g，NaH₂PO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，钾长石1.5g，蒸馏水1000mL，琼脂20.0g，pH 7.0～7.4，灭菌20min。

马铃薯土豆培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL、pH 6.8～7.2；

NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0；121℃灭菌20min，于45℃-55℃倾倒至无菌的培养皿。

(3)菌种分离、纯化与筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1mL，均匀涂布于冷却好的解钾筛选培养基，放置30℃培养箱中倒置培养5天，观察并挑选长势良好、解钾圈显著的菌落于NA培养基培养；将所挑选出菌于NA培养基多次分离继代培养后，得到一个解钾效果显著的单菌落，命名为SEM-7菌株。

(4)菌株的鉴定

A、形态鉴定：Bacillus pumilus SEM-7菌株的菌落淡黄色，圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐。革兰氏染色阳性、菌体短杆状。

B、16srDNA比对分析：以菌株悬液为模板，16srDNA通用引物27F/1492R，PCR反应体系为50μL，其中：10x PCR buffer 5μL，dNTPmix 2.5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，taq酶1μL，模板2μL，ddH₂O 35.5μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物纯化后送样测序。测得序列在NCBI进行BLAST比对分析。

(5)菌株SEM-7鉴定结论

根据菌株形态及16srDNA比对分析结果，鉴定SEM-7为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。

实施例2

短小芽孢杆菌SEM-7对重金属镉的吸附

将短小芽孢杆菌菌株活化，1％(v/v)接种NB培养基，37℃摇床过夜，计数菌株浓度为2～3×10⁸cfu/mL，将菌液与镉标准液配制成菌株浓度10⁸cfu/mL，镉终浓度为50mg/L的混合培养液，混匀、静置5～6h，4000rpm离心5min，取上清，空白培养基、50mg/L标准稀释液(空白培养基稀释标准液)对照及混合培养液分别设三个重复，采用原子吸收光谱法检测上清液中可溶性镉的含量。结果表明，本发明短小芽孢杆菌SEM-7处理后，上清液镉浓度为24.9±0.98mg/L，对重金属镉的吸附效率达49.9％，有效降低了溶液中重金属镉的含量。

实施例3

短小芽孢杆菌SEM-7对重金属镉的吸附对比实验

将短小芽孢杆菌SEM-7菌株及其的短小芽孢杆菌IP10、IP14和IP16(参见蚕沙堆肥过程中解磷解钾细菌的分离与鉴定，蚕业科学，2018,44(5)：0753-0759)分别活化，1％(v/v)接种NB培养基，37℃摇床过夜，计数菌株浓度为2～3×10⁸cfu/mL，将菌液与镉标准液配制成菌株浓度10⁸cfu/mL，镉终浓度为50mg/L的混合培养液，混匀、静置5～6h，4000rpm离心5min，取上清，检测上清液中可溶性镉的含量。结果如表1中所示，本发明菌株短小芽孢杆菌SEM-7对重金属镉的吸附效率达49.9％，显著高于其他三株短小芽孢杆菌。

表1短小芽孢杆菌SEM-7、IP10、IP14和IP16对重金属镉吸附效率

实施例4

短小芽孢杆菌SEM-7对重金属铬的吸附

将短小芽孢杆菌SEM-7菌株活化，1％(v/v)接种NB培养基，37℃摇床过夜，计数菌株浓度为2～3×10⁸cfu/mL，将菌液与铬标准液配制成菌株浓度10⁸cfu/mL，铬终浓度为100mg/L的混合培养液，混匀、静置5～6h，4000rpm离心5min，取上清，对照跟混合培养液分别设三个重复，采用原子吸收光谱法检测上清液中可溶性铬的含量。结果表明，本发明菌株短小芽孢杆菌SEM-7处理后，上清液铬浓度为51.8±2.98mg/L，相对于未添加菌液的对照上清液的83.4±2.91mg/L，本发明短小芽孢杆菌SEM-7对重金属铬的吸附效率达37.8％，有效降低了溶液中重金属铬的含量。

实施例5

短小芽孢杆菌SEM-7对重金属铬的吸附对比

将短小芽孢杆菌SEM-7菌株及其短小芽孢杆菌IP10、IP14和IIP16分别活化，1％(v/v)接种NB培养基，37℃摇床过夜，计数菌株浓度为2～3×10⁸cfu/mL，将菌液与铬标准液配制成菌株浓度10⁸cfu/mL，铬终浓度为50mg/L的混合培养液，混匀、静置5～6h，4000rpm离心5min，取上清，检测上清液中可溶性铬的含量。结果如表2中所示，本发明短小芽孢杆菌SEM-7对重金属铬的吸附效率达37.9％，显著高于其他三株短小芽孢杆菌。

表2短小芽孢杆菌SEM-7、IP10、IP14和IP16对重金属铬吸附效率

实施例6

短小芽孢杆菌SEM-7菌液、固体菌粉的制备：

活化短小芽孢杆菌SEM-7菌株，挑取单菌落，接种于100mL NB液态培养基(121℃下，灭菌20min)中，37℃、200rpm下培养14h，得到一级种子液。

将一级种子液接入无菌的种子罐中，接种量为0.7～1％(v/v)；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为200～400rpm，培养温度37℃，罐压0.05MPa，培养时间为10h，培养结束时得到二级种子液，二级种子液中活菌含量为10⁷cfu/mL，OD值在0.8～0.9，此时菌种活力强。

短小芽孢杆菌SEM-7的菌液发酵

将短小芽孢杆菌SEM-7的二级种子液，按照接种量为0.5～1％(v/v)接入无菌发酵罐中，培养条件为：通气比1:1.3，搅拌转速为300rpm，培养温度35℃，罐压0.05MPa，保持5％以上的溶氧条件，培养时间为50h；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中短小芽孢杆菌SEM-7活芽孢含量为5～6×10⁹cfu/mL，得到发酵成熟菌液。

短小芽孢杆菌SEM-7原粉的制备

上述所得的发酵成熟菌液(活芽孢含量为5～6×10⁹cfu/mL)经碟片离心机或微滤设备浓缩15倍后，加入轻质碳酸钙(载体)搅拌混合均匀，浓缩成熟发酵菌液与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度为180～200℃，出风口温度为80-85℃。得到芽孢杆菌SEM-7固体菌粉，菌粉中含水量小于5％(W/W)，活芽孢含量2×10¹¹cfu/g。

实施例7

短小芽孢杆菌SEM-7对难溶钾的解钾能力

解钾培养基配方：葡萄糖10.0g，NH₄NO₃ 3.0g，NaH₂PO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，钾长石1.5g，蒸馏水1000mL，琼脂20.0g，pH 7.0～7.4，灭菌20min。

将短小芽孢杆菌SEM-7菌株及对照菌株(来自市场化的解钾菌肥)活化，分别按照1％(v/v)的接种量接种至NB培养基，37℃摇床过夜，然后再以1％(v/v)的接种量接种到以钾长石粉为唯一钾源的选择培养基中培养，30℃，200rpm振荡培养4d后，收集培养液，6000rpm，离心10min，收集上清液，用原子发射光谱法检测上清液中有效钾的浓度。结果表明：本发明的短小芽孢杆菌SEM-7发酵上清液中的有效钾浓度为56.5±3.82mg/L，对照菌发酵上清液中的有效钾浓度为39.5±1.93mg/L；本发明菌株发酵上清液中的有效钾浓度为是对照菌株的143％，解钾效率显著高于对照菌株。

由上述实施例可知，本发明提供的短小芽孢杆菌SEM-7来可以有效吸附重金属镉和铬，降低土壤中可溶性重金属镉和铬的含量；同时所述短小芽孢杆菌还可以溶解钾长石，解钾能力高于市售的解钾菌肥。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株短小芽孢杆菌SEM-7(Bacillus pumilus)，其特征在于，所述短小芽孢杆菌的保藏编号为CDMCC No：60106。

2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌SEM-7在处理土壤重金属污染中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重金属包括镉和铬。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌SEM-7为固体菌粉或液体发酵菌液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌SEM-7为液体发酵菌液时，所述短小芽孢杆菌SEM-7的浓度为(2～3)×10⁸cfu/mL。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重金属镉的浓度为40～60mg/mL。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重金属的铬浓度为80～120mg/mL。

8.权利要求1所述的短小芽孢杆菌SEM-7在溶解钾长石中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌SEM-7溶解钾长石的温度为28～32℃。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述短小芽孢杆菌SEM-7溶解钾长石的温度为30℃。