CN105820982A

CN105820982A - 一种赤红球菌xs-2、其生物菌剂及制备方法和应用

Info

Publication number: CN105820982A
Application number: CN201610276747.9A
Authority: CN
Inventors: 程辉彩; 习彦花; 张丽萍; 崔冠慧; 王宏伟; 邢清朝; 何强; 张根伟; 尹淑丽; 刘洪伟
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd; Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2036-04-29
Also published as: CN105820982B

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体公开了一株保藏号为CGMCCNo.11562的赤红球菌XS‑2，其具有降解化学农药的作用。本发明还提供了含有此赤红球菌的微生物制剂及其制备方法，其是将此赤红球菌与沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌及短短芽孢杆菌复配制成，该微生物制剂具有修复农药污染土壤及防病促生的作用，且环境安全性好，具有良好的开发应用前景。

Description

一种赤红球菌XS-2、其生物菌剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种赤红球菌XS-2、其生物菌剂及制备方法和应用。

背景技术

目前我国有机农药总施用量达131.2万t（成药），平均施用量为1.40g/m²，已远超出发达国家。随着人们生活水平的提高和饮食结构改善，蔬菜和瓜果种植面积大幅度增加，其农药用量高出粮食作物1-2倍。生产中施用的农药除部分被植物吸收或逸入大气外，约80%进入土壤中，致使土壤中的农药残留严重。土壤中过量的化学农药污染，不仅破坏了土壤中生物多样性，造成土壤质量下降，生产能力减弱，而且农作物从土壤中吸收农药，积累到根、茎、叶、果实及种子中，通过食物链进入人体，引起人体急性或慢性中毒，以及产生致畸、致突变和致癌等健康损害，已严重威胁到人类健康和农业可持续发展，所以土壤农药污染的修复问题迫在眉睫。

农药污染土壤修复主要有化学修复、物理修复、电化学修复、生物修复技术等。当前研究应用最为活跃，并取得较好效果的是生物修复技术。生物修复技术中微生物修复技术是一项环境友好、要求相对较低的修复污染土壤的方法。微生物种类繁多、代谢方式丰富多样、底物范围广，使其在化学农药污染土壤的生物修复过程中发挥着越来越重要的作用，并且成本也比传统修复技术要低得多。但是此种修复方式多会由于过快降低农药的含量而影响农药的最终使用效果。

因此，筛选到既能修复农药污染土壤又能对植物防病促生的微生物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，针对土壤有机化学农药污染，提供一种能够降解化学农药的赤红球菌XS-2，及包含该赤红球菌的对植物有防病促生及土壤修复作用的生物菌剂，并提供该生物菌剂的制备方法和应用。该生物菌剂施用后可有效降低土壤中化学农药的含量，提高植物的防病促生能力，降低环境污染，提高土壤品质。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明通过大量筛选工作，得到了一株可有效降解苯并咪唑类化学农药的赤红球菌XS-2，通过菌体形态、生理生化特征以及16SrDNA分子生物学鉴定，确定该菌株为赤红球菌XS-2。该菌株已于2015年10月30日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCCNo.11562；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明所述的赤红球菌XS-2在PB平板培养基上培养24h后菌落特征为：菌落为圆形、不透明、干燥、表面凸起、边缘整齐、颜色为橙红色；细胞形态特征为：生长前期细胞为杆状，菌体长度差异较大，表现为多态性，培养时间增长后变为椭球形。细菌XS-2为好氧菌，革兰氏染色为阳性，不产生芽孢，生理生化特性具有V.P反应阳性，甲基红反应阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，不能液化明胶，能利用环糊精、柠檬酸盐、核糖、a-D-葡萄糖、D-果糖、丙酮酸、甘露糖；不能利用阿拉伯糖和棉子糖。

本发明所述的赤红球菌XS-2可降解苯并咪唑类化学农药。

本发明还提供了包含所述赤红球菌XS-2的生物菌剂，包括赤红球菌XS-2、保藏编号为CGMCCNo.9621的沙雷氏菌A5、保藏编号为CGMCCNo.9622的短短芽孢杆菌BBC-3和保藏编号为CGMCCNo.8440的枯草芽胞杆菌BSD-2，其中所述赤红球菌XS-2的菌数占所述复合菌总数的25～40%，沙雷氏菌A5的菌数占所述复合菌总数的10～25%，所述枯草芽胞杆菌BSD-2的菌数占所述复合菌总数的20～45%，所述短短芽孢杆菌BBC-3的菌数占所述复合菌总数的15～35%。所述修复菌剂中的细菌总数不低于2×10⁹cfu/mL。

本发明所述的生物菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一：将保存的各菌株划线转接到PB培养基平板中，置于30℃恒温培养2d。将菌苔接种于PB种子培养基中，30℃摇床振荡培养24-36h，制得种子液。

步骤二：将步骤一的种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于30℃下培养36-48h，得到发酵液。

步骤三：将步骤二的发酵液经镜检计数后，按比例混合，菌液浓度≥2.0×10⁹cfu/mL，无菌分装，得到液体复合土壤修复菌剂。

其中步骤三可用以下步骤替换：将步骤二所得到的各液体发酵液与多种基质按一定比例混合均匀，进一步通过喷雾干燥制得固体粉剂，然后按比例混合，菌体浓度≥1.0×10¹⁰cfu/g，得到固体复合土壤修复菌剂。

本发明的生物菌剂的制备方法步骤二中所述的大量发酵培养基包含牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，pH7.0～7.2；

本发明所述的生物菌剂的制备方法中所述的基质为微粉碳酸钙和β-环糊精；其中质量比发酵液：微粉碳酸钙：β-环糊精=10:(0.1-1.0):(0.5-1.5)。

本发明所述的微生物制剂应用于土壤污染修复，一方面有机化学农药降解率≥90%，另一方面对作物有防病促生作用，可有效抑制灰霉病、白粉病、叶霉病、枯萎病、霜霉病等病原真菌的生长，其防治效率达70%以上，并对植物生长有一定的促进作用。

本发明的有益效果是：1）本发明公布的赤红球菌可有效降解苯并咪唑类农药，尤其是多菌灵。2）该赤红球菌可与沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌和短短芽孢杆菌复合制成土壤修复菌剂，一方面对土壤化学农药污染有修复作用，另一方面对植物有防病促生作用；3）本发明制备的微生物菌剂安全、环保，其制备和使用过程无污染、无公害、对环境友好。该菌剂的应用，可有效减轻土壤化学农药污染状况、改善土壤结构和作物品质，对促进农业健康可持续发展有重要意义。

生物样品保藏信息

赤红球菌XS-2，分类命名为Rhodococcusruber，该菌株已于2015年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCCNo.11562，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

枯草芽孢杆菌BSD-2，分类命名为Busilussubtilis，已于2013年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNO.8440。

短短芽孢杆菌BBC-3，分类命名为Brevibacillusbrevis，已于2014年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNO.9622。

沙雷氏菌A5，分类命名为Serratiasp.，已于2014年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNO.9621。

附图说明

图1为本发明赤红球菌XS-2的系统发育树。

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1菌株XS-2的筛选、分离及对多菌灵的降解特性

（1）取土样:在经常喷施多菌灵等农药的蔬菜种植区采集土壤样品，铲去表土层2-3cm，取土壤10g；装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。

（2）菌株富集：取土壤放到装有低浓度多菌灵富集培养基的三角瓶中，30℃摇床震荡培养5d。按10%接种量传代至高浓度富集培养基中继续震荡培养，依次传代富集培养（多菌灵浓度从300-800mg/L）。

（3）分离筛选：取0.1-0.2mL富集液均匀涂布在含多菌灵分离纯化培养基平板上，30℃恒温培养5-7d，筛选出生长快且单菌落相对较大的菌株XS-2,挑取单菌落转接至LB培养基试管斜面，30℃培养3d，4℃保存备用。

（4）菌株XS-2对多菌灵的降解特性

将保存于斜面的菌株XS-2接种至LB培养液，30℃150r/min摇床震荡培养24-36h，然后按培养基体积5-10%的接种量接种到含多菌灵500mg/L的装有LB培养液的三角瓶中，在30℃、150r/min摇床震荡培养。分别在3、5、7、10d取培养基液测多菌灵残留，每个样品做3个重复，以不接菌处理作为对照。多菌灵的测定方法为高效液相色谱法，参见中华人民共和国农业行业标准NY/T1680-2009。

结果见表1，菌株XS-1培养3d时多菌灵的降解率为75.6%，7d以后多菌灵的降解率超过90%，对照10d后降解率仅为3.9%。

表1菌株XS-2对多菌灵的降解作用

。

采用培养基：

富集培养基（g/L）：KH₂PO₄2.0，K₂HPO₄3.0，(NH₄)₂SO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.2，FeSO₄0.05，MnSO₄0.05，CaCO₃1.0，多菌灵300-800mg/L去离子水定容，pH值7.0～7.2。

分离纯化培养基（g/L）：KH₂PO₄0.5，K₂HPO₄1.5，NH₄Cl1.0，MgSO₄·7H₂O0.2，NaCl1.0，多菌灵500mg/L，琼脂15.0g，pH7.0～7.2。

LB培养基（g/L）：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，氯化钠10.0，琼脂15.0，去离子水定容，pH7.0～7.2。

无机盐培养基（g/L）：KH₂PO₄0.5，K₂HPO₄1.5，(NH₄)₂SO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.2，NaCl1.0，pH7.0～7.2。

实施例2菌株XS-2菌种鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容及试验方法，对筛选得到菌株XS-2进行形态学及生理生化鉴定。该菌株在PB平板培养基上培养24h后菌落特征为：菌落为圆形、不透明、干燥、表面凸起、边缘整齐、颜色为橙红色；细胞形态特征为：生长前期细胞为杆状，菌体长度差异较大，表现为多态性，培养时间增长后变为椭球形。细菌XS-2I为好氧菌，革兰氏染色为阳性，不产生芽孢，生理生化特性具有V.P反应阳性，甲基红反应阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，不能液化明胶，能利用环糊精、柠檬酸盐、核糖、a-D-葡萄糖、D-果糖、丙酮酸、甘露糖；不能利用阿拉伯糖和棉子糖（具体见表2）。

表2赤红球菌XS-2生理生化鉴定指标

注：＋表示阳性反应(存在或有反应)；－表示阴性反应(不存在或无反应)。

菌株16SrDNA序列分析：选取处于对数生长期的菌液，用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，进行PCR扩增。

扩增引物为细菌通用引物：

正向引物为5′-AGAGTTTGACCTGGCTCAG-3′，

反向引物为Pr：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。

PCR反应程序：在95℃进行预变性4min；95℃1min，52℃1min，72℃3min，30个循环延伸；72℃10min。

由上海生工公司进行PCR产物测序，其16SrDNA序列见序列见附1。测序完成之后用DNAMAN软件构建系统发育树（具体见图1）。根据菌株形态学、生理生化和16SrDNA序列分析，该菌株被鉴定为赤红球菌（Rhodococcusruber）。送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.11562。

实施例3~5土壤修复菌剂液体制剂的制备

将保存的赤红球菌XS-2、沙雷氏菌A5、短短芽孢杆菌BBC-3和枯草芽胞杆菌BSD-2各菌株划线转接到PB培养基平板中，置于30℃恒温培养2d。将菌苔接种于PB种子培养基中，30℃摇床振荡培养24-36h，制得种子液。

将种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于30℃下培养36-48h，得到发酵液。经镜检计数后，按表3所示各菌数比例混合，菌液浓度≥2.0×10⁹cfu/mL，无菌分装，得到液体复合土壤修复菌剂。

表3实施例3~5的生物菌剂组成

。

实施例6土壤修复菌剂固体制剂的制备

将种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于30℃下培养36-48h，得到发酵液。将各发酵液与基质按表4所示比例混合均匀，进一步通过喷雾干燥制得固体粉剂，然后按实施例3所示各菌种的比例混合，菌体浓度≥1.0×10¹⁰cfu/g，得到固体复合土壤修复菌剂。

表4固体菌剂中各发酵液与基质的质量比

。

实施例3-6中所述的大量发酵培养基包含牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，pH7.0～7.2。

实施例7复合菌剂土壤农药降解实验

选用河北省石家庄周边设施蔬菜大棚内土壤，晒干，研碎，均匀喷洒多菌灵溶液，混匀，使土壤多菌灵的浓度为100mg/kg土，装入直径15cm、高14cm的塑料花盆，装量2000g/盆，调节土壤水分约为70%田间持水量，放置在25℃培养箱中，设4个处理，对照组施加清水，处理组采用实施例3制备的生物菌剂，处理1:土壤中微生物终浓度为1×10⁴cfu/g；处理2:土壤中微生物终浓度为1×10⁵cfu/g；处理3:土壤中微生物终浓度为1×10⁶cfu/g；每个处理3次重复。分别在3、5、7、10、15d后测定土壤中多菌灵含量，计算其降解率。

表5土壤修复剂应用实验

。

由表5可知，对照组多菌灵降解很慢，添加复合菌剂后其降解效率显著提高，10d后，多菌灵的降解率都大于80%，15天后降解率大于90%。添加菌剂的量越多，相对而言降解速率越快，如处理3在10d时，多菌灵的降解率为95.1%，而处理1和处理2的降解率均低于90%。

实施例8土壤修复菌剂田间应用

分别将复合菌剂在石家庄周边经常使用多菌灵的设施番茄和黄瓜上应用，分别设空白对照组、实验组、处理对照一组和处理对照二组，空白对照组按常规方法管理，实验组在移栽时土壤穴施实施例6的固体复合菌剂（将固体土壤修复剂与部分草炭混合均匀，平均每亩地使用1kg菌剂，菌剂中微生物含量≥1.0×10¹⁰cfu/g），苗期以后叶面喷施实施例5的液体菌剂3次（液体菌剂微生物含量≥2.0×10⁹cfu/mL,平均每次每亩地使用500mL菌剂），每隔15d喷施一次。处理对照一组使用只含赤红球菌XS-2的菌剂，其中微生物含量、使用量等均与实验组相同，处理对照二组使用只含沙雷氏菌A5、短短芽孢杆菌BBC-3和枯草芽胞杆菌BSD-2的菌剂，其中微生物总量、各菌种比例以及使用量等均与实验组相同；各组日常管理按常规操作即可。植物生长期结束后测定土壤中多菌灵和蔬菜产量等。结果见表6。

表6土壤修复剂田间应用

。

由表6可知，空白对照土壤中检测出多菌灵含量在1-5mg/kg，只含赤红球菌的菌剂对土壤中多菌灵有明显的降解作用（降解率为96-98%），但防病增产效果不明显，而只含沙雷氏菌、短短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌剂对多菌灵的降解相对较低（降解率为30-45%），但防病增产效果相对较好。而复合了四种菌的实验组土壤中均未检测到多菌灵含量（检出限0.07mg/kg），即对多菌灵的降解几乎达到了100%，而且黄瓜比对照组增产8.5%，番茄比对照组增产7.2%。在防病效果上，该菌剂对番茄、黄瓜灰霉病、枯萎病等防效均大于80%。可见该菌剂中四种微生物之间具有相互促进作用，不仅可以有效降低土壤多菌灵含量，还有防病促生、降低化学农药施用量等作用。

以上仅为本发明的较佳实施方式，而不是对其保护范围的限制，本领域技术人员在本发明的精神和原则指导下所作的任何不具有创造性的改进，均应认为在本发明的保护范围内。

SEQUENCELISTING

<110>河北省科学院生物研究所

<120>一种赤红球菌XS-2、其生物菌剂及制备方法和应用

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1440

<212>DNA

<213>赤红球菌XS-2

<400>1

GGTGTGCATGCGATCCACTTCGACGGCTCCCTCCCACGAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCG60

GGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCAC120

CGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGAC180

CCCGATCCGAACTGAGACCGGCTTTAAGGGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCCCT240

CTGTACCGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACG300

TCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGCGAGTCCCCACCATTACGT360

GCTGGCAACACAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACA420

CGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGAAACCCCATCTCTGG480

GGCGGTCCGGTGTATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCAC540

ATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTA600

CTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTAGCTACGGCACGGATCCCGTGGAAGGAAACCCA660

CACCTAGCGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCC720

ACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACTGCCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCC780

TCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTGCAGTACTCA840

AGTCTGCCCGTATCGCCTGCAAGCCCGCAGTTGAGCTGCGGGTTTTCACAGACGACGCGA900

CAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAGTAATTCCGGGACAACGCTCGCACCCTACGTA960

TTACCTGCGGCTGCTGGCACGTAGTTGGGCCGGTGCTTCTTCTTGTACCTACCGTCACTT1020

GCGCTTCGTCAGGTACTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCG1080

TCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT1140

CTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTC1200

GCCTTGGTGGGCCGTTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCCCATCCTGCACCGG1260

AAAACCTTTCCACCCCGGAACATGCATCCCGAGGTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTC1320

CCAGGCTTATCCCGAAGTGCAGGGCAGATCACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTA1380

ATCCACCCAGCAAGCTGGGCTTCATCGTTCGACTGCATGGTAAGCACGCCGCAATTCCAC1440

Claims

1.一种赤红球菌XS-2，该菌于2015年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.11562。

2.权利要求1所述的赤红球菌XS-2在土壤修复过程中降解化学农药中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述化学农药为苯并咪唑类农药。

4.包含权利要求1所述的赤红球菌的生物菌剂，其特征在于：该生物菌剂中的总菌数不低于2×10⁹cfu/mL液体制剂或1×10¹⁰cfu/g固体制剂。

5.根据权利要求4所述的生物菌剂，其特征在于：还包括保藏编号为CGMCCNo.9621的沙雷氏菌A5、保藏编号为CGMCCNo.9622的短短芽孢杆菌BBC-3和保藏编号为CGMCCNo.8440的枯草芽胞杆菌BSD-2。

6.根据权利要求5所述的生物菌剂，其特征在于：所述赤红球菌XS-2的菌数占总菌数的25～40%，沙雷氏菌A5的菌数占总菌数的10～25%，所述枯草芽胞杆菌BSD-2的菌数占总菌数的20～45%，所述短短芽孢杆菌BBC-3的菌数占总菌数的15～35%。

7.权利要求4-6任一项所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：将保存的各菌株划线转接到PB培养基平板中，置于30℃恒温培养2d；

将菌苔接种于PB种子培养基中，30℃摇床振荡培养24-36h，制得种子液；

步骤二：将步骤一的各种子液分别按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于30℃下培养36-48h，得到发酵液；

步骤三：将步骤二的各发酵液经镜检计数后，按比例混合，菌液浓度≥2.0×10⁹cfu/mL，无菌分装，得到液体复合土壤修复菌剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于用以下步骤替换步骤三：将步骤二所得到的各液体发酵液分别与基质混合均匀，通过喷雾干燥制得固体粉剂，然后按比例混合，菌体浓度≥1.0×10¹⁰cfu/g，得到固体复合土壤修复菌剂。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述基质为微粉碳酸钙和β-环糊精，其与各发酵液的质量比为发酵液：微粉碳酸钙：β-环糊精=10:(0.1-1.0):(0.5-1.5)。

10.权利要求4-6任一项所述的生物菌剂的应用，其特征在于：用于修复化学农药污染的土壤，并对植物产生防病促生作用。