CN102046778A - 降低植物体中的重金属含量的细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有降低植物体中的重金属含量的功能的细菌，使用该细菌降低植物体中的重金属含量的方法，和含有该细菌作为有效成分的组合物。

Description

降低植物体中的重金属含量的细菌
技术领域
本发明涉及降低植物体中的重金属含量的细菌，使用该细菌降低植物体中的重金属含量的方法，和含有该细菌作为有效成分的组合物。
背景技术
矿物、土壤等中天然存在的镉、铅等重金属因矿山开发等人类活动被排放到环境中。
例如，镉包含于矿山坑水、冶炼厂废水/废烟、或来自废石等的堆积场的废水等中，这些铬是目前土壤污染的主要原因。此外，镉来源于进口和在日本国内产生，其作为镍/镉电池、颜料、合金使用，以前还作为聚氯乙烯稳定剂等使用。过去，曾经有过以工厂或焚烧场的废水和废烟的形式排放到河流或大气中的事例。而且，已知在农耕地中镉侵害土壤起因于被镉污染的河流水的流入，或者镉从雨水等入侵到环境中。
在摄取食品时，食品中的一部分镉会被吸收并蓄积到体内，因此厚生劳动省通过如果长期摄取高镉浓度食品，则存在引起肾功能障碍的可能性。此外，在日本，还因镉的环境污染而发生过痛痛病(itai-itai disease)事件。
关于食品中镉含量的国际标准，食品准则委员会(Codex AlimentariusCommission)从1998年起就进行了研究。该委员会于2007年7月提出了每千克精米0.4mg镉、每千克小麦0.2mg镉等的国际标准值。
降低作物中的镉含量的方法包括：例如施投客土(soil dressing)或土壤改良材料，利用低吸收镉的品种，或利用植物治理法(phytoremediation)或土壤洗涤进行土壤净化等。
现行的土壤改良中主要采用客土法，但该方法需要大量费用，且情况是采集客土所必需数量的山土是困难的。而且，采用客土法必须进行大量的废土处理。此外，还有必要将土壤改良，使得其适合作物栽培。在客土厚度不充分的情况下，还有可能再次发生污染，因而需要开发一种在物理上、成本上行之有效的技术。此外，采用其它方法也需要大量的费用和时间。
作为低成本的方法，利用微生物从环境中除去镉值得期待。金属阳离子与硫化物离子、氢氧化物离子等阴离子结合而形成难溶于水的化合物。重金属离子的硫化物、氢氧化物、磷酸盐等不溶或难溶于水。利用这些特性，尝试了利用微生物从环境水中除去镉。作为沉淀硫化物的微生物，已知有脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria)。已知这些微生物分布于有机物多的湖沼、湿地、水田中，进行了在水稻中降低重金属的研究。然而，这些微生物虽然对于在水田中栽培的稻是有效的，但是，在酸性条件下的田地中，硫化物转变为硫酸，成为可被作物吸收的形态，从而在酸性条件下无法再利用这些微生物。
有报导称，对于豌豆(garden pea)，通过使用菌根真菌(mycorrhizal fungi)进行处理，降低了根中的镉浓度。已知菌根真菌感染特定植物的根，具有促进植物的养分吸收、特别是磷酸吸收的功效。但是，在高浓度镉土壤中未见镉降低效果(非专利文献1)。
此外，还有报导称，对于烟草，也尝试了使用菌根真菌(球囊霉属(Glomus))降镉(非专利文献2)。在从枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza)(AM)3菌株中观察到了降低叶中镉浓度的效果。但是，未观察到镉降低效果与菌根真菌的建群性(colonization)之间存在关联性。此外，AM是一种霉菌，存在的问题是其人工培养存在困难，大量培养需要劳力和时间。而且，菌根真菌仅在特定宿主的根部建群，难以用于其它的宿主。已知因土壤的不同，菌根真菌的作用存在很大差异，并且在磷酸丰富的土壤或通气性差的土壤中其作用会受到抑制。因此，存在镉降低效果因土壤而显著变化的可能性。此外，非专利文献2的实验仅在温室中进行，且其所使用的是刚刚灭菌完毕的土壤。可以想像，在使用灭菌土壤的情况下，通过接种添加的微生物成为土壤中的优势菌种。但在通常栽培植物的情况下，土壤中存在各种各样的微生物，接种微生物的量会因营养成分的竞争等减少。因而，在实际栽培植物的苗圃(field)等环境下进行的实验是重要的。
细菌传统上被用作各种土壤带来的病害的防治剂或植物病害的防治剂。
例如，人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)TRB 19菌株用作茄科植物土壤病害防治剂的有效成分，通过将其适用于茄科植物包括烟草和番茄的根部、栽培地和/或其土壤，可以发挥防治细菌萎蔫病(bacterial wilt disease)的效果(专利文献1)。
粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(保藏号FERM P-15229)用作黄瓜植物病害的防治剂，其使用方法包括：将该微生物的培养物或者分离的菌体用水悬浮后喷涂于植物的方法，或者以诸如白粉病(powdery mildew)这样的在茎叶部发生的病害为对象喷涂于茎叶的方法(专利文献2)。
贪噬菌属(Variovorax)细菌CGF4526株(保藏号FERM P-19563)用作十字花科(Brassicaceae)植物根肿病(clubroot)的防治剂，其使用方法包括育苗时在培土中混合或灌注该包含所述菌株的防治剂，或者在固定种植到苗圃之前对苗进行浸渍(专利文献3)。此外，贪噬菌属细菌CGF4526菌株与非病原性胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)细菌的组合也用作十字花科植物根肿病的防治剂，其使用方法为在育苗时(即移植到主田地(main field)前)施用该防治剂(专利文献4)。
专利文献1：日本特开平9-194314号公报
专利文献2：日本特开平9-104606号公报
专利文献3：日本特开2005-137330号公报
专利文献4：日本特开2007-197421号公报
非专利文献1：Journal of Experimental Botany，(2002)，53，p.1177-1185
非专利文献2：Applied Soil Ecology，(2007)，35，p.502-510
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题是提供具有降低植物体中的重金属含量的功能的细菌，使用该细菌进行的降低植物体中重金属含量的方法，和含有该细菌作为有效成分的组合物。
解决问题的方法
本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果成功地分离出了具有降低植物体中的镉等重金属含量的功能的细菌，从而完成了本发明。
本发明的要旨如下。
〔1〕具有降低植物体中的重金属含量的功能的属于苍白杆菌属(Ochrobactrum)、产碱菌属(Alcaligenes)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属(Variovorax)、贪铜菌属(Cupriavidus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)或寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的细菌。
〔2〕〔1〕所述的细菌，其中，重金属选自镉、铜、铅、铬、镍和砷。
〔3〕〔1〕或〔2〕所述的细菌，其为人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)、皮氏雷尔氏菌(Ralstoniapickettii)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)或嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。
〔4〕〔1〕～〔3〕中任一项所述的细菌，其为人苍白杆菌JHA60菌株(保藏号NITE BP-549)、木糖氧化产碱菌JHB14菌株(保藏号NITE BP-550)、粪产碱菌JHC10菌株(保藏号NITE BP-551)、解甘露醇雷尔氏菌JHG2菌株(保藏号NITE BP-552)、解甘露醇雷尔氏菌JHL8菌株(保藏号NITE BP-554)、皮氏雷尔氏菌JHP30菌株(保藏号NITE BP-555)、皮氏雷尔氏菌JHP55菌株(保藏号NITE BP-557)、争论贪噬菌JHP31菌株(保藏号NITE BP-556)或钩虫贪铜菌JHJ6菌株(保藏号NITE BP-553)。
〔5〕〔1〕～〔4〕中任一项所述的细菌，其固定化在载体上。
〔6〕一种降低植物体中的重金属含量的方法，该方法包括将〔1〕～〔5〕中任一项所述的至少1种细菌施用到植物体的根部或根部周围的土壤。
〔7〕〔6〕所述的方法，其中，在从播种起至移植到苗圃后(post-transimplanting)的时期里进行至少1次施用。
〔8〕〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，通过将细菌直接施加到根部来进行施用，或者通过将细菌添加或混合到根部周围的土壤或水培液(hydroponic solution)中来进行施用。
〔9〕〔6〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，植物选自茄科(Solanaceae)、禾本科(Gramineae)、蓼科(Polygonaceae)、豆科(Leguminosae)、十字花科(Brassicaceae)、百合科(Liliaceae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)。
〔10〕一种用于降低植物体中的重金属含量的组合物，其包含〔1〕～〔5〕中任一项所述的细菌作为有效成分。
在本说明书中，“植物体的根部”是指：在栽培植物体时处于土壤中或水培液中来吸收水分或养分的部分。
在本说明书中，“保藏号”是指：独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE：National Institute of Technology and Evaluation)专利微生物保藏中心(NPMD：NITE Patent Microorganisms Depositary，邮政编码292-0818，日本国千叶县，木更津市Kazusa镰足2-5-8)接受本发明细菌的保藏时所赋予的编号(保藏日2008年4月10日)。
发明效果
本发明的具有降低植物体中重金属含量功能的细菌能够降低植物体中的镉等重金属的含量，对重金属能够具有抗性。此外，本发明可以用于烟草等茄科植物，还可以用于包含禾本科、蓼科、豆科、十字花科、藜科、百合科、菊科在内的各种植物。而且，通过增加在植物体的根部、或根部周围的土壤或水培液中施用本发明的细菌或组合物的次数，能够提高降低植物体中的重金属含量的效果。
与菌根真菌相比，本发明的具有降低植物体中重金属含量功能的细菌能够容易地通过液体培养或其它方式进行大量培养。此外，在建群性方面，菌根真菌会因土壤的成分、状态或其它条件而受到较大影响，但就细菌而言，与土壤的成分、状态或其它条件相比，可以认为其所受影响更来自植物的根对养分的供给，本发明细菌具有宽的宿主范围。因此，可以认为，本发明的细菌在建群到植物上这方面具有高的多样性(versatility)，能够适用于各种植物。不仅是在温室中，本发明降低植物体中的重金属含量的效果在苗圃中也得到了确认。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2008-141201号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的具体实施方式
(1)本发明的细菌
本发明的细菌具有降低植物体中的重金属含量的功能，且其属于苍白杆菌属(Ochrobactrum)、产碱菌属(Alcaligenes)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属(Variovorax)、贪铜菌属(Cupriavidus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)或鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。作为本发明的细菌，具体可以列举出例如：人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)和嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)等。特别优选为人苍白杆菌JHA60菌株(保藏号NITE BP-549)、木糖氧化产碱菌JHB14菌株(保藏号NITE BP-550)、粪产碱菌JHC10菌株(保藏号NITE BP-551)、解甘露醇雷尔氏菌JHG2菌株(保藏号NITE BP-552)、解甘露醇雷尔氏菌JHL8菌株(保藏号NITE BP-554)、皮氏雷尔氏菌JHP30菌株(保藏号NITE BP-555)、皮氏雷尔氏菌JHP55菌株(保藏号NITE BP-557)、争论贪噬菌JHP31菌株(保藏号NITE BP-556)、钩虫贪铜菌JHJ6菌株(保藏号NITE BP-553)。
本发明的细菌可以是固定化在载体上的固定化细菌。载体包括可用于细菌的固定化的公知载体，例如活性炭、硅藻土、沸石、泥煤苔(peat moss)、珍珠岩、膨润土、蒙脱石、蛭石、氧化铝、硅酸盐、结晶纤维素、玉米淀粉、明胶、藻酸等。通过将细菌吸附在载体上，能够获得固定化细菌。
本说明书中使用的“重金属”是指：比重4～5以上的金属元素。
对于可利用本发明的细菌降低的重金属，没有特殊限制，可以列举出例如镉、铜、铅、铬、镍、砷、汞、锰、钴、硒、铋和铁。重金属的优选例子是镉、铜、铅、铬、镍和砷。
本发明的细菌可以从苗圃等一般土壤中分离。例如，将除去土壤后的植物的根加入到缓冲液(例如中性附近的TRIS缓冲液等)中并进行振荡，得到根圈土壤(rhizospheric soil)的细菌分离用悬浮液。将该悬浮液涂布于添加了镉等重金属的微生物用培养基(例如Tryptic Soy琼脂培养基等)并培养细菌，对生长繁育出的菌落进行分离。用添加重金属的培养基和没有添加重金属的培养基对菌落进行培养，比较生长繁育情况，选择出在重金属添加培养基上生长繁育情况例如相同～稍差程度的重金属抗性细菌。使对根部施用了选择出的细菌的植物与未施用该细菌的植物在添加重金属的土壤上进行生长。回收植物，利用例如ICP-MS(高频等离子体质量分析装置)(岛津制作所制，ICPM-8500)等测定植物体中的重金属浓度。与未施用细菌的植物中的重金属浓度进行比较，当施用了细菌的植物中的重金属浓度显著降低时，该细菌即为具有降低植物体的重金属含量的功能的细菌。此外，该细菌对重金属有抗性。“对重金属有抗性”是指：细菌可以在重金属的存在下增殖。
这样获得的细菌可以采用常规方法增殖。培养优选在好氧条件下进行，在包含无机盐(磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、其它痕量金属盐等)、氮源(氨气、硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸等)、其它营养源(碱基类等)的无机营养培养基或有机营养培养基等中接种本发明的细菌，采用振荡培养法、通气搅拌培养法等进行。培养的温度条件只要在所培养的细菌的生长繁育温度的范围即可，优选可以设定在20～40℃、更优选25～30℃的范围。培养基的pH只要在所培养的细菌的生长繁育pH区域即可，优选可以设定在pH6.0～8.0、更优选pH6.5～7.5的范围。对于培养时间没有特殊限制，优选为24小时～3天。
(2)细菌的鉴定和菌学性质
通过下述方式对本发明的细菌进行了鉴定：基于形态学性状、基本性状的菌学性质，利用用于鉴定革兰氏阴性杆菌的试剂盒(BioMe’rieux制，商品名：API20NE)进行的生理/生化学的性状，16S rRNA的碱基序列同源性检索等。本发明的细菌的菌学性质如表1～表7所示。
(i)JHA60菌株(保藏号NITE BP-549)
[表1]JHA60菌株基于形态、基本性状的菌学性质
1)NP：未产生特征性的菌落色彩
[表2]通过API20NE测定的JHA60菌株的菌学性质
由上述各性质，鉴定JHA60菌株属于人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)。
(ii)JHB14菌株(保藏号NITE BP-550)
[表3]JHB14菌株基于形态、基本性状的菌学性质
Figure BPA00001259923700091
1)NP：未产生特征性的菌落色彩
[表4]通过API20NE测定的JHB14菌株的菌学性质
Figure BPA00001259923700101
由上述各性质，鉴定JHB14菌株属于木糖氧化产碱菌(Alcaligenesxylosoxidans)。
(iii)JHC10菌株(保藏号NITE BP-551)
[表5]JHC10菌株基于形态、基本性状的菌学性质
Figure BPA00001259923700111
1)NP：未产生特征性的菌落色彩
[表6]通过API20NE测定的JHC10菌株的菌学性质
Figure BPA00001259923700121
由上述各性质，鉴定JHC10菌株属于粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。
(iv)JHG2菌株(保藏号NITE BP-552)、(v)JHL8菌株(保藏号NITEBP-554)、(vi)JHP30菌株(保藏号NITE BP-555)、(vii)JHP55菌株(保藏号NITE BP-557)、(viii)JHP31菌株(保藏号NITE BP-556)、(ix)JHJ6菌株(保藏号NITE BP-553)
上述(iv)～(ix)的菌学性质如表7所示。
[表7]各菌株基于形态、基本性状的菌学性质
NP：未产生特征性的菌落色彩
此外，基于上述(iv)～(ix)的碱基序列进行了鉴定。提取(iv)～(ix)的细菌的DNA，利用PCR法对16S rRNA区域的DNA序列进行解析，使用公知的碱基序列数据库进行同源性检索，制作了近亲种的系统树。表8显示(iv)～(ix)的同源性检索结果，表9显示(iv)～(ix)的鉴定结果和16S rRNA区域的DNA序列的SEQ ID NO：(1～6)。由上述结果，鉴定JHG2菌株和JHL8株属于解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)，JHP30菌株和JHP55菌株属于皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii)，JHP31菌株属于争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)，JHJ6菌株属于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。
[表8]各菌株的同源性检索结果
Figure BPA00001259923700141
<>内为GenBank登录号
[表9]各菌株的鉴定结果
Figure BPA00001259923700142
(3)降低植物体中的重金属含量的方法
为了使本发明的细菌在植物体的根部或根部周围的土壤达到与自然状态不同的菌密度而施用一定量以上的本发明的细菌，这样，作为结果，能够降低植物体中的重金属含量。细菌可以使用单一菌，也可以将多种细菌组合使用，或者可以以固定化细菌的形式使用。
对于作为本发明的对象的植物没有特殊限制，可以列举出例如：禾本科的稻、大麦、小麦、玉米、高梁、甘蔗等，蓼科的荞麦等，茄科的烟草、茄子、番茄、青椒、辣椒等，豆科的大豆、赤豆(Phaseolus angularis)、蚕豆、豌豆等，十字花科的卷心菜、白菜、菜花(cauliflower)、西兰花(broccoli)、白萝卜(Japanese radish)、芜菁(turnip)、青菜(Brassica chinensis komatsuna)、油菜(Brassica campestris)、日本芜菁(Brassica rapa var.nipposinica)、芥菜、小白菜(Brassica rapa var.chinensis)等，藜科的菠菜、甜菜(beet)等，菊科的生菜(lettuce)、奶油生菜(butterhead lettuce)等，百合科的葱、韭菜等。
本发明的细菌对植物体根部或植物根部的土壤的施用，可以是将细菌直接施用到根部，或者也可以是将细菌添加或混合到根部周围的土壤或水培液等中而进行。土壤包括可用于植物的栽培的所有的土，例如播种中使用的肥土、栽培中使用的土、含肥料的土或培养土等。
对于细菌的施用方法没有特殊限制，可以列举出例如：向植物体注入或灌注细菌悬浮液，将植物体根部浸渍于该悬浮液，将细菌混合以及喷涂于植物栽培所使用的土壤中，混合细菌到水培液(溶液培养的情况)中等。优选地，进行注入或灌注从而使得经处理的微生物充分浸透到植物体根部或根部周围的土壤。总之，只要是使细菌与植物的根部进行接触的施用方法即可。
对于细菌的施用时期没有特殊限制，可以是植物播种后～栽培期间结束，优选为植物吸收重金属并开始在体内蓄积这样的重金属之前(即在播种后～移植于苗圃后的期间)施用至少1次。施用次数不限于1次，视需要可以在植物播种后的栽培期间中数次或连续实施。通过多次实施，可以获得更高的重金属降低效果。
细菌的施用量在对单个植物体进行处理时，可以为1株106cfu(菌落形成单位)以上、优选107cfu以上、更优选109cfu以上。细菌的使用量可以因植物体的生长繁育阶段而多少有所差别。
细菌的施用方式只要是使得该细菌适合在土壤、水培液等中施用即可，可以不经变更使用该细菌的培养物，或者可以以包括上述这样的作为活性成分的细菌和载体或下述载体的组合物的形式使用细菌。对于液体载体，没有特殊限制，可以列举出例如水、缓冲液等。对于固体载体，没有特殊限制，可以列举出活性炭、硅藻土、沸石、泥煤苔、珍珠岩、膨润土、蒙脱石、蛭石、氧化铝、硅酸盐、结晶纤维素、玉米淀粉、明胶、藻酸等。载体可以使用1种，也可以多种载体组合使用。在这些载体上悬浮、添加、混合细菌，而且可以适宜添加固定剂(fixing agent)、分散剂、辅助剂(auxiliarymaterial)等，并且可以以制成粉剂、粒剂、可湿性粉剂(water dispersiblepowder)、溶液剂、乳剂、悬浮液等成品的形式使用。
此外，组合物中可以含有上述以外的成分。具体地，可以含有对细菌的增殖有用的成分，例如可以含有无机盐类、氮源、其它营养源、糖(葡萄糖、蔗糖等)、有机材料(牛肉提取物、酵母提取物等)等。而且，可以含有对植物的生长繁育有用的成分，即各种肥料等。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明不受这些实施例的限制。
〔实施例1〕微生物的分离
镉抗性微生物是从日本枥木县、岩手县、山形县、秋田县、冲绳县和青森县的烟草苗圃土壤和栽培烟草的根圈土壤中分离出来的。
用于分离细菌的土壤悬浮液采用以下方法制作。将已充分在空气中晃落土壤的烟草根在烧杯内的蒸馏水中轻轻摇晃，除去土壤。将轻轻除去多余水分后的根放入装有200ml的0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)的500ml容量带挡板三角烧瓶中，振荡15分钟。而且，轻轻除去根的多余水分，将其放入另行准备的装有200ml的0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)的500ml容量带挡板三角烧瓶中，振荡30分钟，将所得液体作为从根圈土壤分离细菌用的悬浮液。
将制作的分离用悬浮液涂布于添加有0.5或2.0mM浓度的镉的10倍稀释Tryptic Soy琼脂培养基(Difco公司制造，Bacto Tryptic Soy Broth；即，在Soybean-Casein Digest Medium中添加终浓度1.5％的琼脂而得到的培养基；以下记作1/10TS琼脂培养基)上。涂布后，将琼脂培养基于30℃培养4～7天，分离出生长繁育的菌落。
分离微生物的镉抗性采用以下方法确认。将分离微生物用1/10TS琼脂培养基于28℃培养3天，用经灭菌的塑料环刮取培养菌体，将其以约1010cfu/ml的浓度悬浮于灭菌蒸馏水。用1μL悬浮液在添加镉的1/10TS琼脂培养基(镉浓度：0.5，2.0mM)上划线，28℃培养10天。镉抗性的确认通过肉眼比较添加镉的培养基与未添加镉的培养基的生长繁育状况来进行，与未添加镉的培养基相比较，细菌以相同～稍差的程度生长繁育的是抗性菌。对于已确认对镉有抗性的微生物，将其悬浮于10％甘油液中，并于-80℃保存直至使用。
分离出的镉抗性微生物的菌株数的结果如表10所示。从烟草苗圃土壤和烟草根圈土壤中分离出723个镉抗性菌的菌株。分离出的723个菌株对于镉浓度0.5或2.0mM具有抗性。
[表10]微生物的分离源以及分离菌株数
  土壤采集地   分离源   分离菌株数
  枥木县   根圈土壤   115
  岩手县   根圈土壤   101
  山形县   根圈土壤   118
  山形县   土壤   98
  秋田县   根圈土壤   55
  秋田县   土壤   77
  冲绳县   根圈土壤   44
  青森县   土壤   115
〔实施例2〕在温室中选择降低叶中的镉的微生物I
接种源采用以下方法制作。通过将保存微生物1/10TS琼脂培养基于28℃培养3天来进行前培养。用经灭菌的塑料环刮取培养菌体，将其接种于装有50ml的Tryptic Soy液体培养基(Difco公司制造，Bacto Tryptic SoyBroth；即Soybean-Casein Digest Medium；以下记作TS液体培养基)的100ml容量三角烧瓶后，接种细菌后的液体培养基在28℃振荡培养48小时。将该细菌培养液作为接种源。
选择用土壤采用以下方法制作。将已灭菌的温室原野土(赤土(Akabokusoil))、赤玉土(Akadama bonsai soil)(小粒)及黄色种(yellow species)用JT有机化肥以重量比9∶1∶0.1的比例混合。而且，在土壤中添加土壤添加用镉溶解液，使得总镉浓度为约2ppm，以添加后的土壤作为选择用土壤。土壤添加用镉溶解液是将氯化镉(CdCl2·2.5H2O，和光纯药工业制造)溶解于0.01％的硝酸中而制作的。
使用与烟草品种筑波1号状态相同的苗(处于8～9叶期(leaf stage))。苗的年龄与用于移植到主田地的那些苗的年龄相同。在移植到温室的前一天，对于每3株乙烯钵(vinyl pot)(36×36洞)中育苗的烟草苗的底部(bottom)，用50ml的细菌培养液(菌浓度：109～1010cfu/ml(每1株的菌量：1010～1011cfu))进行灌注处理。作为对照，使用了用无菌TS液体培养基处理的苗。将经接种的苗抑制到选择用土壤中并在25℃栽培3星期。
取样采用以下方法进行。栽培结束后，从2个烟草株上取样从底部数的第4～第6片叶子(总计6片)。将采集的叶子于60～70℃干燥后进行粉碎，作为分析用试样。本实验中对于每个微生物的处理制作1个试样，对于对照每个制作了4或5个试样。对照的4或5个试样中的镉浓度取平均值，作为对照的镉浓度。
叶中的镉浓度如下确定：使用微波(microwave)样品分析仪分解试样，并使用高频等离子体质量分析装置对试样中的浓度进行测定。试样的分解采用以下方法进行。在微波用特氟隆分解容器中称量粉碎试样0.1g，然后加入5ml的硝酸(和光纯药工业公司制造，超微量分析用，148-06935)和2ml的过氧化氢水(和光纯药工业公司制造，原子吸光用，085-04056)。将分解容器密闭，使用微波分析仪(Perkin Elmer Japan公司制造，Multiwave 3000)辅助试样的分解。使用ICP-MS(岛津制作所公司制造，ICPM-8500)测定分解试样中的镉浓度。测定了微生物处理和对照烟草叶中的镉浓度。
在温室中选择通过微生物处理的镉降低效果I的评价采用以下方法进行。比较对照的叶中镉浓度与微生物处理的叶中的镉浓度，选择出通过处理降低了20％以上的微生物。
温室选择I的结果如表11所示。从分离出的镉抗性微生物中，选择出114个菌株，与对照的叶中的镉浓度相比，这些菌株通过微生物的底部灌注处理降低了镉浓度20％以上。
[表11]显示降低叶中镉浓度的效果的微生物数
  土壤采集地   分离源   降低的菌株数
  枥木县   根圈土壤   30
  岩手县   根圈土壤   22
  山形县   根圈土壤   19
  山形县   土壤   7
  秋田县   根圈土壤   3
  秋田县   土壤   10
  冲绳县   根圈土壤   6
  青森县   土壤   17
〔实施例3〕在温室中选择降低叶中的镉的微生物II
接种源的制作像实施例2那样进行。
选择用土壤的制作像实施例2那样进行。
使用的实验用烟草的苗与实施例2中的相同。此外，对苗的微生物灌注处理像实施例2那样进行。
取样像实施例2那样进行，不同的是：对于微生物处理的和对照的各制作了4～5个试样。
叶中镉浓度的分析像实施例2那样进行。
微生物处理的镉降低效果的温室选择II的评价采用以下方法进行。对对照的叶中镉浓度与微生物处理的样品的镉浓度进行统计分析，选择出与对照的叶中镉浓度相比显著降低了镉浓度的微生物。
温室选择II的结果如表12所示。选择出通过微生物的底部灌注处理，与对照相比，显著降低了镉浓度的微生物。与对照的叶中镉浓度相比显著降低了镉浓度30％以上的微生物有6个菌株，显著降低了镉浓度20％～30％的微生物有3个菌株。
[表12]微生物的叶中镉降低效果
  菌株编号   细菌名   土壤采集地   分离源   降低率(％)1)
  JHA60   人苍白杆菌   枥木县   根圈土壤   37.1**3)
  JHB14   木糖氧化产碱菌   枥木县   根圈土壤   34.7**
  JHC10   粪产碱菌   岩手县   根圈土壤   29.2**
  JHG2   解甘露醇雷尔氏菌   青森县   土壤   27.8*2)
  JHJ6   钩虫贪铜菌   山形县   土壤   35.0**
  JHL8   解甘露醇雷尔氏菌   秋田县   土壤   28.7*
  JHP30   皮氏雷尔氏菌   山形县   根圈土壤   33.3**
  JHP31   争论贪噬菌   山形县   根圈土壤   38.5**
  JHP55   皮氏雷尔氏菌   山形县   根圈土壤   32.5**
1)：降低率＝(对照的叶中Cd浓度-微生物处理的叶中Cd浓度)/对照的叶中Cd浓度×100
2)：t检验中与对照在5％水平上有显著差异
3)：t检验中与对照在1％水平上有显著差异
〔实施例4〕苗圃中的降低叶中的镉的效果I
对于在温室中可见降低叶中镉的效果的细菌，考察了其在苗圃中的降低效果。本实验利用下述表13中所示的4个菌株进行。
接种源的制作按照实施例2的方法进行，不同的是接种于装有200ml的TS液体培养基的500ml容量三角烧瓶中。
本实验中使用烟草品种“TAIHEI”。在移植至苗圃的前一日，对于每36株乙烯钵(36×36洞)中育苗的烟草苗的底部，用500ml的细菌培养液(菌浓度：109～1010cfu/ml(相当于每1株的菌施用量：1010～1011cfu)进行灌注处理。作为对照，使用了用无菌TS液体培养基进行处理的苗。
取样采用以下方法进行。取样是在移植60天后采集中间叶位置的叶。对于3个烟草株中的每一个，分别采集切割位置的叶3片(总计9片)。将采集的叶(全叶)于60～70℃干燥后进行粉碎，作为分析用试样。本实验中，微生物处理的和对照均制作了4个试样。
叶中镉浓度的分析像实施例2那样进行。
苗圃试验的结果如表13所示。
叶中的镉含量以对照为最高，是6.28ppm。用微生物处理过的叶中的镉浓度就JHA60、JHB14、JHG2和JHJ6菌株而言分别是5.33ppm、5.20ppm、5.12ppm和5.19ppm，均比对照低。与对照相比，JHA60菌株降低了15.0％，JHB14菌株降低了17.2％，JHG2降低了18.4％，JHJ6降低了17.4％。
[表13]在苗圃中微生物对叶中镉的降低效果
Figure BPA00001259923700201
以上结果说明：通过微生物处理，不仅在温室中，在苗圃中也能够降低烟草叶中的镉浓度。这些结果也说明这些微生物具有降低烟草叶中的镉浓度的能力。
〔实施例5〕降低植物镉含量的微生物的鉴定
对实施例3中选择出的9株镉降低微生物进行了鉴定。鉴定委托财团法人日本食品分析中心(Japan Food Research Laboratories)进行，进行了以下的鉴定试验。
(i)基于形态和性状的菌学性质
采用形态观察以及基本性状试验考察了各种菌学性质。
(ii)基于鉴定试剂盒和补充试验的鉴定
使用用于鉴定革兰氏阴性杆菌的试剂盒(BioMe’rieux公司制造，商品名：API20NE)进行了鉴定。视需要，实施了补充试验。
(ii)基于16S rRNA的鉴定
提取细菌的DNA，通过PCR法使用ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer(Applied Biosystems)对16S rRNA区域的DNA进行了碱基序列解析。对于所得序列，在登录于国际碱基序列数据库(DDBJ/EMBL/GenBank)的序列和MicroSeq ID Analysis Software Version 2.0(Applied Biosystems)数据库中进行同源性检索，采用近邻结合法(NJ法)制作了近亲种的系统树。
细菌的菌学性质和鉴定结果如上述表1～表9。
〔实施例6〕苗圃中降低叶中的镉的效果II
对于在温室中可见降低烟草叶中的镉的效果的细菌，考察了其在苗圃中的降低效果。本实验中利用了下述表14所示的9个菌株。
接种源的制作像实施例2那样进行，不同的是：将细菌接种于装有200ml的TS液体培养基的500ml容量三角烧瓶中。
本实验中使用了烟草品种TAIHEI。灌注处理像实施例4那样进行。
取样采用以下方法进行。移植到苗圃75天后，对于3个烟草株中的每一个分别采集切割位置的叶3片(总计9片)。对于采集的叶，除去中脉(midribs)，采集叶肉部(mesophylls)(叶片(laminae))，于60～70℃干燥后进行粉碎，作为分析用试样。本实验中，微生物处理的和对照均制作4个试样。
叶中的镉浓度分析像实施例2那样进行。
苗圃试验的结果如表14所示。
对照的叶中镉含量为6.44μg/g。苗圃中使用的9个菌株中，有4个菌株显示了20％以上的降低效果，有4个菌株显示了10～20％的降低效果。
[表14]苗圃中细菌处理降低叶中镉的效果
Figure BPA00001259923700221
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：叶肉部分
〔实施例7〕用细菌处理土壤的次数与降低效果
考察了用细菌处理土壤的次数对降低效果的影响。本实验中，使用了烟草品种的白肋种TAIHEI。本实验在苗圃中进行。本实验中使用了下述表15所示的5个菌株。
本实验按1次处理和2次处理进行。1次处理像实施例6那样，使用了在移植到苗圃的前一天用细菌菌液(菌浓度：109～1010cfu/ml(相当于每1株的菌施用量：1010～1011cfu))进行了灌注处理的烟草苗。2次处理在1次处理的基础上，在移植到主田地后的第35天使用菌液(菌浓度：107～108cfu/ml(相当于每1株的菌施用量：1010～1011cfu))200ml进行了底部灌注处理。
在苗圃移植70天后，对于3个烟草株中的每1个，分别采集切割位置的叶3片(总计9片)。对于采集的叶除去中脉，采集叶肉部(叶片)，于60～70℃干燥后进行粉碎，作为分析用试样。本实验中，1次处理的制作了4个试样，2次处理的制作了3个试样。
叶中镉浓度的分析像实施例2那样进行。
苗圃试验的结果如表15所示。
苗圃的对照中的叶中镉含量为6.15μg/g。对于所使用的全部菌株，与细菌1次处理相比，2次处理的降低率更高。
[表15]处理次数和降低效果
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：叶肉部分
〔实施例8〕土壤的种类与降低效果
考察了土壤的种类对降低效果的影响。本实验中，使用了烟草品种筑波1号，且在温室中进行。本实验中对JHJ6、JHL8和JHP31这3个菌株进行了试验。
接种源的制作像实施例2那样进行。
本实验中使用了火山灰土与砂土这2种土壤。在火山灰土或砂土中以重量比100∶1的比例混合黄色种用JT有机化肥后，像实施例2那样添加了氯化镉溶解液。
取样、试样中镉浓度的分析像实施例2那样进行。本实验中，微生物处理的和对照分别制作了4个试样。
本实验的结果如表16所示。
与对照的叶中镉浓度相比，用进行试验的JHJ6、JHL8和JHP31处理过的烟草叶中的镉浓度在火山灰土与砂土这两者中均低20％以上。
[表16]土壤种类与降低效果
Figure BPA00001259923700241
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：叶
〔实施例9〕细菌浓度与镉降低效果
考察了施用的细菌浓度对降低效果的影响。本实验中使用了烟草品种筑波1号，且在温室中进行。本实验中，对JHJ6、JHL8和JHP31这3个菌株进行了试验。
接种源的制作是将各菌株稀释成109、108、107cfu/ml数量级而得到接种液，并在移植前一天对苗的底部进行了灌注处理。
取样、试样中镉浓度的分析像实施例2那样进行。本实验中，各菌浓度的微生物处理区和对照均分别制作了4个试样。
本实验的结果如表17所示。
在本实验中，与对照相比，使用JHJ6、JHL8和JHP31菌株降低了叶中的镉浓度。施用了各细菌浓度的JHJ6、JHL8和JHP31的烟草叶中的镉浓度与对照相比降低10％以上。此外，对于各菌株，均可以见细菌浓度越高，降低率也越高的倾向。
[表17]处理菌浓度与降低效果
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：叶
〔实施例10〕番茄中的镉降低效果
在温室中考察了对番茄的镉降低效果。本实验在温室中进行。
接种源的制作像实施例2那样进行。本实验中对下述表18所示的7个菌株进行了试验。
番茄使用了小番茄品种Puchi eeru(株式会社Tohoku)。将其播种于温室肥土并育苗30天，将该苗移植至像实施例2那样制作的添加镉的土壤中。
移植70天后，对于2个番茄株分别采集5～7个果实，从每株上采集的样品合起来作为1个试样(果实：12～14个)，冻干后进行粉碎，作为分析用试样。本实验中，微生物处理的和对照均制作了4个试样。
试样中的镉浓度分析像实施例2那样进行。
本实验的结果如表18所示。
与对照的镉浓度相比，进行试验的7个菌株中的6个菌株显示20％以上的降低率。
[表18]番茄中的镉降低效果
Figure BPA00001259923700261
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：果实
〔实施例11〕辣椒中的镉降低效果
在温室中考察了对辣椒的镉降低效果。本实验在温室中进行。本实验中对下述表19所示的5个菌株进行了试验。
接种源的制作像实施例2那样进行。
辣椒使用了品种鹰之爪(Takanotsume)。对于购买的辣椒的苗，将其移植到像实施例2那样制作的添加镉的土壤中。
移植80天后，从辣椒株采集10～15个果实作为1个试样，冻干后进行粉碎，作为分析用试样。本实验中，微生物处理和对照均制作了4个试样。
试样中的镉浓度分析像实施例2那样进行。
本实验的结果如表19所示。
与对照的镉浓度相比，进行试验的5个菌株中，有3个菌株显示30％以上的降低率，有2个菌株显示20～30％的降低率。
[表19]辣椒中的镉降低效果
Figure BPA00001259923700271
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：果实
〔实施例12〕大豆中的镉降低效果
在温室中考察了对大豆的镉降低效果。本实验在温室中进行。
接种源的制作像实施例2那样进行。本实验中对下述表20所示的9个菌株进行了试验。
大豆使用了品种早生枝豆(白鸟系)(株式会社Tohoku)。播种于乙烯钵后百苗30天，将该苗移植到像实施例2那样制作的添加镉的土壤中。
移植45天后，对于2个大豆株，分别采集5～8个豆荚，将从每株采集的豆荚合起来作为1个试样，60～70℃干燥后，从豆荚取出豆子(30粒/试样)。按试样粉碎，作为分析用试样。本实验中，微生物处理和对照均制作了4个试样。
试样中镉浓度的分析像实施例2那样进行。
本实验的结果如表20所示。
与对照的镉浓度相比，进行了试验的9个菌株中，有6个菌株显示30％以上的降低率，有2个菌株显示20～30％的降低率，有1个菌株显示15～20％的降低率。
[表20]大豆中的镉降低效果
Figure BPA00001259923700281
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：豆子
〔实施例13〕青菜中的镉降低效果
在温室中考察了青菜的镉降低效果。本实验在温室中进行。本实验中，对表21所示的5个菌株进行了试验。
接种源的制作像实施例2那样进行。
青菜使用了品种KOMATSUNA(株式会社Sakata seed)。在园艺用花盆(长×宽×高：40cm×16.5cm×16cm)中装入6kg(容量6L)的添加镉的土壤，播种了青菜的种子。播种后第15天施用菌液200ml。
细菌施用30日后，采集青菜的地上部分，以2棵作为1个试样，60～70℃干燥后，按试样进行粉碎，作为分析用试样。本实验中，微生物处理和对照均制作了4个试样。
试样中镉浓度的分析按照实施例2的方法进行。
本实验的结果如表21所示。
与对照的镉浓度相比，进行了试验的5个菌株中，有2个菌株显示20％以上的降低率，有2个菌株显示10～20％的降低率。
[表21]青菜中的镉降低效果
Figure BPA00001259923700291
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：地上部分
〔实施例14〕细菌处理对镉以外的重金属的影响
本实验在苗圃中进行。本实验中使用栽培品种白肋种TAIHEI。
接种源的制作像实施例6那样进行。灌注处理像实施例4那样进行。取样和试样的制作像实施例6那样进行。叶中重金属浓度的分析像上述镉浓度的分析那样，按照实施例2所述的方法进行。
苗圃试验中JHJ6、JHL8和JHP31这3个菌株的结果如表22所示。
Cu(铜)：与对照的铜浓度相比，进行了试验的3个菌株显示10％以上的降低率。
Pb(铅)：与对照的铅浓度相比，进行了试验的3个菌株中，有1个菌株显示20％以上的降低率，有2个菌株显示10～20％的降低率。
Cr(铬)：与对照的铬浓度相比，进行了试验的3个菌株中，有2个菌株显示20％以上的降低率，有1个菌株显示10～20％的降低率。
Ni(镍)：与对照的镍浓度相比，进行了试验的3个菌株中，有2个菌株显示10％以上的降低率。
As(砷)：对照的砷浓度相比，进行了试验的3个菌株中，有2个菌株显示20％以上的降低率，有1个菌株显示10～20％的降低率。
[表22]对镉以外的重金属的影响
Figure BPA00001259923700301
平均浓度：4个样品的平均浓度，样品：叶肉部
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接并入本说明书作为参考。
Figure IPA00001259923200011
Figure IPA00001259923200021

Claims (10)

1.具有降低植物体中的重金属含量的功能的属于苍白杆菌属(Ochrobactrum)、产碱菌属(Alcaligenes)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属(Variovorax)、贪铜菌属(Cupriavidus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)或寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的细菌。
2.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述重金属选自镉、铜、铅、铬、镍和砷。
3.根据权利要求1或2所述的细菌，其为人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)或嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细菌，其为人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)JHA60菌株(保藏号NITE BP-549)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)JHB14菌株(保藏号NITE BP-550)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)JHC10菌株(保藏号NITE BP-551)、解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)JHG2菌株(保藏号NITE BP-552)、解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)JHL8菌株(保藏号NITE BP-554)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii)JHP30菌株(保藏号NITE BP-555)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii)JHP55菌株(保藏号NITE BP-557)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)JHP31菌株(保藏号NITE BP-556)或钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)JHJ6菌株(保藏号NITE BP-553)。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细菌，其被固定化于载体上。
6.一种降低植物体中的重金属含量的方法，该方法包括在植物体的根部或根部周围的土壤施用至少1种权利要求1～5中任一项所述的细菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在从播种起至将植物移植到苗圃后的时期里至少进行1次所述施用。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，通过将细菌直接施用到根部、或将细菌添加或混合在根部周围的土壤或水培液中来进行所述施用。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其中，所述植物选自茄科、禾本科、蓼科、豆科、十字花科、百合科、菊科和藜科。
10.一种用于降低植物体中的重金属含量的组合物，其包含权利要求1～5中任一项所述的细菌作为有效成分。
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