CN109593667A - Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，本发明采用微生物分离纯化方法，从电镀厂下水管道排污口的含铬土壤中筛选分离Cr(VI)还原菌，选择在150mg/L Cr(VI)溶液中生长，且Cr(VI)去除率可达73％的ZJ‑8作为实验菌株，采用生理生化法和16s rDNA测序法，对ZJ‑8进行鉴定，并分别研究其初始Cr(VI)浓度、pH、温度等对细菌生长和Cr(VI)去除效果的影响。本发明所筛选的ZJ‑8在有较高代谢活动的条件下具有较高的Cr(VI)去除能力，属于革兰氏阴性杆菌，经鉴定为苍白杆菌属Ochrobactrum sp.。ZJ‑8具有较强的去除Cr(VI)的能力，在pH 7‑9、接种量6％(体积分数)及30℃条件下，50mg/L的Cr(VI)在处理72h后，去除率可达89.4％。该细菌有望用于铬污染水体和土壤的修复。

Description

Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法
技术领域
本发明属于环境污染生物处理技术领域，特别涉及Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法。
背景技术
铬是一种剧毒重金属，广泛应用于电镀、制革、纺织印染、金属等加工行业。在自然界中，发现铬存在Cr(III)和Cr(VI)两种价态。Cr(III)是良性的并且容易吸附在土壤和水体中，而作为毒性较强的Cr(VI)不容易被吸附并且是可溶的。工业废水含有铬和盐离子对污水微生物菌群系统有毒害作用，通过还原或生物吸附能有效的去除Cr(VI)并显著降低对人体健康的危害，由于Cr(VI)可穿过原核和真核细胞膜造成氧化性细胞损伤，引起致畸、致癌等病变，故如何将其还原为低毒性的Cr(III)应予以重视。
传统的去除方法主要包括化学沉淀、化学氧化或还原、离子交换、过滤、电化学处理、反渗透、膜技术和蒸发回收等。但因花费昂贵、效率低下，而且操作复杂等原因，会产生大量的有毒污泥，需要进一步进行复杂的处理，容易产生二次污染，故难以推广。因此，开发具有创新性、低成本和生态友好的有毒重金属铬的去除方法是极为重要的。
各种各样的微生物，例如在工业废水和重金属污染的土壤中发现细菌、酵母、藻类、原生动物和真菌等。这些微生物为保护自己免受重金属的毒害而产生了各种机制，如吸附、吸收、甲基化、氧化和还原等。据报道，许多微生物将毒性强的Cr(VI)转化为毒性较小的Cr(III)，如Acinetobacter and Ochrobactrum、Arthrobacter、Pseudomonas sp.、Ochrobactrum sp.、Bacillus sp.、Desulfovibrio vulgaris、Cellulomonas spp.、Serratia marcescens等。
发明内容
本发明的目的在于从富集、培养后的含铬土壤中筛选分离出一株高效的Cr(VI)还原菌株ZJ-8，并对其形态、生理生化特征、16S rDNA序列及Cr(VI)还原过程的影响因素进行研究，期望能用于铬污染水体和土壤的环境修复。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，其特征在于：其步骤是：
(1)培养基的制备
细菌培养基(LB)：称取蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，葡萄糖5g，少量乳酸钠，加入1000mL蒸馏水中，用NaOH和HCl调节pH至7.9左右，于115℃灭菌30min，冷却后备用(固体培养基加入20g/L琼脂)。
含Cr(VI)培养基：实验中以重铬酸钾(K2Cr2O7)作为Cr(VI)源，在已灭菌的细菌培养基中加入相应浓度的重铬酸钾(将重铬酸钾溶液跟液体培养基分别灭菌，冷却后在超净工作台中将两溶液混合在一起)，调至所需浓度。
(2)菌株分离
铬还原菌从铬污染土壤中分离。称取10g土壤样品于已灭菌的250mL锥形瓶中，加入50mL灭菌培养基，置于恒温摇床中，30℃、150r·min-1摇床培养24h，在LB液体培养基中逐步提高含Cr(VI)浓度，增加Cr(VI)还原菌的耐受性，用10倍稀释法将其稀释后涂布在固体培养基上进行菌株的分离筛选和培养。
(3)菌株筛选
通过测定菌株在不同Cr(VI)浓度下的OD600对每一株分离菌株评估它的最低抑菌浓度来测定它的耐Cr(VI)能力，抑制细菌生长的最低浓度被认为是MIC(Minimuminhibitory concentration)。从样品中分离得到8株菌株能耐受150mg/L、200mg/L Cr(VI)，并且培养液中Cr(VI)去除率可以达到50％以上。
(4)菌株鉴定
将菌株划线接种于固体培养基，培养2-3d，通过革兰氏染色法在显微镜下观察菌落形态，并进行生理生化检测。
将菌株液体培养24h，离心收集菌体，利用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提基因组总DNA。使用16S rDNA通用引物27F：
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：
5’-GGTTACCTTGTTACGACGACTT-3’，直接扩增菌体的16S rDNA片段。PCR扩增产物序列送由北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
本发明的优点和积极效果：
所述的Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，其特征在于：其培养条件为pH 7-9、接种量6％(体积分数)及30℃条件下，50mg/L的Cr(VI)在处理72h后，去除率可达89.4％。
所述的Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，所筛选的ZJ-8菌株的16S rDNA序列具有最大同源性的菌株是Ochrobactrum tritici strain，同源性达99％。
附图说明
图1为ZJ-8在含Cr(VI)与不含Cr(VI)培养基中的生长曲线；
图2为初始pH对菌株生长情况及去除Cr(VI)效果的影响；
图3为温度对菌株生长情况及去除Cr(VI)效果的影响；
图4为接种菌量对生长情况及去除Cr(VI)效果的影响。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，其步骤是：
(1)菌株筛选
根据测定各菌株在不同Cr(VI)浓度的生长情况，筛选出对Cr(VI)耐受能力最强的菌株。实验共筛选出25株耐铬菌株，分别命名为ZJ-1，ZJ-2……ZJ-24、ZJ-25，其中5株菌株可在200mg/L Cr(VI)溶液中生长，5株可以在150mg/L Cr(VI)溶液中生长，8株可以在100mg/L Cr(VI)溶液中生长，7株可以在50mg/L Cr(VI)溶液中生长，其中Cr(VI)去除率达到50％以上的有8株，ZY-8不仅可以在150mg/L Cr(VI)溶液中生长，且Cr(VI)去除率可达73％，因此确定该菌株为本研究的实验菌株。
(2)菌株鉴定
经过反复筛选，选择ZJ-8菌株作为本研究菌株，该菌株形态及生理生化特征表示，该菌革兰氏呈阴性，杆状，表明为革兰氏阴性杆菌。
经测序得到耐Cr(VI)菌株ZJ-8的16S rDNA序列，将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行同源性比对分析，结果表明，所选择的ZJ-8菌株的16S rDNA序列具有最大同源性的菌株是Ochrobactrum tritici strain，同源性达99％，因此，可以初步确定ZJ-8菌株为Ochrobactrum tritici strain。
(3)培养条件
培养条件为pH 7-9、接种量6％(体积分数)及30℃条件下，50mg/L的Cr(VI)在处理72h后，去除率可达89.4％。
以上所述仅为本发明的较佳实施案例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，其特征在于：其步骤是：
(1)培养基的制备
细菌培养基(LB)：称取蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，葡萄糖5g，少量乳酸钠，加入1000mL蒸馏水中，用NaOH和HCl调节pH至7.9左右，于115℃灭菌30min，冷却后备用(固体培养基加入20g/L琼脂)。
含Cr(VI)培养基：实验中以重铬酸钾(K2Cr2O7)作为Cr(VI)源，在已灭菌的细菌培养基中加入相应浓度的重铬酸钾(将重铬酸钾溶液跟液体培养基分别灭菌，冷却后在超净工作台中将两溶液混合在一起)，调至所需浓度。
(2)菌株分离
铬还原菌从铬污染土壤中分离。称取10g土壤样品于已灭菌的250mL锥形瓶中，加入50mL灭菌培养基，置于恒温摇床中，30℃、150r·min-1摇床培养24h，在LB液体培养基中逐步提高含Cr(VI)浓度，增加Cr(VI)还原菌的耐受性，用10倍稀释法将其稀释后涂布在固体培养基上进行菌株的分离筛选和培养。
(3)菌株筛选
通过测定菌株在不同Cr(VI)浓度下的OD600对每一株分离菌株评估它的最低抑菌浓度来测定它的耐Cr(VI)能力，抑制细菌生长的最低浓度被认为是MIC(Minimum inhibitoryconcentration)。从样品中分离得到8株菌株能耐受150mg/L、200mg/L Cr(VI)，并且培养液中Cr(VI)去除率可以达到50％以上。
(4)菌株鉴定
将菌株划线接种于固体培养基，培养2-3d，通过革兰氏染色法在显微镜下观察菌落形态，并进行生理生化检测。
将菌株液体培养24h，离心收集菌体，利用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提基因组总DNA。使用16S rDNA通用引物27F：
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：
5’-GGTTACCTTGTTACGACGACTT-3’，直接扩增菌体的16S rDNA片段。PCR扩增产物序列送由北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
2.根据权利要求1所述的Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，其特征在于：其培养条件为pH7-9、接种量6％(体积分数)及30℃条件下，50mg/L的Cr(VI)在处理72h后，去除率可达89.4％。
3.根据权利要求1所述的Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，所筛选的ZJ-8菌株的16SrDNA序列具有最大同源性的菌株是Ochrobactrum tritici strain，同源性达99％。
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