CN111235055A

CN111235055A - 一种赫罗纳欧文菌及其还原六价铬的应用

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Publication number: CN111235055A
Application number: CN202010049784.2A
Authority: CN
Inventors: 张德超; 许静媛; 王灵华; 许福土
Original assignee: Zhejiang Yifeng Marine Biological Product Co ltd
Current assignee: Zhejiang Yifeng Marine Biological Product Co ltd
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111235055B

Abstract

本发明提供一株具有将Cr(VI)还原为Cr(III)能力的赫罗纳欧文菌RB‑4株，其保藏号为CGMCC No.18992。本发明所提供的赫罗纳欧文菌RB‑4在制备发酵鱼粉中的应用；本发明的赫罗纳欧文菌RB‑4用于去除鱼粉中重金属Cr(VI)，将其还原为Cr(III)。菌株RB‑4具有很强还原Cr(VI)的功能，主要是通过代谢产生相关的酶系，将Cr(VI)还原转化为Cr(III)，而不是靠菌体自身吸收或富集Cr(VI)等有毒成分。由于细菌在生长过程中不断繁殖和代谢，不断将Cr(VI)还原为Cr(III)，不会出现反应饱和现象，设备工艺简单，环境友好，投资少，通过菌种RB‑4发酵能将低值鱼粉中的Cr(VI)含量降低到国家标准的安全范围内，解决饲料安全问题，增加其在养殖中的安全使用，在很大程度上提高了饲养业的经济效益。

Description

一种赫罗纳欧文菌及其还原六价铬的应用

技术领域

本发明具体涉及一种利用赫罗纳欧文菌发酵还原低值鱼粉的六价铬Cr(VI)重金属含量的方法，属于水产饲料加工技术领域。

背景技术

鱼粉是一种以海洋动物为原料，经过相应的加工工艺制成的动物性蛋白饲料。鱼粉因其蛋白质含量高、含有多种必需氨基酸、容易被吸收等多种优点，目前是水产饲料中主要的蛋白质源。中国是世界水产养殖大国，2018年的水产养殖总产量超过5000万吨，占我国水产品总产量的比重达78％以上。中国是鱼粉消耗量最大的国家。鱼粉生产一般分为原料捕捞、原料筛选、去油、脱水、粉碎、包装等工艺过程。鱼粉质量影响因素包括原料鱼成分、原料新鲜度、加工温度、脂肪质量以及微生物标准等。这些因素任何一个环节存在不足，都会影响鱼粉的整体生产质量，影响其在水产养殖中的应用效果。

近年来由于海洋重金属污染和人类海洋活动的频繁导致海洋环境的日益恶化，海洋生物的生活环境变化导致鱼类的整体健康水平受到威胁。近几年调查数据显示市场上低值鱼粉中主要的重金属污染有镉、汞、铅、铬、砷等。其中六价铬(Cr(VI))的毒性最大，Cr(VI)极易溶于水，能使血红蛋白变成高铁血红蛋白，机体发生缺氧症状，影响机体的氧化还原和水解过程，具有高氧化性、高毒性、致癌性和致突变性。鱼粉中高含量的Cr(VI)主要有2个原因：(1)沿海环境金属污染造成鱼体内铬含量高,从而使鱼粉的铬含量升高。(2)有人为提高鱼粉的蛋白含量，违规添加皮革粉，至使鱼粉中铬含量升高。近几年来检测的低值鱼粉中，Cr(VI)最高达到1000mg/kg，引起严重的饲料安全问题。

在自然界中，重金属铬主要以Cr(VI)或Cr(III)的形式存在。Cr(III)是自然环境中存在的，Cr(III)的毒性仅为Cr(VI)的百分之一，因此通常将Cr(VI)转化成Cr(III)，来减轻Cr(VI)的危害，但传统的化学修复技术成本较高，还容易造成二次污染；而微生物可以通过生物转化作用改变重金属离子的价态或形态，使其无害化，或通过吸附作用或胞内累积作用将重金属去除。所以通过微生物发酵技术减少低值鱼粉的Cr(VI)重金属含量，具有环境友好、成本低等优点，在一定程度上降低了饲料的毒性，使Cr(VI)有毒成分的含量降到安全范围内，解决饲料安全问题，在很大程度上提高了饲养业的经济效益，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种赫罗纳欧文菌及其应用，即一株具有将Cr(VI)还原为Cr(III)的微生物，对低值鱼粉进行发酵，去除鱼粉中重金属Cr(VI)有害物质。发酵工艺简单，环境友好，过程稳定，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。

本发明首先提供一株具有将Cr(VI)还原为Cr(III)能力的赫罗纳欧文菌(Erwiniagerundensis)RB-4株，保藏号为CGMCC No.18992，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年11月21日。

本发明所提供的赫罗纳欧文菌RB-4在制备发酵物中的应用；

所述的发酵物，为发酵鱼粉。

本发明的赫罗纳欧文菌RB-4用于去除鱼粉中重金属Cr(VI)，将其还原为Cr(III)。

一种去除鱼粉中重金属Cr(VI)的方法，所述的方法，其具体的步骤如下：

1)制备产品A：添加碳源和无机盐等辅料到鱼粉中，得到产品A；

并制备种子液：将所述的赫罗纳欧文菌RB-4接种至液体培养基，温度为30℃，培养24小时；

并制备发酵液：将所述的种子液，按10％接种量，接种至液体培养基，温度为30℃，培养48-72小时；

3)制备产品B：将发酵液加入到产品A中得到产品B，其中发酵液与产品A的质量比为15:100，并调整pH8.0，最终的料水质量比1:1，搅拌混合均匀后加入发酵罐；

4)制备产品C：在温度为30℃和pH为8.0条件下，对产品B进行发酵，时间为5天，得到产品C；

5)产品C经过70℃高温浓缩得到发酵鱼粉产品；

所述的碳源和无机盐等辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计，分别为：葡萄糖糖3-5％，磷酸二氢钾1-2％，氯化锰0.02-0.025％。

所述的液体培养基的pH 7.0-7.2，并按照以下质量比配比：酵母提取物5份，胰蛋白胨10份，氯化钠10份，蒸馏水1 000份。

本发明具有以下几个优点：

(1)本发明所用的菌种RB-4分离自山东省青岛近海重金属垃圾倾倒区沉积物环境，该倾倒区含有重金属Cr(VI)等固体废弃物，Cr(VI)重金属大部分转移到悬浮颗粒物和底层沉积物中，该沉积物样品是筛选还原Cr(VI)相关微生物的理想分离物。菌种RB-4具有很强还原Cr(VI)的功能，主要是通过代谢产生相关的酶系，将Cr(VI)还原转化为Cr(III)，而不是靠菌体自身吸收或富集Cr(VI)等有毒成分。由于细菌在生长过程中不断繁殖和代谢，不断将Cr(VI)还原为Cr(III)，不会出现反应饱和现象，设备工艺简单，环境友好，投资少，通过菌种RB-4发酵能将低值鱼粉中的Cr(VI)含量降低到国家标准的安全范围内，解决饲料安全问题，增加其在养殖中的安全使用，在很大程度上提高了饲养业的经济效益。相比化学法和酶法处理，极大地降低了成本。

(2)本发明所用的菌种RB-4，能产生蛋白酶，将原料鱼粉中的大分子物质继续降解为易吸收利用的小分子活性肽，发酵后进一步提高了鱼粉中酸溶蛋白的含量。

(3)本发明所用的菌种RB-4生长温度范围在4℃-45℃，能在0-6％盐浓度下生长繁殖，耐盐好，相对于其它来自陆地环境的需要较高营养条件且耐盐差的铬还原菌，该菌株将更节约成本且适合发酵海洋生物，而且代谢过程会消耗盐，进一步降低发酵产物中盐浓度，提升发酵产品的品质。

附图说明

图1：筛选具有还原Cr(VI)功能的细菌步骤流程；

图2：RB-4菌落照片图；

图3：RB-4细胞照片图；

图4：基于16S rRNA基因序列的系统发育树；

图5：Cr(VI)初始浓度对RB-4生长的影响；

图6：Cr(VI)初始浓度对RB-4还原Cr(VI)的影响；

图7：初始pH对RB-4还原Cr(VI)的影响；

图8：不同浓度Mn²⁺对RB-4还原Cr(VI)的影响；

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：赫罗纳欧文菌RB-4的筛选和鉴定

筛选具有还原Cr(VI)功能的细菌步骤流程如图1所示。首先采集青岛港董家口港区倾倒区沉积物(含有重金属垃圾)样品，取沉积物20克，加入到90mL还原Cr(VI)富集液体培养基中，30℃富集培养7天。然后取0.1mL加到还原Cr(VI)初筛固体培养基平板上，采用稀释涂布法分离菌株，30℃培养7天，共分离得到8株待筛选的菌株。

进一步验证分离菌株还原Cr(VI)的能力，以及Cr(VI)的去除是通过生化反应还是菌体自身吸收来完成。将8株分离细菌，接种到还原Cr(VI)复筛液体培养基中，30℃150r/min摇床振荡培养5天。取培养液，冰浴条件下超声波(200w)破碎5分钟，超声破碎条件设定为：5s超声破碎，3s间隔；破碎完成后，4℃12000r/min离心10min，取离心后的滤液上清液作为检测的样品。采用1,5-diphenylcarbazide(DPC)二苯碳酰二肼显色法来测定Cr(VI)含量，计算Cr(VI)还原率。

确定RB-4株还原Cr(VI)效果最好，Cr(VI)的浓度为500mg/L时，还原率为92％。

还原Cr(VI)富集液体培养基：葡萄糖，1g；淀粉，10g；水解酪蛋白，1g；Na₂HPO₄，0.5g；水1000mL，pH 8.0左右,121℃灭菌20min。Cr(VI)终浓度为100mg/L，Cr(VI)母液为重铬酸钾溶液，使用前用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。

还原Cr(VI)初筛固体培养基：葡萄糖，1g；淀粉，10g；水解酪蛋白，1g；Na₂HPO₄，0.5g；琼脂，15g；水1000mL，pH 8.0左右,121℃灭菌20min。Cr(VI)浓度为300mg/L，Cr(VI)母液为重铬酸钾溶液，使用前用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。

还原Cr(VI)复筛液体培养基：葡萄糖，1g；淀粉，10g；水解酪蛋白，1g；Na₂HPO₄，0.5g；水1000mL，pH 8.0左右,121℃灭菌20min。Cr(VI)的浓度为500mg/L。Cr(VI)母液为重铬酸钾溶液，使用前用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。

采用1,5-diphenylcarbazide(DPC)二苯碳酰二肼显色法来测定Cr(VI)含量。具体步骤：称取0.025g DPC溶于9.67mL丙酮，并加入330μL 3M H₂SO₄配置0.25％的(w/v)DPC。在1mL反应体系中加入200μL样品，400μL 20mM MOPS-NaOH缓冲液(pH 7.0)，33μL 3M H₂SO₄，40μL 0.25％DPC，327μL蒸馏水。以蒸馏水为对照，在540nm下测吸光度，并由标准曲线(0.01-0.4mM)计算Cr(VI)浓度。由于DPC显色试剂要现配现用。

Cr(VI)的还原率(％)＝(C₀－C_f)/C₀×100％(1)，其中C₀为初始Cr(VI)的浓度，mg/L；C_f为反应结束时Cr(VI)的浓度mg/L。

对RB-4菌株进行分类鉴定：

本发明涉及的菌株具有如下特征：

1)形态学特征：在LB培养基上，30℃培养24h后，菌落直径大小为1.5-2mm(图2)，米黄色，圆形，鼓起，边缘整齐。兼性厌氧，革兰氏阴性菌，镜检结果显示，细胞形态为杆状(0.5-0.8×2.0-4.4μm)(图3)，不产芽孢。

2)生理生化特性：该菌可生长盐度范围为0％-6％(w/v)(最适2-4％),生长pH范围为6-9.0(最适7.0-8.0)，生长温度范围为4℃-45℃(最适20-25℃)。触酶阳性，氧化酶，明胶酶和脲酶阴性。β-半乳糖苷酶，柠檬酸盐利用实验结果为阳性。精氨酸双水解酶,赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，产硫化氢实验，吲哚试验，VP实验结果均为阴性。能利用葡萄糖，甘露醇，蔗糖，蜜二糖和阿拉伯糖发酵产酸。不能利用山梨醇，鼠李糖和苦杏仁甙发酵产酸。

3)化学特性：

RB-4细胞脂肪酸的主要成分包括：C_16:1ω7c and/or iso-C_15:0 2-OH(summedfeature 3)(31.7％)，C_16:0(25.7％)，C_18:1ω7c(11.3％)，iso-C_16:1I and/or C_14:0 3-OH(summed feature 2)(15.8％)，C_12:0(5.1％)和C_17:0cyclo(7.9％)。

实施例2：菌株RB-4的16S rRNA基因的扩增与序列分析

16S rRNA基因模板的制备：使用细菌DNA提取试剂盒(天根，货DP302-02)。操作步骤按照该试剂盒说明进行，最终得到RB-4菌体的DNA样品。PCR扩增：PCR扩增所用引物为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR反应体系60μL：2×Taq Mix 30μL，引物：27F，1541R各3μL，模板3μL，无菌水补足至60μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，45s；57℃，1min 30s；72℃，1min 30s，30个循环；72℃，10min。将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序，序列为SEQ ID NO:1。

将测序好的序列通过在线的NCBI的BLAST与Genbank序列数据库进行同源性序列对比分析，发现菌株RB-4属于欧文菌属，与其最相近的种是赫罗纳欧文菌Erwiniagerundensis。并利用MEGA 7.0软件，选取欧文菌属已发表的不同种，以邻接法(neighbour-joining)构建系统发育树(图4)，发现菌株RB-4与赫罗纳欧文菌Erwinia gerundensis聚类在一个分支上，表明菌株RB-4与赫罗纳欧文菌Erwinia gerundensis系统发育关系最近。因此，该菌为被命名为赫罗纳欧文菌RB-4。

该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.18992，保藏日期为2019年11月21日。

在实验室中，该菌株长期保藏方式为将菌液加入到含甘油终浓度为20％的甘油管里，放入-80℃冰箱保存；短期保藏方式为将菌株接种LB斜面培养基斜面上，在4℃保存备用。

实施例3：赫罗纳欧文菌RB-4还原Cr(VI)的性质研究

步骤1：Cr(VI)初始浓度对RB-4生长的影响：将赫罗纳欧文菌RB-4接种于100mL LB培养基，30℃培养24h。按5％的接种量，接种到100mL还原Cr(VI)复筛液体培养基中，Cr(VI)的浓度分别为0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L和800mg/L。在30℃，150r/min摇床振荡培养7天，观察不同Cr(VI)初始浓度下，RB-4生长曲线和对Cr(VI)的还原率(％)。

从图5可看出，不同的Cr(VI)初始浓度对赫罗纳欧文菌RB-4的生长有不同的影响，随着Cr(VI)初始浓度的增加，赫罗纳欧文菌RB-4最大的菌体生长量不断降低，对其生长的抑制越强，Cr(VI)初始浓度为800mg/L时，赫罗纳欧文菌RB-4生长受到抑制作用。

从图6可看出，Cr(VI)的还原率随着Cr(VI)初始浓度的增加而减少，当Cr(VI)初始浓度在400mg/L及以下时，Cr(VI)的还原率在3-4天内，Cr(VI)去除率基本达到100％。当Cr(VI)初始浓度在600mg/L时，Cr(VI)去除率基本达到90％。当Cr(VI)初始浓度在800mg/L时，Cr(VI)去除率下降到60％。因此随着Cr(VI)初始浓度增加，RB-4的生长繁殖受到Cr(VI)高毒性的影响，还原能力减弱。

步骤2：赫罗纳欧文菌RB-4还原Cr(VI)的最适反应pH：将赫罗纳欧文菌RB-4接种于100mL的LB培养基，30℃培养24h。按5％的接种量，分别接种到pH为4、5、6、7、8、9、10的100mL还原Cr(VI)复筛液体培养基中，Cr(VI)的浓度为400mg/L。在30℃，150r/min摇床振荡培养7天，观察不同pH下，RB-4对Cr(VI)的还原率(％)。

从图7可看出，赫罗纳欧文菌RB-4还原Cr(VI)对的最适反应pH为8.0，在7天内去除率基本达到100％，pH值会影响Cr(VI)在溶液中溶解度，进而改变细胞表面的电荷，影响相关酶蛋白质亚基的结构变化，干扰Cr(VI)催化还原过程；碱性条件下pH值8.0时，赫罗纳欧文菌RB-4对Cr(VI)的还原能力最强。

步骤3：氯化锰对赫罗纳欧文菌RB-4去除Cr(VI)的影响：将赫罗纳欧文菌RB-4接种于100mL的LB培养基，30℃培养24h。按5％的接种量，接种到pH8.0的100mL还原Cr(VI)复筛液体培养基中，Cr(VI)的浓度为400mg/L，分别加入0、1、2、3和5mmol/L MnCl₂，在30℃，150r/min摇床振荡培养7天，观察添加不同浓度Mn²⁺对RB-4对Cr(VI)的还原率(％)的影响。

Mn²⁺是Mn-SOD催化中心的重要组成部分，可参与细胞的代谢合成具有抗氧化活性的Mn复合物，最终提高还原Cr(VI)的效率。从图8可看出，添加Mn²⁺可以使RB-4还原Cr(VI)的效率提高，当添加1-2mmol/L的MnCl₂时，相比没有添加MnCl₂组，Mn²⁺可以加快Cr(VI)的还原。但当超过一定的范围(>3mmol/L)，Mn²⁺反而会降低Cr(VI)的还原效率。

实施例4：赫罗纳欧文菌RB-4的应用

步骤1：制备赫罗纳欧文菌RB-4的细胞液体培养物：取-80℃保存的菌种在LB固体培养基划线，在30℃培养，挑取单菌落接种于装有25mL LB培养基的100mL三角瓶中，培养温度为30℃，置摇床上以150r/min的转速培养20-24h至对数生长中期，即得到赫罗纳欧文菌RB-4的细胞液体培养物；

步骤2：摇瓶发酵培养：接种量为2％(v/v)，接种于装有200mL LB培养基的500mL三角瓶中，培养温度为30℃，150r/min的转速摇床振荡培养20-24h，得到赫罗纳欧文菌RB-4发酵液。

步骤3：继续摇瓶发酵培养：接种量为2％(v/v)，接种于1000mL LB液体培养基(装于2000mL三角瓶)中，培养温度为30℃，150r/min的转速下培养48h，得到赫罗纳欧文菌RB-4发酵液。

步骤4：以50公斤低值巴基斯坦鱼粉为原料，加入葡萄糖糖5公斤，磷酸二氢钾1公斤，氯化锰25克，并调整pH为8.0，搅拌均匀，加入到发酵罐中。

步骤5：发酵罐中加入15升发酵液，再加入水分，最终的料水质量比1:1，温度为30℃，无菌空气通入量为1.5vvm，转速为200rpm，发酵时间为5天，发酵结束后70℃烘干，得到发酵鱼粉。

步骤6：测定发酵鱼粉的理化指标和Cr(VI)的含量(表1)。

表1发酵鱼粉的理化指标和Cr(VI)的含量

目前鱼粉国内执行的标准为SC/T3501—1996中鱼粉中金属铬(以六价铬计)允许量小于10mg/kg。本发明采用赫罗纳欧文菌RB-4发酵巴基斯坦鱼粉，使该低值鱼粉中Cr(VI)的含量(mg/kg)由96.5降低到3.1，有效降低了巴基斯坦低值鱼粉中Cr(VI)的含量，使其满足国家标准。

本发明的菌株具有环境友好、成本低等优点，在一定程度上降低了饲料的毒性，使Cr(VI)有毒成分的含量降到安全范围内，解决饲料安全问题，在很大程度上提高了饲养业的经济效益，具有重要的意义。

序列表

<110> 浙江亿丰海洋生物制品有限公司

<120> 一种赫罗纳欧文菌及其还原六价铬的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1385

<212> DNA

<213> 赫罗纳欧文菌(Erwinia gerundensis)

<400> 1

agcacagagg agattgctcc tcgggtgacg agtggcggtc gggtgagtaa tgtctgggga 60

tctgcccgat ggagggggat aaccactgga aagggtggct aataccgcat aacgtcacaa 120

gaccaaagtg ggggaccttc gggcctcaca ccatcggatg aacccagttg ggattagcta 180

gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac gatcactagc tggtctgaga ggatgaccag 240

ccacactgga actgagacac gatccagact cctacgggag gcaccagtgg ggaatatttc 300

acaatgggcg caagcctgat gcagccctgc cgcgtgtatg aagaaggcct tcgggttgta 360

aagtactttc agcggggagg aaggggacga ggttaacaac ctcgttcatt gacgttaccc 420

gcagaagatg caccggctaa ctgcgtgcca gcagccgcgg tactacggag ggtgcaagcg 480

ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtc tgttaagtca gatgtgaaat 540

ccccgggctt aacctgggaa ctgcatttga aagtggcagg cttgagtctt gtacaggggg 600

gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc ggtgccgaag 660

gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gagcgaaagc gtggggagca aacaggatta 720

gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgacttgg tggctgtgag catgactcgt 780

ggcttccgga gataacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac 840

tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttact tcgattcaac 900

gcgaagaacc ttacctgctc ttgaaatcca cggaattcgg cagagatgcc ttagtgcctt 960

cgggatccgt gagacaggtg ctgcctggct gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt 1020

taagacccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcga gcgattcggt cgggaactca 1080

aaggagactg ccggtgataa accggaggta ggtggggatg ccgtcaagtc atcatgaccc 1140

ttacgagcag ggctacacaa gtgctaaaat ggcgcataca tagagaagcg acctcgcgag 1200

accaatcgga cctcacaaag tgcgtcgtag tccggatcgg agtctgcaac tcgactccgt 1260

gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgcaacg gtgaatacgt tcccgcgcct 1320

tgtacacacc gcccgtcact ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt agcttaacct 1380

tcggg 1385

Claims

1.一株赫罗纳欧文菌，其特征在于，所述的赫罗纳欧文菌的保藏编号为CGMCCNo.18992。

2.权利要求1所述的赫罗纳欧文菌在制备发酵物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵物为发酵鱼粉。

4.权利要求1所述的赫罗纳欧文菌去除鱼粉中重金属的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的重金属为六价铬。

6.一种去除鱼粉中重金属六价铬方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求1所述的赫罗纳欧文菌处理鱼粉。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

5)产品C经过70℃高温浓缩得到发酵鱼粉产品。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的碳源和无机盐等辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计分别为：葡萄糖糖3-5％，磷酸二氢钾1-2％，氯化锰0.02-0.025％。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基的pH 7.0-7.2，并按照以下质量比配比：酵母提取物5份，胰蛋白胨10份，氯化钠10份，蒸馏水1 000份。