CN111019868B - 一种嗜热深海微小杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种嗜热深海微小杆菌，其保藏号为CGMCC No.18990，本发明所提供的深海微小杆菌P‑47‑3株用于发酵鱼浆。本发明所用的菌种P‑47‑3分离自深海热液极端环境，产芽孢，生长温度范围在10℃‑65℃，能在0‑14％盐浓度下生长繁殖，而一般的高温菌主要来自热泉等陆地环境，耐盐性差，不能在高盐的条件下生长，发酵海洋生物制品有很大的局限性，而菌种P‑47‑3具有嗜盐性不仅适合发酵海洋生物，而且代谢过程会消耗盐，进一步降低发酵产物中盐浓度，提升发酵产品的品质。

Description

一种嗜热深海微小杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物筛选应用技术领域，具体涉及一种嗜热深海微小杆菌及其应用。

背景技术

鱼粉因其蛋白质含量高、含有多种必需氨基酸、容易被吸收等多种优点，目前是水产饲料中主要的蛋白质源。中国是世界水产养殖大国，2018年的水产养殖总产量超过5000万吨，占我国水产品总产量的比重达78％以上。中国是鱼粉消耗量最大的国家。中国水产养殖业每年都会消耗掉250万吨左右的鱼粉(部分用于禽畜养殖)，其中120万吨为进口鱼粉，130万吨为国产鱼粉。由此可见，中国水产养殖业依赖于鱼粉资源，同时也受到国外进口鱼粉的限制。

在水产饲料生产中，常规的动物性蛋白质原料鱼粉一般采用蒸煮、压榨、烘干的生产流程得到，但由于高温常导致营养素的损失，甚至可能产生一些有毒有害的物质，如高温鱼粉中的肌胃糜烂素等。基于国内鱼粉行业新产品开发力度不足、技术落后、设备陈旧以及环保高压、海洋资源日益减退等现状，鱼粉行业的生存空间逐渐被挤压，探索鱼粉辅助品甚至是代替品成为了今后水产养殖的一大方向。

目前制备酶解和发酵鱼浆技术存在以下缺陷。(1)酶解鱼浆的制备工艺中，仅利用内源酶，酶解不彻底；外加蛋白酶等商业酶增加了成本；酶解反应后需要90℃左右高温灭酶处理，会破坏鳀鱼的功能性活性物质；酶解产物流动性差，容易堵塞管道。(2)普通发酵鱼浆的制备工艺中，发酵的菌种一般陆地来源，用于发酵海洋生物，在耐盐性方面比较差。为防止发酵过程腐败菌的生长繁殖，发酵前需要对原料进行100℃灭菌，这样会把鱼本身的内源酶全部灭活，并且高温处理会破坏鳀鱼的功能性活性物质。目前产高温蛋白酶菌种一般来自陆地热泉等环境，由于海洋高温环境取样的特殊性，分离自深海高温环境的产高温蛋白酶菌种，用于发酵鳀鱼，目前没有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜热深海微小杆菌及其应用，即提供一株深海高温环境来源的，能产高温蛋白酶的深海微小杆菌；并利用该深海微小杆菌制备发酵鱼浆，既不需要普通微生物发酵鱼浆前的原料高温灭菌处理，也不需要酶解鱼浆后的高温灭酶处理，发酵过程稳定，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。

本发明首先提供一株产高温蛋白酶的深海微小杆菌P-47-3，保藏号为CGMCCNo.18990，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年11月21日，分类命名：深海微小杆菌Exiguobacterium profundum。

本发明所提供的深海微小杆菌P-47-3株用于发酵鱼浆；

本发明另一个方面还提供一种制备发酵鱼浆的方法，是使用上述的深海微小杆菌P-47-3株来发酵鳀鱼制备的；

所述的方法，其一种具体的步骤如下：

1)制备鳀鱼鱼浆：以新鲜的鳀鱼为原料，用绞肉机绞碎成糜；

2)制备产品A：添加碳源和无机盐等辅料到鱼糜中，得到产品A；

并制备种子液：将所述的深海微小杆菌接种至液体培养基，温度为40℃，培养24小时；

并制备发酵液：将所述的种子液，按10％接种量，接种至液体培养基，温度为40℃，培养48-72小时；

3)制备产品B：将发酵液加入到产品A中得到产品B，其中发酵液与产品A的质量比为20-30:100，并调整pH，最终的料水质量比1:0.2-0.3，搅拌混合均匀后加入发酵罐；

4)制备产品C：在温度为55-57℃，对产品B进行发酵，时间为36-40个小时，得到产品C；

5)产品C经过高速离心，将骨刺等不溶物沉淀，上清液再经过70℃低温真空浓缩，4个小时，至水分含量为45％左右，得到发酵鱼浆产品；

所述的碳源和无机盐等辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计，分别为：食品级红糖1-5％，食品级磷酸二氢钾1-2％，食品级硫酸镁1％。

所述的液体培养基的pH 7.0-7.2，并按照以下质量比配比：酵母提取物5份，胰蛋白胨10份，氯化钠10份，蒸馏水1 000份。

本发明具有以下几个优点：

(1)本发明所用的菌种P-47-3分离自深海热液极端环境，产芽孢，生长温度范围在10℃-65℃，能在0-14％盐浓度下生长繁殖，而一般的高温菌主要来自热泉等陆地环境，耐盐性差，不能在高盐的条件下生长，发酵海洋生物制品有很大的局限性，而菌种P-47-3具有嗜盐性不仅适合发酵海洋生物，而且代谢过程会消耗盐，进一步降低发酵产物中盐浓度，提升发酵产品的品质。

(2)采用普通菌种发酵鱼浆，加入菌种前，需要对原料进行100℃或100℃以上的高温灭菌处理，把鱼原料本身的一些腐败菌、致病菌和杂菌杀死。这样高温处理不仅增加了能耗成本，而且会使鱼本身的内源酶全部失活。而本发明中，不需要对原料进行高温处理，直接在55℃左右进行发酵，工艺简单，不仅能完全抑制腐败菌、致病菌和杂菌的生长，而且最大程度保留了内源酶，使发酵和酶解同时进行。

(3)采用生物酶生产酶解鱼浆时，酶制剂的成本比较高，酶解反应结束后，需要对产物进行90℃左右的高温灭酶处理，增加了能耗成本，会破坏鳀鱼的功能性活性物质；酶解反应产物的流动性较差，容易堵塞管道，而本发明采用的菌种P-47-3，通过发酵产生不同的酶系，将鱼蛋白降解为小分子的生物肽效率更高，产物的流动性好。

(4)本发明的发酵鱼浆，经过黄颡鱼饲养实验结果表明，在黄颡鱼日粮中添加8.5％发酵鱼浆可完全替代国产特级鱼粉促进鱼体生长，降低饲料系数，具有非常好的应用前景。

附图说明

图1：产蛋白酶高温菌的筛选流程图；

图2：P-47-3在蛋白酶筛选平板生长图；

图3：P-47-3菌落照片图；

图4：P-47-3细胞照片图；

图5：P-47-3化学极性酯成分的薄层层析图，其中DPG为Diphosphatidylg lycerol双磷脂酰甘油，PE为Phosphatidylethanolamine磷脂酰乙醇胺，PG为Phosphatidylglycerol磷脂酰甘油酯，PL为Phospholipid磷酯，L为Lipid酯；

图6：酪氨酸标准曲线图；

图7：蛋白酶作用的最适温度图；

图8：蛋白酶作用的最适pH图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：深海微小杆菌P-47-3的筛选和鉴定

筛选产蛋白酶的高温菌流程如图1所示。首先对从日本冲绳热液区获得的水样采用MA2216E培养基(Difco，货号：212185)稀释涂布法分离菌株，共分离得到42株。通过温度实验，初步筛选出12株能在50℃还能继续生长的菌株。再采用蛋白酶筛选培养基，点接种平板，培养3-5天后观察，形成透明圈的为阳性，筛选到6株产蛋白酶菌株，其中P-47-3菌株的透明圈最大(如图2所示)。

其中蛋白酶筛选培养基按照以下配比：(1)称取4g商业进口脱脂奶粉(Skim milk)(Difco，货号232100)，加入100mL蒸馏水，121℃灭菌20min单独灭菌。(2)蛋白胨，1g；酵母提取物，0.2g；琼脂，4g，100ml海水，121℃灭菌20min单独灭菌。(3)冷却至45-50℃混合，将(1)和(2)液混合倒平板。

对P-47-3菌株进行分类鉴定：

1)形态鉴定：菌株P-47-3在LB培养基上，40℃培养24h后，菌落直径大小为1-2mm,橙黄色，圆形，鼓起，边缘整齐(如图3所示)。兼性厌氧，产芽孢，革兰氏阳性菌，镜检结果显示，细胞形态为短杆状(0.5-1.0×2.0-3.0μm)(如图4所示)，运动。

2)表型特征鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》，菌株P-47-3生长盐度范围为0％-14％(w/v)(最适2-5％)，生长pH范围为5-8.5(最适7.0-8.0)，生长温度范围为10℃-65℃。触酶阳性，氧化酶阴性。精氨酸双水解酶,赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶为阳性，β-半乳糖苷酶，柠檬酸盐利用实验，产硫化氢实验，脲酶，吲哚试验，VP实验结果均为阴性。不能利用甘露醇，肌醇，山梨醇，鼠李糖，蔗糖，蜜二糖，苦杏仁甙和阿拉伯糖发酵产酸。

3)化学特征鉴定：菌株P-47-3细胞脂肪酸的主要成分包括：iso-C_13:0(26.7％)，anteiso-C_13:0(19.5％)，iso-C₁₅₀(17.9％)，anteiso-C_13:0(2.3％)，C_16:0(6.1％)，iso-C_16:0(3.4％)，iso-C_17:0(14.4％)。醌的主要成分是甲基醌MK-7和MK-6。主要的极性脂包括Diphosphatidylglycerol(双磷脂酰甘油)，Phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)，Phosphatidylglycerol(磷脂酰甘油酯)和Phospholipid(磷酯)(如图5所示)。

4)16S rRNA基因分子鉴定

16S rRNA基因模板的制备：使用细菌DNA提取试剂盒(天根，货号DP302-02)。在使用试剂盒提取以前，对菌体进行溶菌酶破壁处理，具体做法如下：取细菌培养液1-5ml，1000rpm离心1min，菌体沉淀中加入180μL缓冲液(20mMTris，pH 8.0；2mM Na₂-EDTA；1.2％Triton；终浓度为20mg/mL的溶菌酶，37℃处理30min以上。其余步骤按照该试剂盒说明进行，最终得到P-47-3菌体的DNA样品。

PCR扩增：PCR扩增所用引物为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR反应体系60μL：2×Taq Mix30μL，引物：27F，1492R各3μL，模板3μL，无菌水补足至60μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，45s；57℃，1min30 s；72℃，1min 30s，30个循环；72℃，10min。将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序，确定其序列为SEQ ID NO:1；其16S rRNA基因序列比对后，P-47-3与深海微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)最接近。深海微小杆菌P-47-3通过16S rDNA基因序列比对分析与其最相近的种属是Exiguobacterium属的Exiguobacteriumprofundum，同源性为99.9％，因此该菌最终被命名为深海微小杆菌P-47-3。

其中深海微小杆菌P-47-3的16S rDNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

最终筛选的产高温蛋白酶的深海微小杆菌P-47-3株，保藏号为CGMCC No.18990，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年11月21日，分类命名：深海微小杆菌Exiguobacterium profundum。

菌种的保藏。长期保存：菌液加入到含甘油终浓度为20％的甘油管里，放入-80℃冰箱保存备用；短期保存：划线到MA 2216E培养基(Difco，货号：212185)或LB斜面上，在4℃保存。

实施例2：深海微小杆菌P-47-3产蛋白酶的性质

采用福林酚法测蛋白酶活性，其中Folin-酚试剂购自索莱宝，货号F8060。

步骤1：制作标准曲线

取14支试管分成两组，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL标准蛋白质溶液(250μg/mL)，用水补足到1mL，加入5mL试剂甲，混匀，于20-25℃放置10分钟，再加入0.5mL试剂乙，立即摇匀，在20-25℃保温30分钟，然后于500nm处比色。测定光密度值，取两组测定的平均值(表1)，以蛋白质浓度为横座标，光密度值为纵座标，绘制标准曲线值(图6)。

表1：酪蛋白标准曲线数据表

步骤2：将深海微小杆菌P-47-3接种于100mL LB培养基，55℃培养24h。吸取菌液12000r/min离心5min。取1mL上清液，作为蛋白酶的粗酶液，加入1mL预先于55℃预热的2％的酪蛋白溶液，55℃水浴反应20min。然后加入2mL 0.4mol/L三氯乙酸溶液终止反应。取反应液12000r/min离心5min，取离心后的滤液上清1mL，加入5mL试剂甲混匀，待充分摇匀，40℃放置10分钟，再加0.5mL试剂乙摇匀，40℃放置10分钟。分光光度计比色波长为500nm，测其吸光度。对照组为先加入三氯乙酸溶液再加酪蛋白，其余条件相同。蛋白酶活的定义为每分钟水解酪素释放1μg酪氨酸为一个酶活单位(U)。

步骤3：深海微小杆菌P-47-3产蛋白酶的最适反应温度。从图7可看出，40℃-60℃随温度的升高，蛋白酶酶活逐渐增强，温度为65℃时，酶促反应的产物吸光度最高，超过65℃酶活迅速下降，故酶活最适温度为65℃。

步骤4：深海微小杆菌P-47-3产蛋白酶的最适反应pH。从图8可看出，当pH<8时，pH越大，吸光度值越大，pH＝8时酶促反应产物吸光度最高，当pH>8后酶活迅速下降，酶活的最适pH为8。

实施例3：利用深海微小杆菌P-47-3发酵生产发酵鱼浆

步骤1：制备深海微小杆菌P-47-3的细胞液体培养物：取-80℃保存的菌种在LB固体培养基划线，在40℃培养，挑取单菌落接种于装有25mL LB培养基的100mL三角瓶中，培养温度为40℃，置摇床上以150r/min的转速培养20-24h至对数生长中期，即得到深海微小杆菌P-47-3的细胞液体培养物；

步骤2：摇瓶发酵培养：接种量为2-5％(v/v)，接种于装有200mL LB培养基的500mL三角瓶中，培养温度为40℃，在摇床上以150r/min的转速下培养20-24h，得到发酵液。

步骤3：继续摇瓶发酵培养：接种量为2-5％(v/v)，接种于1000mL LB液体培养基(装于2000mL三角瓶)中，培养温度为40℃，在摇床上以150r/min的转速下培养48h，得到发酵液。

步骤4：以50公斤新鲜的鳀鱼为原料，用绞肉机绞碎成糜，加入食品级红糖1.8公斤，食品级磷酸二氢钾0.12公斤，食品级硫酸镁0.6公斤，并调整pH为8.0，搅拌均匀，加入到发酵罐中。

步骤5：发酵罐中加入10升发酵液，在温度为55℃，无菌空气通入量为1.5vvm，转速为200rpm，发酵时间为36-40个小时；

步骤6：高速离心，将骨刺等不溶物沉淀，上清液再经过70℃低温真空浓缩，4个小时，至水分含量为45％左右，得到发酵鱼浆产品，检测其理化指标和新鲜度指标(表2)。

表2：发酵鱼浆的成分分析表

实施例4：发酵鱼浆效果验证实验

为了验证发酵鱼浆的应用效果，在公司合作的养殖基地进行试验。

在黄颡鱼日粮配方中，以30％国产特级鱼粉为对照(FM)，按照FM组中鱼粉蛋白质量25％、45％、65％三个梯度，添加发酵鱼浆(HSW25、HSW45、HSW65)完全替代鱼粉，共设计4组等氮等磷试验日粮，每组设立3个重复，在池塘网箱中养殖初始体重为(18.74±0.08)g黄颡鱼，先用对照组日粮驯化两周后再进行8周养殖实验，实验结束后禁食24h，称重计数并解刨称取内脏团和肝胰脏重量。实验饲料的配方组成及营养水平见下表3。

表3：四组试验组的配方与营养水平(干物质基础)表

对四个实验组的黄颡鱼生长情况、成活率、增重率、饲料系数进行测量并计算，结果如表4所示。

表4：四个实验组的黄颡鱼生长情况、成活率、饲料系数结果表

从表4可以看出：用特定生长率表示黄颡鱼的生长速度，HSW组中HSW25、HSW45与FM组相比特定生长率较低，但没有显著差异，HSW65组的特定生长率显著下降；用饲料系数表示黄颡鱼对饲料的利用效率，各试验组中FCR均无显著性差异，但各试验日粮的利用效率仍存在一定差距。HSW25、HSW45、HSW65与FM组相比饲料系数分别增加了1.5％、5.5％、29.9％；HSW组的成活率比对照组高0.08～0.11；HSW组的肝脏指标与对照组相比，没有显著差异。试验结果表明在黄颡鱼日粮中添加8.5％发酵鱼浆可完全替代国产特级鱼粉促进鱼体生长，降低饲料系数。

序列表

<110> 浙江亿丰海洋生物制品有限公司

<120> 一种嗜热深海微小杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 深海微小杆菌(Exiguobacterium)

<400> 1

ccttcggggg gccgacggtg gaatgagcgg cggacgggtg aataacacgt aaagaacctg 60

cccataggtc tgggataacc acgtgaaatc ggggctaata ccggatgtgt catcggaccg 120

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gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gcctattaag tctgatgtga 540

aagcccccgg ctcgaccggg gagggccatt ggaaactggg aggcttgagt ataggagaga 600

agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg 660

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cccttcgggg gcaggggtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020

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actctaggga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggttg ggatgacgtc aaatcatcat 1140

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gcgaggtgga gccaatccca gaaagccgtt ctctgttcgg attgcaggct gcaactcgcc 1260

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ggtcttgcac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgca acacccgaag taggtgaggt 1380

aaccgtaagg agccag 1396

Claims (4)

1.一株深海微小杆菌，其特征在于，所述的深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）的保藏编号为CGMCC No. 18990。

2.权利要求1所述的深海微小杆菌在发酵鱼浆中的应用。

3.一种制备发酵鱼浆的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的深海微小杆菌来发酵鱼糜。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：

1）制备鳀鱼鱼浆：以新鲜的鳀鱼为原料，用绞肉机绞碎成糜；

2）制备产品A：添加碳源和无机盐辅料到鱼糜中，得到产品A；

并制备种子液：将所述的深海微小杆菌接种至液体培养基，温度为40℃，培养24小时；

并制备发酵液：将所述的种子液，按10% 接种量，接种至液体培养基，温度为40℃，培养48-72小时；

3）制备产品 B：将发酵液加入到产品A中得到产品B，其中发酵液与产品A的质量比为20-30：100，并调整pH，最终的料水质量比1:0.2-0.3，搅拌混合均匀后加入发酵罐；

4）制备产品C在温度为55-57℃，对产品B 进行发酵，时间为36-40个小时，得到产品C；

5）制备发酵鱼浆：产品C经过高速离心，将骨刺不溶物沉淀，上清液再经过70℃低温真空浓缩，4个小时，至水分含量为45%，得到发酵鱼浆；

所述的碳源和无机盐辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计分别为：食品级红糖1-5%，食品级磷酸二氢钾1-2%，食品级硫酸镁1%；

液体培养基的pH为7.0-7.2，并按照以下质量比配比：酵母提取物5份，胰蛋白胨 10份，氯化钠10份，蒸馏水1 000份。

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