CN114181874B

CN114181874B - 一株深海微小杆菌及其在增强水产调味品风味中的应用

Info

Publication number: CN114181874B
Application number: CN202210142792.0A
Authority: CN
Inventors: 刘唤明; 罗美燕; 洪鹏志; 蒋嘉惠; 赖崇熙; 黄雅萍; 唐金燕; 周春霞; 邓楚津
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114181874A

Abstract

本发明属于生物及水产品加工的技术领域，具体涉及一株深海微小杆菌及其在增强水产调味品风味中的应用，所述的深海微小杆菌的保藏编号为：GDMCC NO：61793。该菌株能产脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，并可显著增强水产调味品中酮类、醇类和酯类等风味物质的含量。该菌增强水产调味品风味的应用方式为：将深海微小杆菌FELA1接种于水产调味品成品中，于25℃～40℃发酵1～3天；或者在传统发酵水产品调味品发酵开始时接入深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1。

Description

一株深海微小杆菌及其在增强水产调味品风味中的应用

技术领域

本发明属于生物及水产品加工的技术领域，具体涉及一株深海微小杆菌（Exiguobacteriumprofundum）及其在增强水产调味品风味中的应用。

背景技术

传统发酵水产品营养丰富，风味独特，是原料和环境中多种微生物共同作用的结果，其中一些风味微生物对发酵水产品风味的形成发挥了至关重要的作用。近年来，研究人员发现从传统发酵水产品中分离出的风味微生物能进一步增强发酵水产品的风味。陈蕾蕾等从传统沙蟹汁中分离出了马胃葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、腐生葡萄球菌、解淀粉盐水球菌，并加入沙蟹汁发酵增强了沙蟹汁的风味。NatteewanUdomsil等在鱼露中加入发酵鱼露来源的嗜盐四链球菌以提高其风味和谷氨酸含量；Anh Do Quynh Nguyen等在鱼露的发酵环境中分离出耐盐海球菌，并加入鱼露中发酵，以提高盐鱼露的风味和质量。因此，开发新型风味微生物对增强水产调味品的风味发挥着重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株深海微小杆菌（Exiguobacteriumprofundum），所述的深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）的保藏编号为：GDMCC NO：61793。

本发明另一个目的在于提供了一株深海微小杆菌在增强水产调味品风味中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人自虾酱中筛选出一株可增强水产调味品风味的细菌，通过生物形态和分子鉴定，该菌株鉴定为深海微小杆菌，该菌株已于2021年7月9日送至广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为：GDMCC NO：61793，分类命名：Exiguobacterium profundum FELA1，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

菌株Exiguobacterium profundum FELA1在氯化钠含量为4%的营养琼脂培养基中，于25℃培养72小时的菌落形态如图1所示，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，淡黄色，奶油状，细胞形态呈短杆状，分散均匀，无粘连，无鞭毛。

深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1在增强水产调味品风味中的应用，包括将深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1接种于水产调味品成品中，于25℃～40℃发酵1～3天；或在传统发酵水产品调味品发酵开始时接入深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1。

所述的水产调味品成品包括水产蛋白酶解液，或已完成发酵的鱼露、虾酱和/或沙蟹汁等传统发酵水产调味品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次从传统发酵的虾酱中筛选出一株可用于水产调味品增强风味的深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum），能产脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，可显著增强水产调味品中酮类、醇类和酯类等风味物质的含量，并且实验进一步证实，风味物质的增加与其蛋白酶的功能无关。

附图说明

图1为菌株FELA1的菌落形态与个体形态图。

图2为菌株FELA1的系统发育树。

图3为温度和盐度对菌株FELA1生长的影响。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1的分离与鉴定：

本发明的深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1自虾酱中筛选分离，菌株FELA1的菌落形态和个体形态如图1所示，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，淡黄色，奶油状，细胞形态呈短杆状，分散均匀，无粘连，无鞭毛。

菌株FELA1的鉴定：采用16S rDNA测序方法，引物为细菌通用引物27F和1492R，PCR扩增体系：2×MightyAmp Buffer 30 μL，MightyAmp DNA Polymerase 1.5μL，引物27F和1492R 各1.5 μL，ddH2O 25.5μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55℃复性15 s，68℃延伸90 s，40个循环；72℃延伸10 min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格的送至生工生物工程股份有限公司测序，测序结果提交至EZBiocloud中进行同源性检索，选择相似性高的模式菌株的16S rDNA序列进行比对分析。菌株FELA1与标准菌株Exiguobacterium profundum 10C的相似性最高，高达99.93%。选取序列相似似度达 99%的部分菌种，采用软件Mega7.0，Neighbor-Joining法制作系统发育树，菌株 FELA1与Exiguobacterium profundum在系统发育树上属于同一支系，鉴定菌株FELA1为深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）。该菌株已于2021年7月9日送至广东省微生物菌种保藏中心保藏，分类命名：Exiguobacterium profundum FELA1，保藏编号为：GDMCC NO：61793，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2：温度和盐度对深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1生长的影响

1）取一环菌株FELA1纯培养物至100 mL营养肉汤中，37℃振荡培养24 h后，接种10uL至1 mL新鲜培养基中，混匀后取200 μL至96孔板中，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃培养14 h，每间隔1 h测定其OD_600nm值，每个样品重复六次试验。结果如图3A，由图3中A结果可知，菌株FELA1在20 ℃~40 ℃范围之内菌株均能生长，且随着温度升高，生长速度呈增加趋势；当温度为20 ℃~25 ℃时，菌株FELA1生长速度几乎保持一致，但在25 ℃的环境下，生长量略高；当温度达到30 ℃，生长速度明显加快；在40℃时生长最快，仅2 h进入对数期，5 h后进入稳定期，但随着温度升高其生长量逐渐减少。菌株FELA1最佳生长温度为25℃。

2）取一环菌株FELA1纯培养物至100 mL营养肉汤中，37℃振荡培养24 h后，接种10uL至1 mL不同含盐量（0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%）新鲜营养肉汤培养基中，混匀后取200 μL至96孔板中，37 ℃培养24 h，测定其OD_600nm值，每个实验重复三次。结果如图3B，有图3中B结果可知，菌株FELA1在营养肉汤不添加NaCl时生长最好；加盐后生长量明显降低；当盐含量大于12%，菌株FELA1几乎不能生长。

实施例3：深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1产酶特性的研究

1）产蛋白酶能力：4%素琼脂中按1：1比例加入10%脱脂牛奶，混合后制成平板，挑取单菌落至平板上，37 ℃培养48 h，观察产水解透明圈情况，水解圈越大，产蛋白酶能力越强。

2）产脂肪酶能力：营养琼脂培养基中加入1%甘油三丁酸酯和0.05%罗丹明B（121℃灭菌30 min），挑取单菌落至平板上，37 ℃培养24 h，观察产水解透明圈情况。

3）产淀粉酶能力：0.2%可溶性淀粉在冷水中调成糊状，加入1%蛋白胨，0.5%氯化钠，0.5%牛肉膏，2%琼脂粉（121℃灭菌20 min），挑取单菌落至平板上，37 ℃培养24 h后滴加卢戈氏碘液，观察透明圈产生情况。

通过观察水解圈或透明圈结果可知，菌株FELA1有较强的产酶能力，能产生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。

实施例4：深海微小杆菌FELA1发酵液的毒理学评价实验

1）发酵液的制备：将深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1接种到营养肉汤中，37℃、150r/min恒温振荡培养24h，得到深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1的发酵液，其浓度为10⁸CFU/mL，发酵液直接饲喂小鼠。

2）急性毒性试验。取健康的小鼠40 只（雌雄各半），按照随机分组原则分为2 组，每组20 只，雌雄各半。实验组按0.4mL/20g（以体质量计），分两次（间隔4h）将深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1的发酵液经口灌胃小白鼠；空白对照组给予相同剂量无菌营养肉汤培养液。实验前禁食过夜，禁食期间正常给水。灌胃2h 后恢复正常饮食。实验期限为15d。每天观察记录小白鼠饮水、进食、活动及死亡情况。在实验期间各实验组小白鼠饮食和活动正常，生长发育良好，体质量增加，未见有任何明显的中毒表现，也无死亡。小白鼠喂养1 5 d 后解剖，肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾、肠等脏器，与空白对照组相比，皆未发现病变和差异。这表明菌株发酵液的饲喂剂量达20.0g/kg 体质量时不会引起小白鼠的死亡。按急性毒性剂量评价分级标准属无毒级物质。

3）30d 喂养实验。按照GB 15193.13 -2003《30 天和90 天喂养试验》方法进行30天的喂养实验。取健康小鼠80 只（雌雄各半），按照随机分组原则分为4 组，深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1发酵液各设为2.5、5.0、10.0g/kg（以体质量计）3 个剂量组，并设蒸馏水为空白对照组。30天喂养结束后，测定血液中红细胞、白细胞、血小板以及血红蛋白数，结果表明各饲喂剂量组的小鼠血液的红细胞、白细胞、血小板以及血红蛋白数结果与空白对照组之间无显著差异；测定各组小鼠血液中血清白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、胆固醇、肌酐、血糖、甘油三酯和总蛋白的含量等血液生化学指标，结果表明，各剂量组中小鼠血液各生化指标与对照组之间无明显差异；并对小鼠进行解剖，肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾、肠等脏器，结果显示，各饲喂剂量组的小白鼠各脏器颜色、形状、大小等均未见病变。以上结果表明，各实验组小白鼠脏体、血液指标和生化指标与空白对照组之间无显著差异，可初步判定该菌株是安全无毒的。

实施例5：深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1在虾头酶解液中发酵增强风味的应用

1）虾头酶解液制备经清洗晾干的虾头搅碎，按料液比1：0.6，加入烧杯中，搅拌均匀，PH调至7.5，木瓜蛋白酶添加量为775U/g，保鲜膜封口于42℃水浴锅中保温3h，每间隔一段时间进行搅拌，酶解结束后，100℃灭酶10 min后备用。

2）虾头酶解液的发酵将菌株FELA1接种到营养肉汤中，37℃恒温振荡培养24h，吸取1 mL菌液再次接种新的营养肉汤，37℃恒温振荡培养24h后，得到初始菌液，8000r/min离心10 min收集菌体，并用无菌水清洗2次，虾头酶解液溶解。并将收集的菌体加入到虾头酶解液中，使得深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1终浓度为10⁵CFU/mL，以不接菌的酶解液为空白对照(CK)，30℃恒温培养2天。

3）HS-SPME-GC-MS分析发酵液的挥发性风味成分

准确吸取5 mL样品于20mL顶空瓶中，加入1μL内标物2-甲基-3-庚酮（0.8160g/mL），磁力搅拌60℃水浴平衡10 min，相同条件下萃取30min，后将萃取头插入气质联用仪进样口解析5 min。

气相色谱条件：色谱柱为InertCap Pure-WAX；载气为氦气，流速为1.0mL/min，进样口温度250℃，不分流进样；升温程序：起始柱温40℃，保持1 min，以3℃/min的速率升至100℃，保持5min，以5℃/min的速率升至230℃，保持10min。

质谱条件：离子源EI，离子源温度230℃，接口温度250℃，电子能量70 eV，质量扫描范围30~480 m/z，无溶剂切除时间。

4）数据处理

挥发性风味物质定性和定量分析：利用NIST17数据库进行比对，当化合物相似大于80予以报道，根据化合物峰面积与内标物2-甲基-3-庚酮的峰面积之比计算各化合物的含量（内标法），每次试验重复三次，结果以平均值表示。计算公式：

数据采用MicrosoftExcel 2019，Origin2019b处理，结果用平均值（

）表示，并绘制曲线图。

酶解液发酵后鉴定出的挥发性风味物质的结果如表1和表2所示，不添加菌发酵的虾头酶解液共鉴定出108种挥发性物质，添加FELA1菌株发酵的酶解液分别鉴定出108种挥发性物质，添加菌株发酵酶解液，检测出的挥发性风味物质的种类数量变化不大，但种类差异较大，发酵酶解液中，酮类、醇类为主要的挥发性物质，不添加菌株发酵的酶解液的酯类较少，胺类类物质比添加菌株发酵的酶解液多。从挥发性物质的含量分析，不添加菌株发酵的虾头酶解液的挥发性物质总含量为203.197 ng/mL，添加FELA1菌株发酵酶解液挥发性风味物质的含量为599.214 ng/mL，添加菌株的发酵酶解液显著增加了挥发性风味物质含量，特别是显著增加了酮类、醇类和酯类这几种风味物质的含量。发酵后，虾头酶解液的氨基态氮含量并没有增加，表明深海微小杆菌增加虾头酶解液的风味与其产蛋白酶的特性并无关系。

表1 虾头酶解液中挥发性成分种类与含量统计表

注：FELA1为添加菌株FELA1的虾头酶解液；CK为未加菌发酵的虾头酶解液。

表2 虾头酶解液中挥发性成分明细表

实施例6：深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）FELA1在虾头酱中发酵增强风味的应用

1）将菌株FELA1接种到营养肉汤中，37℃恒温振荡培养24h，吸取1 mL菌液再次接种新的营养肉汤，37℃恒温振荡培养24h后，得到初始菌液，8000r/min离心10 min收集菌体，并用无菌水清洗2次后待用。

2）虾头清洗晾干后加入30%食盐搅碎，混匀，并将1）中收集的菌体加入到虾头酱中，使其浓度为10⁵ CFU/g，以不接菌的虾头酱为空白对照(CK)，30℃恒温培养16天，每天早晚各搅拌一次。

3）HS-SPME-GC-MS分析发酵液的挥发性风味成分

准确吸取5 g样品于20mL顶空瓶中，加入1μL内标物2-甲基-3-庚酮（0.8160g/mL），磁力搅拌60℃水浴平衡10 min，相同条件下萃取30min，后将萃取头插入气质联用仪进样口解析5 min。

4）数据处理

数据采用MicrosoftExcel 2019处理，结果用平均值（

）表示。

虾头酱发酵后鉴定出的挥发性风味物质的结果如表3和表4所示，不添加菌发酵的虾头酱共鉴定出80种挥发性物质，添加FELA1菌株发酵的虾头酱鉴定出98种挥发性物质，添加菌株发酵虾头酱，检测出的挥发性风味物质的种类数量整体增加，但种类差异较大，添加菌发酵虾头酱中，烷烃类、酮类、醛类为主要的挥发性物质，除醇类物质外，其余物质的数量均比空白不添加菌株发酵的虾头酱多。从挥发性物质的含量分析，不添加菌株发酵的虾头酱的挥发性物质总含量为212.724 ng/mL，添加FELA1菌株发酵虾头酱挥发性风味物质的含量为505.495ng/mL，添加菌株发酵虾头酱显著增加了挥发性风味物质含量，特别是显著增加了酮类、醇类和酯类这几种风味物质的含量。发酵后，虾头酱的氨基态氮含量并没有增加（加菌发酵的虾头酱氨基态氮含量为0.62g/100g，未加菌发酵的虾酱的氨基态氮含量为0.67 g/100g），表明深海微小杆菌增加虾头酱的风味与其产蛋白酶的特性并无关系。

表3虾头酱中挥发性成分种类与含量统计表

注：FELA1为添加菌株FELA1的虾头酱；CK为未加菌发酵的虾头酱。

表4虾头酱中挥发性成分明细表

Claims

1.一株深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum），所述的深海微小杆菌的保藏编号为：GDMCC NO：61793。

2.权利要求1所述的深海微小杆菌在增强水产调味品风味中的应用。

3.权利要求1所述的深海微小杆菌在增强水产调味品风味中的应用，其特征在于，应用过程包括将权利要求1所述的深海微小杆菌接种于水产调味品成品中，于25℃～40℃发酵1～3天；或在水产调味品发酵开始时接入权利要求1所述的深海微小杆菌。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的水产调味品为水产蛋白酶解液或者已完成发酵的鱼露、虾酱和/或沙蟹汁。