JP4434927B2

JP4434927B2 - γ−アミノ酪酸含有食品の製造方法、及びγ−アミノ酪酸高生成能を有する酵母

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Publication number: JP4434927B2
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Inventors: 暁風郭; 俊彦萩原
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Filing date: 2004-11-17
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Description

本発明は、γ−アミノ酪酸含有食品の製造方法、及びそれに使用されるγ−アミノ酪酸高生成能を有する酵母に関する。

γ−アミノ酪酸（γ-aminobutyric acid、本明細書中でＧＡＢＡと略記することがある）は自然界に広く分布している非タンパク質組成アミノ酸の１種である。食品の成分として、微量ながら各種の穀類、野菜、果物、キノコに含有されている。動物の脳や脊髄にも存在し、哺乳類の中枢神経系の代表的な抑制系の神経伝達物質として知られている。

γ−アミノ酪酸の生理機能として、上記の神経伝達物質としての機能をはじめ、血圧降下作用、神経安定作用、腎機能活性化作用、肝機能改善作用、肥満防止作用、アルコール代謝促進作用など多岐に亘る機能が知られている。そして、脳の血流を改善し酸素供給量を増加させ脳代謝を亢進させる働きをもつことから、実際に医薬品として、脳卒中後遺症の改善、脳動脈硬化による頭痛、耳鳴り、意欲低下などの治療にも応用されている。

従って、日常の食生活からγ−アミノ酪酸を充分に摂取できれば、人々の健康維持や各種疾病の予防に役に立つことが期待されるため、各種物理的又は化学的な処理を施して食品中のγ−アミノ酪酸含量を高める様々な方法が開発され、報告されている。例えば、茶葉を窒素ガス中に嫌気処理して得られた「ギャバロン茶」（特開昭63-103285 号公報）、米胚芽や胚芽を含む米糠を水に浸漬処理して得られたＧＡＢＡ富化素材「オリザギャバ」（特許第2810993 号）、玄米を発芽させて得られたＧＡＢＡ含有「発芽玄米」（特開平11-24694 号公報）、アガリクス酵素の分解による得られたＧＡＢＡ高含有「発酵アガリクスエキス」などが知られている。

一方、乳酸菌や酵母、麹菌など天然微生物の発酵反応機能や酵素分解機能を利用することによって、γ−アミノ酪酸を高含有食品素材の製造方法も数多く研究され、報告されている。例えば、乳酸菌による方法（特許文献１〜８）、酵母による方法（特許文献９）、麹菌による方法（特許文献１０及び１１）などが知られている。

しかしながら、以上の物理的又は化学的な処理によって得られた食品中のγ−アミノ酪酸含量は市場の要求を満足するレベルのものとは言い難い。そして、これらの処理品自身が最終的に消費される食品形態であるため、機能性素材として他の食品に添加できる範囲が限られ、汎用性に欠ける。また、乳酸菌による発酵反応によって多量のγ−アミノ酪酸を生成する方法では、γ−アミノ酪酸は乳酸菌の持つグルタミン酸デカルボキシラーゼによる単純な酵素反応の産物として生成されるため、γ−アミノ酪酸以外の機能性成分はあまり得られず、より総合的な機能性作用の発揮が期待できない。また、酵母、麹菌などの微生物処理によりγ−アミノ酪酸を生成する方法では、例えば、酵母を予めアセトン処理して乾燥させたものでなければ、望ましいγ−アミノ酪酸の生成効果は得られないため、処理工程が複雑となり、工場での大量生産に適さずコスト増につながる。そして、アセトン処理した酵母を使用した場合であっても、酵母（乾燥物基準）を反応液総量に対して30〜40％程度以上の高濃度で添加しなければ、γ−アミノ酪酸を多量に生成することはできないため、これらの方法は実用性のない方法だと言わざるを得ない。

特開平６−４５１４１号公報特開平１０−２９５３９４号公報特開２０００−３０８４５７号公報特開２０００−２１００７５号公報特開２００１−１２０１７９号公報特開２００３−１８０３８９号公報特開２００３−７０４６２号公報特許第２７０４４９３号公報特開平９−２３８６５０号公報特開平１０−１６５１９１号公報特開平１１−１０３８２５号公報

本発明は微生物を用いてγ−アミノ酪酸を簡便かつ大量に生成する手段を提供することを目的とする。

（１）糖類若しくは糖代謝中間体、又は、糖類若しくは糖代謝中間体及びグルタミン酸若しくはその塩に、糖類又は糖代謝中間体の存在下において発酵反応によりγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する酵母又はその処理物を作用させることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有食品の製造方法。

（２）前記酵母がピキア属又はカンジダ属に属する酵母であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）前記酵母がピキア・アノマラＭＲ−１（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０１３４）又はそのγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する変異株である（１）又は（２）に記載の方法。

（４）糖類若しくは糖代謝中間体、又は、糖類若しくは糖代謝中間体及びグルタミン酸若しくはその塩を含有する、動物、植物若しくは微生物の可利用部分、動物、植物若しくは微生物から抽出されたエキス、又は前記可利用部分若しくはエキスを原料とする食品材料に前記酵母又はその処理物を作用させることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。

（５）γ−アミノ酪酸生成反応が初発ｐＨ３．０〜６．０且つ温度３２〜５５℃の条件において行われることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）γ−アミノ酪酸を含有する反応液を更に分離、精製、濃縮又は乾燥することによりγ−アミノ酪酸の濃度を高める工程を含む（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により製造されたγ−アミノ酪酸含有食品。

（８）２００ml容の三角フラスコ中のグルコース５重量％及びグルタミン酸１重量％を含む水溶液５０ｍｌに、水分７８．８重量％の生菌体を１．０ｇ添加し、４５℃において２４時間振とうした後、８５℃において１５分間加熱失活させ、遠心分離し、上清を濃縮して容量を２５ｍｌに定容して得られる溶液中のγ−アミノ酪酸濃度を測定した場合に、該濃度が１５０ｍｇ／１００ｍｌ以上となる量のγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する、ピキア・アノマラに属する酵母。

（９）ピキア・アノマラＭＲ−１（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０１３４）又はそのγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する変異株である酵母。
（１０）ピキア属に属する酵母を含有する食品。

本発明によりγ−アミノ酪酸を簡便かつ大量に生成することができる。本発明の酵母はγ−アミノ酪酸を発酵反応により生成することから、本発明の酵母を用いて製造されたγ−アミノ酪酸含有食品は、γ−アミノ酪酸だけでなく他の有用な発酵産物を含有する。

以下、本発明をより詳細に説明する。なお本明細書において「％」とは特に断りのない限り「重量％」を意味する。

本発明者らは、機能性成分であるγ−アミノ酪酸のより幅広い食品への利用を可能にするため、微生物によるγ−アミノ酪酸を簡単かつ大量に生成する方法について検討を行った。特に、生菌体のままで特別な処理を施すことなくγ−アミノ酪酸を生成することができる微生物の探索を目的として鋭意研究を重ねた結果、海洋に生息している微生物の一種であり、糖類又は糖代謝中間体の存在下において生菌体内反応によって、高いγ−アミノ酪酸生成能を有する海洋酵母を発見した。この酵母を用いることにより、簡単な方法で短時間にγ−アミノ酪酸をはじめとした天然代謝産物を多量に生成できることが確認された。また、遺伝学的、生理生化学的同定試験を通じて、この酵母はピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａａｎｏｍａｌａ）に属する新規株であることが確認され、本発明者らによりＰｉｃｈｉａａｎｏｍａｌａＭＲ−１（ピキア・アノマラＭＲ−１）と命名され、平成１６年９月２８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０１３４）。

本発明のγ−アミノ酪酸またはそれを含有する食品の製造方法には、ピキア・アノマラＭＲ−１株に限らず、糖類又は糖代謝中間体の存在下において発酵反応によりγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する酵母が好適に使用される。このような能力を有する酵母としては例えばピキア属又はカンジダ属に属する酵母が挙げられる。より具体的には、ピキア・アノマラ（例えばピキア・アノマラＮＢＲＣ−１０２１３、ピキア・アノマラＮＢＲＣ−１００２６７）、ピキア・ジャジニ（Ｐｉｃｈｉａｊａｄｉｎｉｉ，ａｎａｍｏｒｐｈ：Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）（例えばピキア・ジャジニＮＢＲＣ−０９８７）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）（例えばカンジダ・ユチリスＮＢＲＣ−１０７０７）が挙げられるがこれには限定されない。上記の酵母はいずれも、酵母菌体自体の懸濁液として本発明の方法に使用することができる。上記の酵母は、適当な担体に担持させた、いわゆる固定化酵母の形態で使用することもできる。本明細書における酵母の「処理物」としては例えばこの固定化酵母が挙げられる。

ピキア・アノマラＭＲ−１株と同等又はそれ以上のγ−アミノ酪酸生成能を有する酵母は従来知られていない。このような酵母としては、例えば、２００ml容の三角フラスコ中のグルコース５重量％及びグルタミン酸１重量％を含む水溶液５０ｍｌに、水分７８．８重量％の生菌体を１．０ｇ添加し、４５℃において２４時間振とうした後、８５℃において１５分間加熱失活させ、遠心分離し、上清を濃縮して容量を２５ｍｌに定容して得られる溶液中のγ−アミノ酪酸濃度を測定した場合に、該濃度が１５０ｍｇ／１００ｍｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／１００ｍｌ、より好ましくは３００ｍｇ／１００ｍｌとなる量のγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する酵母が挙げられる。また、γ−アミノ酪酸を生成する能力を有する限り、ピキア・アノマラＭＲ−１の変異株もまた好適に使用される。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。

ピキア・アノマラＭＲ−１は、糖類又は糖代謝中間体の存在下においてＧＡＢＡを生成し、糖類又は糖代謝中間体が存在せずグルタミン酸が存在する条件下ではＧＡＢＡを少量しか生成できない。従来公知のＧＡＢＡ生成酵母は、グルタミン酸又はその塩が存在しない限りＧＡＢＡを生成できないという点で顕著に相違する。またピキア・アノマラＭＲ−１は驚くべき事に、糖類又は糖代謝中間体とグルタミン酸又はその塩とが共存する条件下においては相乗的に多量のＧＡＢＡを生成することが可能である。

ピキア・アノマラＭＲ−１によるＧＡＢＡ生成反応は以下の特徴を有する。（１）糖類又は糖代謝中間体さえ添加すれば、グルタミン酸がほとんど存在しない条件下でもＧＡＢＡの多量生成が認められる。（２）糖類又は糖代謝中間体の存在下でＧＡＢＡが多量に生成されるだけでなく、他の成分、例えば遊離のアラニン（本明細書では「Ａｌａ」と記載することがある）も生成される。（３）糖類又は糖代謝中間体が存在しない条件下で、グルタミン酸を追加してもＧＡＢＡの多量生成がほとんど認められない。（４）糖類又は糖代謝中間体の存在下でのＧＡＢＡ生成反応液中にエタノール成分が多量に検出される。（５）菌体を２日間以上凍結保管させてからＧＡＢＡの生成反応に使用した場合、ＧＡＢＡの生成量は同じ日数で冷蔵保管した菌体のそれより、約50％程度以上に大きく減少する。

ピキア・アノマラＭＲ−１によるＧＡＢＡ生成が、乳酸菌におけるＧＡＢＡ生成のように特定の酵素による単純な酵素反応に基づくものであると仮定すれば、細胞が死細胞であっても生細胞であっても関連する酵素が失活しない限りＧＡＢＡ生成量に大きな差異はないはずであるが、それでは上記（５）の現象は説明できない。従って、ピキア・アノマラＭＲ−１によるＧＡＢＡ生成は、菌体内における代謝機能が組み合わされて起こる一種の発酵によるものと推定される。このことは、上記（２）及び（４）に記載したように、Ａｌａやエタノールが同時に生成されることからも支持される。従って、本発明の方法によりＧＡＢＡを生成する場合、他の有用成分もまた同時に生成することができるものと期待される。また、ピキア・アノマラＭＲ−１によるＧＡＢＡ生成は、通常の酵母のようなアセトン処理などの予備的処理は不要であり、生菌体そのまま利用できるという点でも有利である。ピキア属又はカンジダ属酵母の生菌体によるＧＡＢＡ生成能は試験例９に示す通り他の酵母の５〜１５倍又はそれ以上であり、極めて高い。本発明に使用される他の酵母菌株、例えばピキア・アノマラＮＢＲＣ−１０２１３、ピキア・アノマラＮＢＲＣ−１００２６７、ピキア・ジャジニＮＢＲＣ−０９８７、カンジダ・ユチリスＮＢＲＣ−１０７０７によるＧＡＢＡ生成もまた同様に発酵反応によるものと推測される。

本発明においてＧＡＢＡ生成に利用し得る糖類としては例えば、単糖類、二糖類、糖アルコール類、オリゴ糖類などの糖類が挙げられる。単糖類としては、果糖、グルコース、キシロース、ソルボース、ガラクトースなどがある。二糖類としては、麦芽糖、乳糖、トレハロース、ショ糖、異性化乳糖、パラチノースなどがある。糖アルコール類としては、マルチトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、パラチニットなどがある。なかでも、グルコース、果糖、麦芽糖、ショ糖が好ましい。

本発明において糖代謝中間体とは、例えば、糖代謝経路である解糖系又はＴＣＡサイクルの各成分を指し、具体的には、例えば解糖系のグリコーゲン、各種リン酸化グルコース及びその分解物、ピルビン酸等、又はＴＣＡサイクルのクエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸等が挙げられる。安定性及び原料としての実用性などを考慮すれば、グリコーゲン、クエン酸、ピルビン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、リンゴ酸が好ましい。なお糖代謝中間体がＧＡＢＡ生成反応の基質となり得るということからも、本発明のＧＡＢＡ生成反応が発酵反応によるものであることがわかる。

またグルタミン酸は塩の形態、例えばグルタミン酸ナトリウム塩の形態であってよい。
糖類、糖代謝中間体及びグルタミン酸の添加量には特に制限はないが、例えば本発明の酵母（水分含量７８％）が反応系中に２重量％の濃度で存在する場合において、糖類として使用されるグルコースの濃度は１．０〜１０．０重量％が好ましい。例えばピキア・アノマラＭＲ−１が反応系中に２重量％の濃度で存在する場合において試験例１（グルタミン酸不存在）ではグルコースの添加量は１重量％以上であれば充分である。また、試験例２（グルタミン酸存在）ではグルコースの最適添加量は７．５重量％であった。このときＧＡＢＡ生成量はグルコース無添加の条件と比較してそれぞれ約８倍又は約１００倍以上増加した。また、グルタミン酸又はその塩は、例えば本発明の酵母（水分含量７８％）が反応系中に２重量％の濃度で存在する場合において、好ましくは約０．２５〜２．０重量％、より好ましくは０．５〜１．５重量％の濃度で添加される。

ＧＡＢＡ生成反応では、反応開始時の初発ｐＨは好ましくは３．０〜６．０、より好ましくは４．０〜５．０である。

反応温度は使用する基質毎に反応温度とＧＡＢＡ生成量との関係を調べることにより最適な範囲を容易に決定することができるのであるが、典型的には３２〜５５℃、好ましくは４０〜５０℃、より好ましくは４３〜４８℃の温度範囲が選択される。この温度範囲内でＧＡＢＡが多量に生成されることは、試験例４に示した通りである。本発明者はまた、ＧＡＢＡが多量に生成される上記温度条件下ではＭＲ−１株の細胞増殖がほとんど起こっていないことを確認した（試験例４を参照）。すなわち、ＭＲ−１株によるＧＡＢＡ生成反応は、細胞増殖が起こりにくい条件下で進行することに特徴があると言える。

菌体の添加量は通常、反応液重量の２〜１０重量％（水分含量７８％の菌体を使用した場合）の範囲内であればよいが、ＧＡＢＡの生成量と原料のコストを総合的に考えれば、２〜５重量％（同）の範囲内であることが好ましい。

反応時間についても反応温度と同様に、基質毎に反応時間とＧＡＢＡ生成量の関係を調べることにより最適な範囲を容易に決定することができるのであるが、典型的には１２〜７２時間であり、特に反応温度が３５〜４０℃の場合は約４８〜７２時間、反応温度が４０〜５０℃の場合は約１２〜４８時間であれば十分と考えられる。

例えば、ピキア・アノマラＭＲ−１株と糖類又は糖代謝中間体とグルタミン酸のみからなる反応系の場合は、４５℃において２４時間以内、３７℃において７２時間以内の反応時間が適当である。他に温度に弱い成分や、高温で変色しやすい成分が含まれている場合には、低温で長時間の反応が好ましい場合がある。

上述のＧＡＢＡ生成反応は例えばバッチ式、半連続式、連続式などいずれの様式で行ってもよい。

本発明における反応基質である糖類若しくは糖代謝中間体、又は、糖類若しくは糖代謝中間体及びグルタミン酸若しくはその塩は、これらの成分単独で、あるいは水等の適当な溶媒中の溶液（すなわち反応液）として提供される。

これらの反応基質は糖類若しくは糖代謝中間体、又は、糖類若しくは糖代謝中間体及びグルタミン酸若しくはその塩を含有する食品材料として提供されてもよい。このような食品材料としては、例えば動物、植物若しくは微生物の可利用部分、動物、植物若しくは微生物から抽出されたエキス、又は前記可利用部分若しくはエキスを原料とする食品材料等が挙げられる。本発明において「可利用部分」とは動物、植物若しくは微生物の食品として利用できる部分、又は該部分を適当に処理（例えば粉砕、加熱、焼成、フライ、乾燥、蒸煮）したものを意味する。

食品材料に糖類、糖代謝中間体、グルタミン酸又はその塩類が元々含有されていれば、特にこれら成分を追加する必要はなく、そのまま反応基質として本発明に使用することができる。例えば、市販の酵母エキスや、大豆・小麦などを原料として得られた各種発酵調味料には、糖類又は糖代謝中間体及びグルタミン酸が十分に含まれている場合が多い。また、昆布エキスや魚醤などのような天然調味料には原料由来のグルタミン酸が多く含まれているが、糖類又は糖代謝中間体がそれほど含まれていない場合がある。そのような場合はこれらの食品材料中の固形物含量及びグルタミン酸含量を考慮して、グルコースなどの糖類又は糖代謝中間体を適当量（例えばＭＲ−１酵母菌体（水分７８重量％）が５％添加された系に対して糖類が１〜５％）添加したものを、反応基質として本発明に使用することができる。また、食品材料にアミラーゼやプロテアーゼなどの食品用酵素を添加することにより、食品材料中の成分（主に澱粉やタンパク質など）を分解し、比較的分子量の小さい糖類又は糖代謝中間体やグルタミン酸含量を高めた食品材料も反応基質として本発明に使用することができる。

所定の酵母と所定の基質とを反応させて得られたγ−アミノ酪酸を含有する反応液は、そのまま各種の飲料や食物に添加するなどして用いてもよいが、さらに、通常の食品処理工程（濾過、濃縮、乾燥、粉末化など）によってγ−アミノ酪酸の含有量を高めてから利用することも可能である。また、これらの粉末品を打錠して錠剤としても利用することも可能である。なお、γ−アミノ酪酸の含有量を高めたもの（例えばイオン交換やクロマトグラフィー等の通常の分離手段により単離されたγ−アミノ酪酸）もまた、本発明により製造される「γ−アミノ酪酸含有食品」に包含される。

本発明により製造される食品中において、酵母は生細胞で含まれていても、死細胞として含まれていても、細胞破砕物として含まれていてもよく、また、酵母細胞及びその破砕物は食品中から除去されていてもよい。

本発明はまた、ピキア属に属する酵母（特にピキア・アノマラ）を含有する食品に関する。この場合もまた、酵母は生細胞で含まれていても、死細胞として含まれていても、細胞破砕物として含まれていてもよい。この場合、好ましくは、ピキア属に属する酵母は細胞中にγ−アミノ酪酸を含有する。本発明のこの態様は、ピキア属酵母の新規用途を提供する。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）
ピキア・アノマラＭＲ−１は、日本国八戸沖の海水から下記の手順により単離された海洋酵母の一種である。
［海水からの分離］
まず、青森海岸より約15 キロ離れた八戸沖の海上の船から無菌採水器を用いて、水深約５メートルにおける海水約５０リットルを採集した。これらの海水を冷蔵温度に保持しながら輸送し、翌日に孔径0.45μｍの滅菌メンブランフィルターを用いてこれらの海水を濾過した。フィルター上に残った微生物菌体を滅菌水15ｍｌに懸濁し、海水からの採取菌試料として次の実験に供した。

この採取菌試料（15ｍｌ）から200μl ずつを取り出して、耐塩酵母菌分離培養用の専用YPD 寒天培地（グルコース2％、ペプトン2％、酵母エキスパウダー1％、食塩3％、寒天2％、クロラムフェニコール0.01％）に塗布し、25℃において5 日間培養した。YPD 培地上に生じた酵母様コロニーから釣菌し、細胞の形態を光学顕微鏡を用いて1000 倍の倍率で観察し、酵母様微生物と思われる単一コロニーをそれぞれ選定した。次に白金耳を用いてこれらの各単一コロニーから再び釣菌し、それぞれ約1 ml の滅菌水に分散させた後、新しい別のYPD寒天培地上に再び画線塗布し、25℃においてさらに3〜5 日間培養した。なお、コロニーからの菌株を完全に単離するため、以上の釣菌〜分散〜培養操作を少なくとも5 回以上繰り返して行った。以上の分離培養によって50 リットルの海水から酵母様微生物を58 株分離した。

［分離菌の増殖培養］
最終的に単離された各コロニーから再び釣菌し、それぞれYPD 液体培地（グルコース2％、ペプトン2％、酵母エキスパウダー1％、食塩3％、KH₂PO₄0.05％、MgSO₄ 0.05％、（NH₄）₂SO₄ 0.1％）各200 ml に接種し、25℃において2〜3 日間振とう培養した。続いて培養液を無菌的な状態で遠心分離し、菌体を滅菌水で洗浄してから、再び遠心分離した。なお、菌体を充分に洗浄するために、この遠心〜洗浄操作は2〜3 回繰り返して行った。

［γ−アミノ酪酸生成能の比較］
5％グルコース及び1％グルタミン酸を含む反応液各25 mlにそれぞれ上記分離し洗浄された酵母様微生物菌体を各0.5ｇ添加し、窒素ガスで充填した後、37℃において3 日間反応させた。得られた反応液を85℃で15 分間加熱失活してから遠心分離し、上清液を各50 ml に定容して、遊離アミノ酸含量の分析に供した。分析結果より、58 株の菌株から若干のGABA 生成能を有する酵母様微生物は3株見出され、なかでも高いγ−アミノ酪酸生成能を有する菌株はそのうち1 株であった。このγ−アミノ酪酸高生成能を有する酵母様微生物をMR-1 と仮に命名した。

なお、GABA 成分をはじめとした遊離アミノ酸含量の分析には日本電子（株）製の全自動アミノ酸分析装置JLC-500/Vを使用した（以下同）。

［分子系統解析］
上記のγ−アミノ酪酸高生成能を有する酵母様微生物MR-1 の生菌体から、常法によってゲノムDNA 成分を抽出し、リボソームのITS‐5.8S領域のrDNA 配列を解析した（配列番号１参照）。

このITS‐5.8S rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号１）の相同性検査を、GenBankのデータベースにアクセスしBLASTプログラムにより行ったところ、Pichia anomala酵母（AY231611.1）と97.6％の相同性が確認された（図１参照）。

また実験データは示していないが、18S rDNAの塩基配列に基づく分子系統解析によっても、本菌株がPichia anomala酵母と高い相同性を示すことが明らかとなった。

またDNAデータベースにより入手したピキア属及び代表的な酵母種の塩基配列を多重整列後、ホモロジー検索を行ったところ、本菌株の分子系統樹上の位置はPichia anomala酵母と一致した。

［菌学・生理生化学的性質］
上記MR-1株の菌学的性質及び生理、生化学的性質を表１に示す。

表１に示した菌学的、生理生化学的性質に基づき、YEASTS：Characteristics and indentification (2000)を参考に分類・同定を行ったとこと、MR-1菌株はピキア・アノマラに属することが示された。

なお、MR-1株は公知のピキア・アノマラ株と完全には同一でない。例えば表２に示すとおり、MR-1株と公知のピキア・アノマラ株であるNBRC-100267とは、幾つかの生理生化学的性質が相違する。

また、MR-1株と公知のピキア・アノマラ株との増殖速度を各種塩濃度で比較したところ両者は相違した（図２）。よってMR-1株は新規な株であるといえる。

本酵母は、Pichia anomala MR-1 として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０１３４）。

（参考例２）
［保管菌株の復元］
凍結又は凍結乾燥で保管しているMR-1 菌株を室温で解凍した後、白金耳を用いて釣菌し、約1 ml の滅菌水に分散させてから、YPD 寒天培地上に画線接種し、25℃において5 日間培養した。培地上に乳白色の円形コロニーとしてMR-1 菌体を得ることができ、以下の前培養にそのまま使用することができる。なお、この寒天培地上の菌株は5〜10℃の温度で冷蔵保管すれば、２ヶ月以内であれば前培養などに使用することができる。

［前培養］
上記寒天培地上のコロニーから釣菌し、三角フラスコ中の滅菌した200 ml のYPD 液体培地に接種し、25℃において2〜3 日間振とう培養した。培養中に培養液1 ml を取り出して波長660 nm での菌体濁度を測定し、2.0 以上に達したものを次の本培養に使用した。

［本培養］
10 リットル容のジャーファーメンターに7 リットルの液体培地（グルコース2％、尿素2％、酵母エキスパウダー1.0％、食塩0.5％、KH₂PO₄0.05％、MgSO₄ 0.05％、硫酸アンモニア0.1％）を投入し、121℃で、60 分間加熱滅菌した。液体培地の温度を30℃まで冷却してから、希塩酸と希アルカリを用いて培養液のpH を5.0 に調整した。その後、上記前培養液200 ml を無菌的な状態で添加し、25℃において攪拌しながら2 日間通気培養した。培養液を遠心分離し、滅菌水で菌体を充分に洗浄した後、さらに遠心分離した。以上の遠心分離〜洗浄を2 回繰り返して行い、MR-1 菌体150ｇ（水分78.8％）を得た。これらの菌体を、以下の試験例及び実施例においてMR-1 酵母菌体として使用した。

（試験例１）
200 ml 容の三角フラスコ6 個にそれぞれ所定濃度のグルコース水溶液50 ml 及び上記参考例２で得られたMR-1 菌体1.0ｇ（2％濃度）を添加し、45℃において振とうしながら24時間反応させた。その後、85℃において15 分間加熱失活し、遠心分離した。それぞれの上清液を濃縮して25 ml に定容し、GABA をはじめとする遊離アミノ酸の分析に供した。なお、遊離アミノ酸の分析結果より、GABA とAla の濃度は他の遊離アミノ酸と比べてより高いことが明らかとなったので、表３にはこれらの2 種類アミノ酸の濃度を示した。また、グルタミン酸の濃度は僅かであったが、GABAの生成と重要な関わりがあるので、その濃度も併せて表３に示した。

以上の結果より、グルコースを添加しない場合は、GABA 及びAla の生成がほとんど認められなかったが、グルコースを添加すれば、GABA 及びAla の生成量が共に大きく増加したことがわかった。

（試験例２）
各反応液にグルタミン酸を1％濃度で追加した以外は試験例1 と同じ条件でGABA の生成反応を行い、濃縮液各25 ml を調製した。これらの濃縮液中のGABA 及びAla の濃度を表４に示す。また、発酵反応の指標としてエタノール濃度も測定した。

以上の結果より、グルコースを添加しない場合は、グルタミン酸を添加してもGABA 及びAla の生成があまり見られなかったのに対して、グルコースとグルタミン酸とが共に添加された系では、GABA 及びAla の生成量が試験例１と比較して著しく増加したことがわかった。

グルコースを添加しない場合に、グルタミン酸を添加してもＧＡＢＡ生成があまり認められなかった理由としては、糖類が存在しないために酵母による発酵反応が進行しなかったためであると考えられる。

（試験例３）
pH 3.0〜7.0 の各種クエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液（0.1 Ｍクエン酸‐0.2 Ｍリン酸水素二ナトリウム）に、上記参考例２で得られたMR-1 菌体2％、グルコース5％、グルタミン酸1％になるように添加し、50 ml に定容した後、試験例1 と同じ条件でGABA 生成反応を行い、濃縮液各25 ml を得た。これらの濃縮液中のGABA 濃度を表５に示す。

以上の結果より、pH 3.0〜6.0 の広い範囲内でGABA は多量に生成されることがわかった。また最適pH は約pH 5.0 付近であった。

（試験例４）
20ml 容のＬ字型試験管12 本にそれぞれ、上記参考例２で得られたMR-1 菌体2％、グルコース5％、グルタミン酸1％を含む反応液10 ml を添加し、20 rpm で振とうしながら15〜60℃の温度勾配で3 日間反応させた。その後、試験例1 と同じように分離、精製し、濃縮液各5 mlを調製した。これらの濃縮液中のGABA濃度を表６に示す。

以上の結果より、GABAは32〜55℃の温度範囲内で比較的多量に生成され、最適反応温度は44℃付近であることがわかった。なお、44℃においてのGABA 濃度は36℃のそれの約3 倍となることから、反応温度による影響が極めて大きいことが推測される。

本結果もまた次の理由によりMR-1によるGABA生成が発酵反応によるものであることを支持する。52.9℃におけるGABA生成量は、44℃におけるそれの約３割しかなく、また同様の条件下で行った別の実験（データは示していない）においても、50℃におけるGABA生成量は45℃におけるそれの約18％しかなかった。50℃条件下の酵素活性と、45℃における酵素活性との間にこれほど著しい相違があることは通常は稀であることから、GABA生成量の相違は、温度の上昇により生菌体の数が減少して発酵があまり行われなくなったことに起因していると考えられる。

発明者は更にまた、上記と同様の条件下で、15.0℃、19.8℃、23.5℃、26.9℃、30.3℃、33.5℃、36.5℃、40.7℃、44.3℃、48.2℃、53.1℃、60.0℃の各温度においてMR-1 菌体を培養し、培養液中の濁度（OD₆₆₀）を経時的に追跡することにより、反応温度と菌体増殖との関係を調査した。その結果、36.5℃以上の温度条件下では菌体の増殖はほとんど確認されなかった（図３）。

（試験例５）
上記参考例２で得られたMR-1 菌体2％及びグルコース5％を含む反応液50 ml にそれぞれ所定濃度のグルタミン酸を添加し、試験例1 と同じ条件でGABA 生成反応を行い、濃縮液各25 ml を調製した。これらの濃縮液中のGABA 濃度を表７に示す。

以上の結果より、グルタミン酸添加の適当濃度は約0.25〜2.0％の範囲内であり、より好ましくは0.5〜1.5％の範囲内であることが分った。またこの範囲を超えてグルタミン酸の濃度を高めると、逆にGABAの生成量が減少する傾向もみられた。

（試験例６）
グルコース5％及びグルタミン酸1％を含む反応液50 ml にそれぞれ所定濃度の上記参考例２で得られたMR-1 菌体を添加し、試験例1 と同じ条件でGABA生成反応を行い、濃縮液各25 mlを調製した。これらの濃縮液中のGABA 濃度を表８に示す。

以上の結果より、MR-1 菌体の最適添加濃度は約2〜5％程度であることが示された。またこの範囲を超えて菌体量を増加させても、GABA 生成量は増大しない傾向が示された。

（試験例７）
上記参考例２で得られたMR-1 菌体2％及びグルタミン酸1％を含む反応液各50 ml にそれぞれ所定の糖質を5％添加し、試験例1 と同じ条件でGABA 生成反応を行い、濃縮液各25 mlを調製した。これらの濃縮液中のGABA 濃度を表９に示す。

以上の結果より、添加した糖質の種類によってGABA の生成量が異なる傾向が示された。なかでも、グルコース、果糖のような単糖、及び麦芽糖、蔗糖のような二糖は、より高いGABA生成促進効果があり、特にグルコースと果糖は最も効果があることがわかった。

（試験例８）
グルコース5％及びグルタミン酸1％を含む反応液各50 ml にそれぞれ５℃で2 日間冷蔵保管したMR-1 菌体、又は−25℃で2 日間凍結保管したMR-1 菌体を所定濃度に添加し、試験例1 と同じ条件でGABA 生成反応を行い、濃縮液各25 ml を調製した。なお菌体は上記参考例２で得られたものである。これらの濃縮液中のGABA 濃度を表１０に示す。

以上の結果より、菌体の凍結保管によって、GABA 生成能が大きく減少したことがわかった。このことから、本発明においては酵母の生菌体を使用することが好ましいことがわかる。

（試験例９）
グルコース5％及びグルタミン酸1％を含む反応液各50 ml にそれぞれ本発明のMR-1 菌体（参考例２）、ピキア属又はカンジダ属に属する他の酵母（寄託機関より入手）、市販海洋酵母（イースト・Ｍ、三共（株）製）、パン酵母（オリエンタル酵母工業（株）製）、又は清酒協会７号酵母を各1ｇ添加し、試験例1 と同じ条件でGABA 生成反応を行い、濃縮液各25 ml を調製した。これらの濃縮液中のGABA濃度を表１１に示す。

以上の結果より、ピキア属又はカンジダ属に属する酵母は他の酵母より、かなり高いGABA生成能を有することが分かった。特に、本発明のMR-1 酵母によるGABA 生成能は通常酵母の10〜15 倍程度と非常に高かった。

（試験例１０）
グルタミン酸無添加又は１％添加された、下表所定の糖又は糖代謝中間体を50 mM含有しMR-1菌体（参考例2）を2％含有する反応液を各50 ml調製し、試験例1と同じ条件でGABA生成反応を行い、濃縮液各25 ｍlを調製した。これらの濃縮液中のGABA濃度を表12に示す。

以上の結果より、グルタミン酸無添加の系において各種糖代謝中間体からＧＡＢＡが生成され、更にグルタミン酸が１％添加された系ではＧＡＢＡ生成がより促進されることが示された。

（実施例１）
上記参考例２における本培養に準じた方法により、10 リットル容のジャーファーメンターに7 リットルの液体培地を投入し、滅菌してから参考例２で得られたMR-1 菌株0.7ｇを無菌的状態で接種し、pH 5.0 で30℃において2 日間通気培養した。培養液を遠心分離し、滅菌水で菌体を洗浄し、MR-1 菌体160ｇ（水分79.2％）を得た。これらの菌体をグルコース3.0％及びグルタミン酸0.5％を含む反応液8 リットルに分散させてから、45℃において振とうしながら24 時間でGABA 生成反応を行わせた。その後、反応液を85℃で15 分間加熱失活し、遠心分離した。上清液をろ過してから、減圧濃縮し、固形分40％の濃縮液800 ml を得た。なお、この濃縮液中のGABA含量及びその他成分の分析値を表１３に示す。

（実施例２）
市販“粉末発酵うまみ調味料Ｓ”（キッコーマン（株）製）20ｇを蒸留水で5 倍希釈し、それに参考例２で得られた本発明のMR-1 菌体5ｇ（5％濃度）を添加し分散させた後、希塩酸で反応液の初発pH を5.0 に調整してから、45℃において24 時間でGABA 生成反応を行わせた。その後、反応液を85℃で15 分間加熱失活し、遠心分離し、上清液を濃縮して濃縮液60ｇを得た。この濃縮液中のGABA 濃度は171.2 mg／100 ml で、処理前原料を３倍希釈した液中のGABA 濃度4.1 mg／100 ml と比べて、GABA含量は約40 倍増加した。

（実施例３）
市販魚肉エキス“タイミJF”（仙味エキス（株）製）100ｇを蒸留水で3 倍希釈し、それに参考例２で得られた本発明のMR-1 菌体15ｇ（5％濃度）を添加し分散させた後、実施例2 と同じようにGABA 生成反応をさせ、濃縮液100ｇを得た。この濃縮液中のGABA 濃度は246.8 mg／100 ml で、処理前原料中の同濃度5.3 mg／100 ml と比べて、GABA 含量は約46 倍増加した。

（実施例４）
市販“鰹節エキスJ”（仙味エキス（株）製）100ｇを蒸留水で3 倍希釈し、それに参考例２で得られた本発明のMR-1 菌体15ｇ（5％濃度）、グルコース15ｇ（5％濃度）及びグルタミン酸ナトリウム3ｇ（1％濃度）を添加し分散させた後、実施例2 と同じようにGABA 生成反応をさせ、濃縮液100ｇを得た。この濃縮液中のGABA 濃度は306.3 mg／100 ml であり、処理前原料（GABA 含量ゼロ）と比べて、GABAを多く生成できた。

（実施例５）
市販“コンブだしKW-1”（富士食品工業（株）製）各100ｇを蒸留水で3倍希釈し、それぞれ表１４に記載の所定濃度の、参考例2で得られたMR-1菌体、グルコース及びグルタミン酸ナトリウムを添加し分散させた後、実施例2と同じようにGABA生成反応を行わせ、濃縮液各100ｇを得た。これらの濃縮液中のGABA濃度を調べると、処理前原料（GABA含量ゼロ）と比べて、本発明の菌体MR-1のみを添加しただけでも、GABAを多く生成できたが、さらにグルコースとグルタミン酸を追加した場合は、GABA濃度は約1.7倍に増加できた。

（実施例６）
市販畜肉エキス“チキンミートエキスC-501NAC”（富士食品工業（株）製）各100ｇを蒸留水で3 倍希釈し、それぞれ表１５に記載の所定濃度の、参考例２で得られたMR-1 菌体、グルコース及びグルタミン酸ナトリウムを添加し分散させた後、実施例2 と同じようにGABA 生成反応を行わせ、濃縮液各100ｇを得た。これらの濃縮液中のGABA 濃度を調べると、処理前原料（GABA 含量ゼロ）と比べて、本発明の菌体MR-1 のみを添加しただけでも、GABA を多く生成できたが、さらにグルコースとグルタミン酸を追加した場合は、GABA 濃度は2 倍以上に増加できた。

（実施例７）
市販畜肉エキス“ポークミートエキスFP-301”（富士食品工業（株）製）各100ｇを蒸留水で3 倍希釈し、それぞれ表１６に記載の所定濃度の、参考例２で得られたMR-1 菌体、グルコース及びグルタミン酸ナトリウムを添加し分散させた後、実施例2 と同じようにGABA 生成反応を行わせ、濃縮液各100ｇを得た。これらの濃縮液中のGABA濃度を調べると、処理前原料（GABA 含量ゼロ）と比べて、本発明の菌体MR-1 のみを添加しただけでも、GABA を多く生成できたが、さらにグルコースとグルタミン酸を追加した場合は、GABA濃度は約4 倍に増加できた。

本発明のＭＲ−１株と公知のピキア・アノマラ酵母（AY231611.1）とのITS‐5.8S rDNA遺伝子の塩基配列の比較結果を示す図である。相同性は97.6％であった。本発明のＭＲ−１酵母と公知のＮＢＲＣ−１００２６７酵母の増殖に及ぼす食塩濃度の影響の差異を示す図である。ＭＲ−１酵母の増殖に及ぼす培養温度の影響を示す図である。

Claims

糖類若しくは糖代謝中間体、又は、糖類若しくは糖代謝中間体及びグルタミン酸若しくはその塩に、糖類又は糖代謝中間体の存在下において発酵反応によりγ−アミノ酪酸を生成する能力を有するピキア属若しくはカンジダ属に属する酵母又はその処理物を作用させることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有食品の製造方法。
前記酵母がピキア・アノマラＭＲ−１（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０１３４）又はそのγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する変異株である請求項１に記載の方法。
糖類若しくは糖代謝中間体、又は、糖類若しくは糖代謝中間体及びグルタミン酸若しくはその塩を含有する、動物、植物若しくは微生物の可利用部分、動物、植物若しくは微生物から抽出されたエキス、又は前記可利用部分若しくはエキスを原料とする食品材料に前記酵母又はその処理物を作用させることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
γ−アミノ酪酸生成反応が初発ｐＨ３．０〜６．０且つ温度３２〜５５℃の条件において行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
γ−アミノ酪酸を含有する反応液を更に分離、精製、濃縮又は乾燥することによりγ−アミノ酪酸の濃度を高める工程を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により製造されたγ−アミノ酪酸含有食品。
２００ml容の三角フラスコ中のグルコース５重量％及びグルタミン酸１重量％を含む水溶液５０ｍｌに、水分７８．８重量％の生菌体を１．０ｇ添加し、４５℃において２４時間振とうした後、８５℃において１５分間加熱失活させ、遠心分離し、上清を濃縮して容量を２５ｍｌに定容して得られる溶液中のγ−アミノ酪酸濃度を測定した場合に、該濃度が１５０ｍｇ／１００ｍｌ以上となる量のγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する、ピキア・アノマラに属する酵母。
ピキア・アノマラＭＲ−１（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０１３４）又はそのγ−アミノ酪酸を生成する能力を有する変異株である酵母。