TWI689593B - 高產量γ-胺基丁酸之製備方法 - Google Patents
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Abstract
一種高產量γ-胺基丁酸之製備方法，係施予一乳酸菌株(CPC202)或其組合物於一所需個體，以獲取每公升含量達20公克(含)以上之γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)，俾達以單一乳酸菌提高γ-胺基丁酸之產量，其中該乳酸菌株CPC202係經鑑定為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，而其組合物係指適合短乳桿菌生長、培養、發酵之基質的3碳、4碳及5碳之酸類、醇類者，且該所需個體為麩胺酸(glutamate)：
Description
本發明係有關於一種高產量γ-胺基丁酸之製備方法，尤指涉及一種以單一短乳桿菌(Lactobacillus brevis)產出高產量γ-胺基丁酸能力之菌株CPC202，特別係指可產生含量達29.8g/Liter之γ-胺基丁酸者。
據國民健康署102~104年國民營養健康狀況變遷調查顯示，18歲以上民眾高血壓盛行率為24.1%。高血壓係心臟病、中風、腎臟病、及眼疾等疾病之重大危險因子，世界高血壓聯盟估計全球約有18%人口(9百40萬)死亡之主要原因與高血壓有關。高血壓通常沒有症狀，許多人雖然知道自己有高血壓，卻未採取任何控制血壓之措施，任由其造成人體器官之傷害。
此外，現在人生活壓力大，往往影響睡眠，全台失眠症盛行率為19.3%(2013台灣睡眠醫學學會)，2017年之調查更指出「高年長者」及「女性」有較多之睡眠問題。長期之睡眠不足會導致焦慮的發生，如果長期暴露在失眠與焦慮下，久而久之就會發展為憂慮症，由數據看來使用抗憂慮藥物之人數逐年增加，台灣憂鬱症盛行率約7.3%(約150萬人)，但這僅僅是症狀嚴重而求助醫生之部份，大部分皆有輕度症狀，只是不願就醫，所以以保健食品來紓解失眠焦慮及憂慮之潛在市場非常的大，憂鬱症已為聯合國世界衛生組織視為新世紀三大疾病。
γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)係一種由四個碳所組成非蛋白質組成之水溶性天然胺基酸，分佈非常廣泛，在動植物中均有存
在，以游離態存於原核與真核細胞之游離胺基酸群中。在動物體內，γ-胺基丁酸不會穿透血腦屏障僅存在於神經組織中，它是由大腦組織自行合成的，其中腦組織中之含量為0.1~0.6mg/g組織。γ-胺基丁酸具有抑制多巴胺即交感神經系統神經傳導物質之作用，可抑制神經之興奮性，降低癲癇之發生、以及高血壓與焦慮之生成等，對心血管功能及舒壓、鎮定功效扮演重要角色。而γ-胺基丁酸之生成，則係由克氏循環(TCA cycle)中之麩胺酸(glutamate)被L-麩氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)與維生素B6所催化，通過一個叫γ-胺基丁酸之代謝分流途徑(GABA shunt)而產生。γ-胺基丁酸係一種新型功能性原料，廣泛應用於保健食品、醫藥化工等領域中。
γ-胺基丁酸可經由化學合成、自天然物中萃取、或經由微生物代謝產生。其中化學合成法之缺點係成本較高，得率較低，合成方法條件劇烈，且有化學物質殘留，即使得到純品也不屬於天然產物，並且在生產過程中使用危險溶劑，甚至是有毒溶劑，因此該法所製得之γ-胺基丁酸主要應用於化工與醫藥領域，不能用於食品，也不能作為一種天然之食品添加劑。自天然提取γ-胺基丁酸，其所需費時費工，產率不高。而微生物發酵係目前在產業界生產γ-胺基丁酸廣為使用之方法，其產品具有成本低及含量高，可安全用於食品等優點。
就微生物發酵而言，目前已有多項相關專利及文獻提出，例如：中華民國專利公告號TW I460272 B之說明書中其內容揭示關於「發酵蟲草屬真菌米基而製備γ-胺基丁酸的方法及其應用」，此前案係以複合菌株，依一定程序及菌種比例生產γ-胺基丁酸，另中國專利公告號CN 105482981 A之說明書中其內容揭示關於「一種降血壓保健醋的生產方法」，此前案亦是一種結合兩種乳桿菌以製造γ-胺基丁酸之製備方
法，上述該等前案與本案以單一短乳桿菌菌株即可產得30g/Liter γ-胺基丁酸之方式不同；中國專利公告號CN 103013879 B之說明書中其內容揭示關於「一株具有高產γ-胺基丁酸能力的菌株」，此前案係以植物乳桿菌作為生產γ-胺基丁酸菌種，與本案所使用菌株不同，且該前案專利所揭示γ-胺基丁酸之產出量為138mg/Liter，遠低於本案所使用菌株產出γ-胺基丁酸之產出量(~30g/Liter)；以及Jang EK等人在2015年於Pubmed期刊提出文獻(Jang EK et al.,"γ-aminobutyric acid(GABA)production and angiotensin-1 converting enzyme(ACE)inhibitory activity of fermented soybean containing Sea Tangle by the co-culture of Lactobacillus brevis with Aspergillus oryzae",Journal of Microbiology and Biotechnology,2015,25：1315-20.)，其係以米麴菌結合短乳桿菌共同發酵產出含有1.9g/kg之γ-胺基丁酸，其發酵方式與菌株使用情形及γ-胺基丁酸產量，皆與本案差異甚大。
鑑於上述分析結果，故，一般習用者係無法符合使用者於實際使用時直接提供以單一短乳桿菌高產量γ-胺基丁酸能力的菌株之所需。
本發明之主要目的係在於，克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種以單一短乳桿菌(Lactobacillus brevis)產出高產量γ-胺基丁酸能力之菌株CPC202之高產量γ-胺基丁酸之製備方法。
本發明之次要目的係在於，提供一種篩得具有產生高產量γ-胺基丁酸乳酸菌株CPC202，將此菌株或其組合具有潛力應用於製備具改善血壓、舒眠、鎮定解壓之功效的保健食品、營養補充品或醫藥組成物之高產量γ-胺基丁酸之製備方法。
為達以上之目的，本發明係一種高產量γ-胺基丁酸之製備方法，係施
予一乳酸菌株CPC202或其組合物於一所需個體，以獲取每公升含量達20公克(含)以上之γ-胺基丁酸，俾達以單一乳酸菌提高γ-胺基丁酸之產量，其中該乳酸菌株CPC202係經鑑定為短乳桿菌，而其組合物係指適合短乳桿菌生長、培養、發酵之基質的3碳、4碳及5碳之酸類、醇類者，且該所需個體為麩胺酸(glutamate)。
於本發明上述實施例中，該乳酸菌株係篩選自天然物檢體之乳桿菌的分離株。
於本發明上述實施例中，該分離株係篩選自發酵物、蔬菜、或嬰幼兒糞便檢體。
於本發明上述實施例中，該適合短乳桿菌生長、培養、發酵之基質，係指固體或液體型態之培養介質。
於本發明上述實施例中，該乳酸菌株經發酵培養，所產出之γ-胺基丁酸每公升含量達29.82公克。
於本發明上述實施例中，該麩胺酸之濃度為5~9%(w/v)之間。
於本發明上述實施例中，該乳酸菌株係經革蘭氏染色鏡檢觀察結果為革蘭氏陽性桿菌。
於本發明上述實施例中，該乳酸菌株係不具觸酶、氧化酶及運動性。
於本發明上述實施例中，該乳酸菌株係於好氧環境及厭氧環境下生長。
於本發明上述實施例中，該乳酸菌株係不產生內生孢子。
本發明另提供一種包含上述之γ-胺基丁酸用於製備具改善血壓、舒眠、鎮定解壓之功效的保健食品、營養補充品或醫藥組成物之用途。
第1圖，係本發明之GAD基因表現PCR產物電泳圖。
第2圖，係本發明乳酸菌株之GABA產生量示意圖。
第3圖，係本發明乳酸菌株CPC202之顯微照片圖。
第4圖，係本發明乳酸菌株CPC202之16S rDNA序列示意圖。
請參閱『第1圖~第4圖』所示，係分別為本發明之GAD基因表現PCR產物電泳圖、本發明乳酸菌株之GABA產生量示意圖、本發明乳酸菌株CPC202之顯微照片圖、以及本發明乳酸菌株CPC202之16S rDNA序列示意圖。如圖所示：本發明係一種高產量γ-胺基丁酸之製備方法，係利用單一微生物物種，以發酵培養之方式，產出高產率之γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)，係目前可得知所有微生物生產γ-胺基丁酸，產量最高之方法。本發明以具有生產γ-胺基丁酸能力之乳酸菌株用於製備生產γ-胺基丁酸，主要係施予一乳酸菌株(CPC202)或其組合物於一所需個體，以獲取每公升含量達20公克(含)以上之γ-胺基丁酸，俾達以單一乳酸菌提高γ-胺基丁酸之產量，其中該乳酸菌株CPC202係經鑑定為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，而其組合物係指適合短乳桿菌生長、培養、發酵之基質(指固體或液體型態之培養介質)的3碳、4碳及5碳之酸類、醇類者，且該所需個體為濃度介於5~9%(w/v)之間之麩胺酸(glutamate)。
上述乳酸菌株係自天然物(例如發酵物、蔬菜、或嬰幼兒糞便檢體)中檢測乳桿菌的分離株，於γ-胺基丁酸生產調控基因麩胺酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)表現量及γ-胺基丁酸產生量等。
以下實施例僅舉例以供了解本發明之細節與內涵，但不用於限制本發明之申請專利範圍。
本實施例以聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)偵測各菌株中GAD基因之表現情形，以初步篩選具有分泌GABA潛力之乳酸菌株，結果如第1圖所示。圖中14065為BCRC編號，代表嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)此標準菌株，用作陽性對照，M為DNA分子大小標準。
本發明將乳酸菌株以乳酸桿菌MRS培養基活化培養，在生產γ-胺基丁酸時，添加7%(w/v)麩胺酸到MRS培養液，置於37℃培養箱中培養2天後，將發酵液在4℃條件下，以13,000rpm離心15分鐘，取上清液檢測其γ-胺基丁酸生成量。
本測試以液相層析串聯質譜儀(LC/MC/MC)分析檢測菌株γ-胺基丁酸之產生量(如第2圖所示)，乳酸菌珠CPC202經發酵培養，所產出之γ-胺基丁酸產量為29.820g/L(發酵液)，曾有文獻指出高血壓患者每天18mg γ-胺基丁酸，即有良好調節血壓功效；故本方法所得產出量約為文獻建議高血壓患者每天使用量的1656倍。
本發明乳酸菌株乃由台灣中油股份有限公司篩選自傳統發酵食品之菌種，原始菌株編號為CPC202。將此生產γ-胺基丁酸之乳酸菌株CPC202，經由食品工業發展研究所菌種中心進行菌種學名鑑定，利用革蘭氏染色鏡檢觀察為革蘭氏陽性桿菌，結果如第3圖所示，不具觸酶、氧化酶及運動性，於好氧環境及厭氧環境下會生長，不會產生內生孢子。根據16S rDNA序列進行比對分析，加以鑑定確認此菌株
CPC202之菌種為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，如第4圖所示，可得知CPC202 16S rDNA基因片段最接近Lactobacillus brevis，序列相似性高達100%，證實CPC202為Lactobacillus brevis菌屬。另利用API鑑定系統，根據API 50生化特性鑑定結果，可得知CPC202最接近Lactobacillus brevis，證實CPC202為Lactobacillus brevis菌屬。因此，經上述16S rDNA序列比對及API 50生化特性鑑定，確認此菌株CPC202之菌種為短乳桿菌(請參見下表一的菌種鑑定)，且菌株種類為衛福部公告之可食用安全菌株。
在此說明本發明所提CPC202 16S rDNA的序列表中，位置116的r表示a或g(測DNA序列時，a和g同時出現)，這是雜合子(Heterozygote)，是微生物經常出現的現象。
序列分析使用之引子名稱與引子序列。
藉此，本發明係經過篩選並以實驗檢測所得乳酸菌株其具備的特徵以及可達成的性能，並發現獲得的乳酸菌株CPC202能產生高產量γ-胺基丁酸，γ-胺基丁酸具有抑制多巴胺即交感神經系統神經傳導物質之作
用，可抑制神經之興奮性，降低癲癇之發生、高血壓與焦慮之生成等，對心血管功能及舒壓、鎮定功效扮演重要角色。將此菌株或其組合具有潛力應用於製備具改善血壓、舒眠、鎮定解壓之功效的保健食品、營養補充品或醫藥組成物，具有經濟價值。
綜上所述，本發明係一種高產量γ-胺基丁酸之製備方法，可有效改善習用之種種缺點，直接提供以單一短乳桿菌(Lactobacillus brevis)產出高產量γ-胺基丁酸(GABA)能力之菌株，γ-胺基丁酸具有重要生理功能，係作為抗憂鬱、抗焦慮或血壓調節之醫藥及保健重要原料；本發明篩得具有產生高產量γ-胺基丁酸乳酸菌株CPC202，具有製備成改善血壓、舒眠、鎮定解壓功效的保健食品、營養補充品或醫藥組成物的潛力，進而使本發明之產生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所
2020/01/13 BCRC 910970
Claims (5)
- 一種乳酸菌株用於製備生產γ-胺基丁酸之方法，其係施予一乳酸菌株(CPC202)或其組合物於一所需個體，以獲取每公升含量達20公克(含)以上之γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)，俾達以單一乳酸菌提高γ-胺基丁酸之產量，其中該乳酸菌株係自天然物(發酵物、蔬菜、或嬰幼兒糞便檢體)中檢測乳桿菌的分離株，且該乳酸菌株CPC202係經鑑定為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，而其組合物係指適合短乳桿菌生長、培養、發酵之基質(指固體或液體型態之培養介質)的3碳、4碳及5碳之酸類、醇類者，且該所需個體為濃度介於5~9%(w/v)之間之麩胺酸(glutamate)。
- 依申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備生產γ-胺基丁酸之方法，其中，該乳酸菌株經發酵培養，所產出之γ-胺基丁酸每公升含量達29.82公克。
- 依申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備生產γ-胺基丁酸之方法，其中，該乳酸菌株係經革蘭氏染色鏡檢觀察結果為革蘭氏陽性桿菌。
- 依申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備生產γ-胺基丁酸之方法，其中，該乳酸菌株係於好氧環境及厭氧環境下生長，不具觸酶、氧化酶及運動性，並且不產生內生孢子。
- 一種包含如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之γ-胺基丁酸用於製備具改善血壓、舒眠、鎮定解壓之功效的醫藥組成物之用途。
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| WO2013107913A1 (en) * | 2012-01-19 | 2013-07-25 | University College Cork - National University Of Ireland, Cork | Gaba-producing culturable bacteria derived from the human gastrointestinal tract |
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