CN101724587A

CN101724587A - 高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN101724587A
Application number: CN200910102279A
Authority: CN
Inventors: 蒋冬花; 缪存影
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2009-09-10
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2029-09-10
Also published as: CN101724587B

Abstract

本发明属于生物技术食品领域，尤其涉及一株高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L2菌株及其筛选方法和应用。本发明的短乳杆菌(L.brevis)L2菌株，其保藏编号为：CCTCC No：M209132。本发明由于采用短乳杆菌(L.brevis)L2菌株可以获得高含γ-氨基丁酸(约5～12g/L)的发酵液。同时，生物法制备γ-氨基丁酸是利用乳酸菌体内含有高活性的谷氨酸脱羧酶。乳酸菌制品是目前国际上公认的最安全的健康食品，因此，此法生产的γ-氨基丁酸不存在安全上的隐患，能达到食品安全级。

Description

高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术食品领域，尤其涉及一株高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L2菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是一种天然存在的活性氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有降血压、治疗癫病、镇静安神、增强记忆、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖、健肝利肾、减轻更年期综合症等多种生理功能。富含GABA的食品具有很好的免疫保健作用，可以作为药物或功能性食品。

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。这是一群相当庞杂的细菌，除极少数种外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的益生菌群，其广泛存在于人或动物肠道、牛奶、酸菜、酸奶等中。目前已被国内外生物学家所证实，肠道内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系，能够帮助消化，有助人体肠道的健康，因此常被视为健康食品。

发明内容

针对现有技术中天然食品GABA含量较低等问题，本发明的第一个目的是从自然环境不同场所筛选高产GABA的乳酸菌菌株，尤其是一株从自然发酵的酸菜中选育的短乳杆菌(L.brevis)L2菌株，可用于GABA的生物制备。

本发明的第二个目的是提供上述的短乳杆菌(L.brevis)L2菌株的筛选方法。

本发明的第三个目的是提供上述的短乳杆菌(L.brevis)L2菌株的应用于GABA的生物制备。

为实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明的短乳杆菌(L.brevis)L2菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M209132，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2009年6月25日，分类命名为：短乳杆菌L2 Lactobacillus brevisL2。菌落乳白色，小，表面光滑；显微镜观察细胞呈短杆状，长度约2-4μm，直径约0.7-1.0μm，成对或成链状出现；无鞭毛，不运动，无孢子；革兰氏染色阳性，兼性厌氧；16S rDNA电泳和测序分析结果表明，其长度为1527bp，与短乳杆菌(L.brevis)的同源性达97.5％。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株的筛选方法，该菌株来源于酸菜汁液，采用梯度稀释分离法。作为优选，该方法包括以下的步骤：①酸菜汁液1mL，进行梯度稀释10^-1-10^-4，选择10^-2浓度200μL涂布含溴甲酚绿乳酸菌分离培养基平板，30℃培养48h，出现圆形乳白或浅黄色菌落，周围培养基变为黄色者初步确定为乳酸菌；②挑取单菌落，进一步分离、纯化后移入MRS试管中，置4℃冰箱中保存。

作为再优选，上述的乳酸菌分离培养基可以采用以下的配方：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏1％，葡萄糖0.5％，番茄汁20％，吐温0.05％，碳酸钙2％，琼脂1.5％，溴甲酚绿0.01％，pH 6.5，余量为水。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株用于γ-氨基丁酸的制备。

高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株用于γ-氨基丁酸制备的方法，其特征在于包括以下的步骤：

①挑取适量菌种接入液体MRS中，30℃活化培养12～18h；

②在TYG培养液中，取培养后的种子培养液，按0.3～0.8％的接种量接种后，30℃静置培养18～30h作发酵种子；

③在质量分数为0.5～2.0％谷氨酸钠的TYG液体培养基中，取培养18～30h的种子培养液，按2～4％接种量接种，30℃静置培养45～50h，可得高GABA含量的乳酸菌培养液。

作为优选，上述的MRS培养基可以采用以下的配方：酪蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，吐温-80 0.1％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂2.0％，pH 6.5，余量为水。

作为优选，上述的TYG液体培养基可以采用以下的配方：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，葡萄糖1.0％，丁二酸钠0.5％，pH6.5，余量为水。

本发明由于采用了上述的技术方案，可以获得高含γ-氨基丁酸(约5～12g/L)的发酵液。同时，生物法制备γ-氨基丁酸是利用乳酸菌体内含有高活性的谷氨酸脱羧酶。乳酸菌制品是目前国际上公认的最安全的健康食品，因此，此法生产的γ-氨基丁酸不存在安全上的隐患，能达到食品安全级。

附图说明

图1为短乳杆菌(L.brevis)L2菌株菌落特征图。

图2为显微镜下短乳杆菌(L.brevis)L2菌株细胞形态特征图。

图3为短乳杆菌(L.brevis)L2菌株16S rDNA电泳分析图。

图4为9株酸菜汁中分离乳酸菌菌株培养液GABA纸层析结果图。

图5为GABA标准品高效液相色谱(HPLC)检测图

图6为短乳杆菌(L.brevis)L2菌株培养液GABA高效液相色谱(HPLC)检测图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施方式做一个详细的说明。

实施例1 从酸菜中筛选短乳杆菌(L.brevis)L2菌株。

(一)培养基

乳酸菌分离培养基：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏1％，葡萄糖0.5％，番茄汁20％，吐温0.05％，碳酸钙2％，琼脂1.5％，溴甲酚绿0.01％，pH 6.5。MRS培养基：酪蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，吐温-80 0.1％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂2.0％，pH 6.5。

TYG液体培养基：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，葡萄糖1.0％，丁二酸钠0.5％，pH6.5。

(二)方法

采用梯度稀释分离法。取酸菜汁液1mL，进行梯度稀释(10^-1-10^-4)，选择合适的浓度(10^-2)200μL涂布乳酸菌分离培养基(含溴甲酚绿)平板，30℃培养48h，出现圆形乳白或浅黄色菌落，周围培养基变为黄色者初步确定为乳酸菌。挑取单菌落，进一步分离、纯化后移入MRS试管中，将所获菌株编号，置4℃冰箱中保存，备用。用MRS固体斜面培养基进行菌种活化传代，菌种每4周转接一次；菌种使用之前需先活化。对选出的菌株进行形态、生理生化和16SrDNA序列鉴定。

上述的短乳杆菌(L.brevis)L2菌株菌落乳白色，小，表面光滑(如图1所示)；显微镜观察细胞呈短杆状，长度约2-4μm，直径约0.7-1.0μm，成对或成链状出现；无鞭毛，不运动，无孢子；革兰氏染色阳性，兼性厌氧(如图2所示)；16S rDNA电泳和测序分析结果表明，其长度为1527bp(如图3所示)，与短乳杆菌(L.brevis)的同源性达97.5％。鉴定该菌株为短乳杆菌(L.brevis)。

菌株的稳定性：在MRS培养基上，30℃3d条件下，经15代连续培养，其培养特征、形态特征和GABA产量均无明显变化，该菌的生物性状基本稳定。

实施例2 短乳杆菌(L brevis)L2菌株用于γ-氨基丁酸的制备的方法

(一)菌株

保藏编号为CCTCC NO：M209132的短乳杆菌(L.brevis)L2菌株。

(二)方法

从活化的MRS固体斜面培养基上挑取适量菌种接入液体MRS中，30℃活化培养16h；250mL三角瓶中装入50mL TYG培养液，取培养16h的种子培养液，按0.5％的接种量接种后，30℃静置培养24h作发酵种子；250mL三角瓶中装入50mL加入质量分数为1％谷氨酸钠的TYG液体培养基，取培养24h的种子培养液，按3％接种量接种，30℃静置培养48h，可得高GABA含量的乳酸菌培养液(如图4所示)，经高效液相色谱(HPLC)检测为5～12g/L(如图6所示)。

Claims

1.高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株，其特征在于：高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株的保藏编号为CCTCC NO：M209132。

2.根据权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株，其特征在于：该菌株菌落乳白色，小，表面光滑；显微镜观察细胞呈短杆状，长度约2-4μm，直径约0.7-1.0μm，成对或成链状出现；无鞭毛，不运动，无孢子；革兰氏染色阳性，兼性厌氧；16S rDNA电泳和测序分析结果表明，其长度为1527bp。

3.高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株的筛选方法，其特征在于：该菌株来源于酸菜汁液，采用梯度稀释分离法。

4.根据权利要求3所述的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株的筛选方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：①酸菜汁液1mL，进行梯度稀释10^-1-10^-4，选择10^-2浓度200μL涂布含溴甲酚绿乳酸菌分离培养基平板，30℃培养48h，出现圆形乳白或浅黄色菌落，周围培养基变为黄色者初步确定为乳酸菌；②挑取单菌落，进一步分离、纯化后移入MRS试管中，置4℃冰箱中保存。

5.根据权利要求4所述的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株的筛选方法，其特征在于乳酸菌分离培养基采用以下的配方：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏1％，葡萄糖0.5％，番茄汁20％，吐温0.05％，碳酸钙2％，琼脂1.5％，溴甲酚绿0.01％，pH 6.5，余量为水。

6.根据权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株用于γ-氨基丁酸的制备。

7.根据权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于包括以下的步骤：

①挑取适量菌种接入液体MRS中，30℃活化培养12～18h；

③在质量分数为0.5～2.0％谷氨酸钠的TYG液体培养基中，取培养18～30hh的种子培养液，按2～4％接种量接种，30℃静置培养45～50h，可得高GABA含量的乳酸菌培养液。

8.根据权利要求7所述的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于MRS培养基采用以下的配方：酪蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，吐温-800.1％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂2.0％，pH 6.5，余量为水。

9.根据权利要求7所述的高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于TYG液体培养基采用以下的配方：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，葡萄糖1.0％，丁二酸钠0.5％，pH6.5，余量为水。