CN104789610B - 一种乳酸菌在生产γ‑氨基丁酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381在生产γ‑氨基丁酸中的应用及制备γ‑氨基丁酸的方法。所述的乳酸菌能够产生γ‑氨基丁酸，并且可以在发酵培养基不添加谷氨酸钠的情况产量可达0.05g/L，所述的方法简单易行，可以用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种乳酸菌(Lactobacillus curieae)在生产γ-氨基丁酸中的应用。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是指一类能够通过同型发酵或异型发酵而产生乳酸的细菌，一般呈革兰氏阳性，厌氧，无芽孢，耐酸。并不是严格意义上系统分类中的一科或一属，目前已发现的这一类菌在细菌分类学上至少包括如下的属，如：乳酸杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠球菌属、肠球菌属、乳球菌属、肉食杆菌属、奇异菌属、片球菌属、气球菌属、漫游球菌属、李斯特氏菌属、芽孢乳杆菌属、芽孢杆菌属中的少数种、环丝菌属、丹毒丝菌属、孪生菌属和糖球菌属等。绝大多数乳酸菌为厌氧或兼性厌氧的化能异养菌，生长繁殖于厌氧或微耗氧、矿物质和有机营养物丰富的酸性环境中。在动物的消化道中含量较高，大约占正常菌群10％，是人和动物体内正常微生物群的组成部分，通常作为安全的益生菌剂添加到食物及动物饲料中，且乳酸菌的生态与正常微生物群的生态密切相关。
近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。乳酸菌能赋予食品柔和的酸味和香气，改善食品的品质和营养，具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异原和增强免疫力等重要生物学功能，在食品中被广泛应用。乳酸菌发酵的食品被公认为是功能性食品。乳酸菌被认为是最适合的食品天然防腐剂，其表现出来的抗菌活性也可防止微生物污染，其可产生一些天然的抗菌剂，包括有机酸(乳酸、乙酸、甲酸、苯乳酸、己酸)、二氧化碳、过氧化氢、双乙酰、乙醇和细菌素等。
中国专利CN102559561B(公开日2012年7月11日)公开了一种食源性乳酸菌(Lactobacillus curieae)(保藏号：CCTCC NO:M2011381)，其对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有良好的抑菌作用，可添加到食品中用作食品防腐剂。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，免疫学研究表明，其浓度最高的区域为中脑中黑质。GABA参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，在人体，GABA还直接调控肌肉张力。研究表明，GABA能作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到降低血压的目的。另外，神经组织中GABA的降低也与Huntington疾病、老年痴呆等神经衰败症的形成有关；此外，GABA还具有防止皮肤老化、消除体臭、改善脂质代谢、防止动脉硬化、高效减肥等功能。
GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种。化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能被认为是一种天然食品添加剂。生物合成法相比较来说是一种既安全、又低成本的方法。在早期的研究中，发酵法生产GABA以大肠杆菌为生产菌，发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨、矿物质等。在发酵过程中，利用大肠杆菌脱羧酶的作用，将L-谷氨酸转化为GABA，再分离纯化得到GABA制品。但是，若要进行食品开发，使用大肠杆菌无疑存在种种安全问题，因此亟待解决生物合成法合成GABA的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中生物合成法合成GABA存在安全性、合成原料必需谷氨酸钠等问题的缺陷，提供一种乳酸菌(Lactobacillus curieae)在生产γ-氨基丁酸中的应用及γ-氨基丁酸的制备方法。所述的乳酸菌能够产生γ-氨基丁酸，所述的制备方法简单易行，可以用于工业化生产。并且所述的乳酸菌能够用于含GABA的食品和保健品的制备。
本申请的发明人在对乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的进一步研究中发现，该菌株的代谢产物中含有γ-氨基丁酸，因而可用于生产γ-氨基丁酸。
所述的保藏号为CCTCC No:M2011381的乳酸菌已保藏在中国典型培养物保藏中心，并且在中国专利CN102559561B(公开日2012年7月11日)中公开，该专利申请的全文为本发明所引用。
本发明提供一种乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381在生产γ-氨基丁酸中的应用。
本发明提供一种生产γ-氨基丁酸的方法，将所述的乳酸菌(Lactobacilluscurieae)CCTCC No:M2011381在发酵培养基中发酵，即可。
所述的发酵培养基为本领域常规的发酵培养基，较佳地为TGY培养基、MRS培养基、LB培养基、PGY培养基、牛奶或豆浆中的一种或多种，更佳地为MRS培养基或TGY培养基。较佳地，所述的发酵培养基中还含有谷氨酸钠(MSG)，所述谷氨酸钠的含量为0.5～10g/L。
所述发酵的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～40℃，更佳地为30～37℃。所述发酵的时间为本领域常规的时间，较佳地为18～72小时，更佳地为24～48小时。所述发酵的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1～10％(v/v)，更佳地为2～6％(v/v)。
较佳地，所述的发酵前还包括在种子培养基培养。
其中，所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地为MRS液体培养基。所述培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～40℃，更佳地为30～37℃。所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为16～24小时，更佳地为18～20小时。所述培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为0.5～10％(v/v)，更佳地为2～5％(v/v)。
本发明提供一种乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381在生产含γ-氨基丁酸的食品和药品中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：所述的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381可以发酵产生γ-氨基丁酸，并且可以在发酵培养基不添加谷氨酸钠的情况产量可达0.05g/L，可以用于γ-氨基丁酸的生产。
附图说明
图1为乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵液样品、MSG标准样品以及GABA标准样品的薄层层析结果。框线说明GABA标准样品和发酵液移动了同等距离。
图2为GABA标准品的HPLC图谱。
图3为乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵液样品的HPLC图谱。
图4为乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵液样品中添加GABA标准品得到的HPLC图谱。
图5为实施例3的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵液样品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明实施例中所使用的乳酸菌为保藏号为CCTCC No:M2011381的乳酸菌，其已保藏在中国典型培养物保藏中心，并且在中国专利CN102559561B(公开日2012年7月11日)中公开。
本发明实施例中所使用的实验试剂如下：
展开剂：将正丁醇、冰乙酸和水以5:2:5的体积比例混合，展开剂中加入0.5％的茚三酮(w/v)配制而成。
标准L-谷氨酸钠(L-MSG)溶液：称取0.05g L-MSG，用去离子水溶解，定容于50mL容量瓶中，摇匀，常温保存，备用。
标准γ-氨基丁酸(GABA)储备液：准确称取50.0mgγ-氨基丁酸标准品于烧杯中，用超纯水溶解，定容于50mL容量瓶中，摇匀，得到1.00mg/mL的标准GABA储备液，置于4℃冰箱保存，保存期限为一个月。
0.5M硼酸钾溶液：准确称取3.10g硼酸和2.60g氢氧化钾于烧杯中，用超纯水溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀，用磷酸调节pH到9.5。
邻苯二甲醛(OPA)溶液：称取0.09g的OPA，先溶于1.5mL甲醇，再溶解于30mL 0.5M硼酸钾溶液中，然后加入0.25mL的2-巯基乙醇，混匀，避光保存于4℃冰箱中。
磷酸二氢钾缓冲液：称取1.00g磷酸二氢钾于烧杯中，用超纯水溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀，得到0.01g/mL的磷酸二氢钾缓冲溶液，保存于4℃冰箱中，备用。
流动相醋酸-醋酸钠缓冲盐溶液：准确称取1.58g三水合乙酸钠于烧杯中，加入80μL冰乙酸，用超纯水溶解，定容于1000mL容量瓶中，摇匀，过超滤膜，得到15mM的醋酸-醋酸钠缓冲盐溶液，保存备用。
本发明实施例中检测γ-氨基丁酸(GABA)的实验方法如下：
1)、薄层层析法
使用预制好的薄层板，用铅笔于距薄层板顶端2cm处划细线；吸取乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC NO:M2011381的发酵液1mL于EP管中，12000rpm离心1min，用毛细管取上清液点样于薄层板上；再分别用毛细管取标准L-MSG溶液及标准GABA溶液，取适当间隔点样于同一板上。取一密闭容器，适量展开剂，高度为距离划线处约1cm，将薄层板置入密闭容器中，静置一段时间，当展开剂前沿距薄层板上端1cm时将其取出，置于85℃烘箱中烘烤显色15min左右，取出进行定性分析。
2)、高效液相色谱法(HPLC)
色谱柱：WondaSil C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；
流动相：A：15mM流动相醋酸-醋酸钠缓冲盐溶液(pH 5.80)；B：乙腈；
流速：0.8mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：334nm；
进样方式：自动进样；
进样量：20μL。
标样与发酵液的柱前衍生条件：用移液枪依次吸取200μL标准样品或发酵液、600μL的OPA溶液于5mL EP管中，振荡摇匀，再吸取800μL磷酸二氢钾缓冲液，混匀，经0.22μm的过滤膜过滤1～2次后，进样。
样品洗脱条件：A、15mM醋酸钠缓冲盐缓冲液(pH 5.80)；B、乙腈。具体的洗脱条件如表1所示：
表1、样品梯度洗脱条件
实施例1 乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵与样品处理
种子培养基：MRS液体培养基。
发酵培养基：含3g/L谷氨酸钠(MSG)的TGY液体培养基(TGY液体培养基：包括胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L和葡萄糖10g/L，pH 7.0，115℃灭菌20min即可)。
将保存的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381按2％(v/v)的接种量接于装有10mL的MRS液体培养基的小锥形瓶中，30℃摇床培养18小时，得活化后的菌种。
将所述活化后的菌种按2％(v/v)的接种量接于30mL发酵培养基中，接种后的发酵液30℃培养24小时，取得上清液，离心后即得发酵液样品。
实施例2 GABA的检测
(1)薄层层析检测
分别取实施例1获得的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵液样品、MSG标准样品以及GABA标准样品，用前述薄层层析法进行检测，结果如图1所示。
由图1的结果可以看出，与MSG标准样品和GABA标准样品移动同等距离的为发酵液中的MSG和GABA，从而可以定性说明该菌株在添加了MSG的培养基中发酵，发酵产物中确实有GABA存在，通过薄层层析法可以便捷有效地判断发酵液中有目标产物，利用HPLC法测定其中的具体含量并进行后续实验。
(2)HPLC检测
分别取实施例1获得的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No：M2011381的发酵液样品以及GABA标准品，以前述HPLC方法进行检测，结果如图2～3所示。
图2为GABA标准品的HPLC图谱，可见GABA标准品的出峰时间为9.399min；图3为实施例1获得的发酵液样品的HPLC图谱，可见发酵液中的出峰时间为9.400min，与GABA标准品有所偏移。
为了验证9.400min所出的峰为GABA，设计了一个加样实验，即在发酵液中添加GABA标准品，添加量为0.2g/L，所得HPLC图谱如图4所示。由图4的结果可见，在9.399min位置处，峰高增加，峰面积变大，证明该位置的峰就是GABA的峰。
由上可知，乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381具有产GABA的能力，未经优化的产量约为0.05g/L，可进一步优化用于生产GABA。
实施例3 乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵与样品处理
用于发酵培养的TGY培养基不含MSG，其余所有条件均与实施例1相同。得发酵液样品。
实施例4 GABA的检测
采用与实施例2相同的HPLC检测方法，对实施例3获得的样品进行检测，结果如图2和图5所示。
图2为GABA标准品的HPLC图谱，图5为实施例3获得的发酵液样品的HPLC图谱，对照图谱可见发酵液中的保留时间为9.397min的峰，即为GABA。
由此可见，本发明的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381，在不添加谷氨酸钠的TGY培养基中培养也能产生GABA。
实施例5 乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵与样品处理
种子培养基：MRS液体培养基。
发酵培养基：含0.5g/L谷氨酸钠(MSG)的TGY液体培养基(TGY液体培养基：包括胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L和葡萄糖10g/L，pH 7.0，115℃灭菌20min即可)。
将保存的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381按0.5％(v/v)的接种量接于装有10mL的MRS液体培养基的小锥形瓶中，25℃摇床培养20小时，得活化后的菌种。
将所述活化后的菌种按1％(v/v)的接种量接于30mL发酵培养基中，接种后的发酵液25℃培养72小时，取得上清液，离心后即得发酵液样品。将该发酵液样品进行HPLC检测，发现含有GABA，说明本发明的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381，在上述培养条件下能产生GABA。
实施例6 乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵与样品处理
种子培养基：MRS液体培养基。
发酵培养基：含10g/L谷氨酸钠(MSG)的TGY液体培养基(TGY液体培养基：包括胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L和葡萄糖10g/L，pH 7.0，115℃灭菌20min即可)。
将保存的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381按5％(v/v)的接种量接于装有10mL的MRS液体培养基的小锥形瓶中，37℃摇床培养16小时，得活化后的菌种。
将所述活化后的菌种按6％(v/v)的接种量接于30mL发酵培养基中，接种后的发酵液37℃培养48小时，取得上清液，离心后即得发酵液样品。将该发酵液样品进行HPLC检测，发现含有GABA，说明本发明的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381，在上述培养条件下能产生GABA。
实施例7 乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381的发酵与样品处理
种子培养基：MRS液体培养基。
发酵培养基：含10g/L谷氨酸钠(MSG)的TGY液体培养基(TGY液体培养基：包括胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L和葡萄糖10g/L，pH 7.0，115℃灭菌20min即可)。
将保存的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381按10％(v/v)的接种量接于装有10mL的MRS液体培养基的小锥形瓶中，40℃摇床培养24小时，得活化后的菌种。
将所述活化后的菌种按10％(v/v)的接种量接于30mL发酵培养基中，接种后的发酵液40℃培养18小时，取得上清液，离心后即得发酵液样品。将该发酵液样品进行HPLC检测，发现含有GABA，说明本发明的乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381，在上述培养条件下能产生GABA。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。
Claims (10)
1.一种乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381在生产γ-氨基丁酸中的应用。
2.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，将乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381在发酵培养基中发酵，即可。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为TGY培养基、MRS培养基、LB培养基、PGY培养基、牛奶或豆浆中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为MRS培养基或TGY培养基；和/或，所述的发酵培养基中还含有谷氨酸钠，所述谷氨酸钠的含量为0.5～10g/L。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25～40℃；所述发酵的时间为18～72小时；和/或，所述发酵的接种量以体积比计为1～10％。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～37℃；所述发酵的时间为24～48小时；和/或，所述发酵的接种量以体积比计为2～6％。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵前还包括在种子培养基培养。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为MRS液体培养基；所述培养的温度为25～40℃；所述培养的时间为16～24小时；和/或，所述培养的接种量以体积比计为0.5～10％。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为30～37℃；所述培养的时间为18～20小时；和/或，所述培养的接种量以体积比计为2～5％。
10.一种乳酸菌(Lactobacillus curieae)CCTCC No:M2011381在生产含γ-氨基丁酸的食品和药品中的应用。
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