CN105132321B - 一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法，该菌株保藏编号为CGMCC No.11155。该菌具有抑菌、耐酸、耐胆盐等优良性能，且耐受低水分，在固态发酵条件下，具有较长保质期。该培养基含有麦麸、豆粕、甘蔗糖蜜、活性炭、碳酸钙和β‑环状糊精。生产工艺为在培养基中接种乳杆菌发酵，在45～60℃下烘干，可获得发酵产物。相比同类屎肠球菌菌株，本发明菌株及发酵产品具有活菌浓度高、保质期长等优点。本发明菌株固体发酵产品能够显著提高保育仔猪的日增重、成活率和饲料转化率，经济效益明显，可作为饲料添加剂。

Description

一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法

技术领域

本发明涉及一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法。

背景技术

微生态饲料添加剂是用已知有益的微生物经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的对人、畜安全有益的活菌制剂，并用于饲料的添加剂，一般简称为微生态制剂，目前市售的微生态制剂有液态和固态两种。乳酸菌作为微生态制剂中较重要的一类，可以调节肠道功能紊乱，维持肠道菌种平衡；应用于饲料中，可以促进生长，防治疾病和改善禽产品品质。

目前乳酸菌类微生态制剂已有较多产品。其中以液态发酵形式的产品居多，但成本较高，易受反馈控制，活菌量难以提高。且液态产品发酵后，菌株极易失活，从而导致产品货架期短，影响产品市场推广。另一类常见发酵形式为固态发酵，而现阶段固态发酵培养基成本较高，部分固态发酵过程中，菌种难以耐受烘干及后期低水分保存，从而菌量难以提高。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一株耐受低水分，在固态发酵条件下，具有较长保质期的菌株，以及一种高密度固态发酵培养屎肠球菌的培养基，本发明使用低廉的原料，简单的工艺方法，具有发酵菌量高、产品保存期长等特点。

在本发明研究培养基中，发现以廉价的农副产品和工业下脚料等简单的原料按一定的配比进行屎肠球菌的培养配方简单，且价格便宜，本发明者在进行配方的研究中进行了一系列的实验，最后得出了这一配方最适合培养屎肠球菌属。应用该培养基所得所得到的培养物发酵菌量高、干燥后保藏时间长等特点，同时培养简便易行、经济效果显著。

本发明的目的在于提供一株屎肠球菌Lactobacillus plantarum GLM105。

本发明的另一目的在于提供上述屎肠球菌在制备饲料添加剂中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种高密度固态发酵培养屎肠球菌的培养基。

本发明的再一目的在于提供一种制备屎肠球菌固体发酵产品的方法。

本发明的再一目的在于提供屎肠球菌固体发酵产品作为饲料添加剂的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种屎肠球菌，其分类命名为Enterococcus faecium GLM105，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.11155。

上述屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105在抑菌中的应用。

上述屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105在制备饲料添加剂中的应用。

一种固态发酵培养屎肠球菌的培养基，该培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸15％～25％，豆粕19％～29％，甘蔗糖蜜3％～5％，活性炭2％～4％，碳酸钙2％～6％，β-环状糊精2％～6％和水35％～45％。

进一步的，上述培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸22％，豆粕22％，甘蔗糖蜜4％，活性炭3％，碳酸钙5％，β-环状糊精4％和水40％。

进一步的，上述屎肠球菌为Enterococcus faecium GLM105屎肠球菌。

一种制备屎肠球菌固体发酵产品的方法，该方法为将屎肠球菌Enterococcus faeciumGLM105菌种按2～4％v/v的接种量接种到上述所述的培养基中，于30～37℃的条件下密闭发酵，再将发酵产物于45～60℃烘干，即可。

进一步的，上述烘干的温度为55℃，烘干的时间为4h。

一种制备屎肠球菌固体发酵产品，其制备方法为上述任一所述的制备屎肠球菌固体发酵产品的方法。

上述屎肠球菌固体发酵产品在制行饲料添加剂中的应用。

上述菌株屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏中心于2015年7月23日收到申请人提供的菌株，保藏中心给予该培养物的保藏号为CGMCC No.11155，建议的分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium，已于2015年7月23日鉴定保藏的菌株是存活的。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一株耐受低水分，在固态发酵条件下，具有较长保质期的菌株，相比同类屎肠球菌菌株，本发明菌株及发酵产品具有活菌浓度高、保质期长等优点。

本发明还提供了一种高密度固态发酵培养屎肠球菌的培养基，本发明使用低廉的原料，简单的工艺方法，具有发酵菌量高、产品保存期长等特点。

本发明简单易行，生产成本低，经济效益好。用简单易行的培养基培养生产乳酸杆菌属，除用于保健食品外，还可用于肠道调整剂和动物保护产品及饲料添加剂。

在本发明中，发现以廉价的农副产品和工业下脚料等简单的原料按一定的配比进行屎肠球菌的培养配方简单，且价格便宜，本发明者在进行配方的研究中进行了一系列的实验，最后得出了这一配方最适合培养屎肠球菌属。应用该培养基所得所得到的培养物发酵菌量高、干燥后保藏时间长等特点，同时培养简便易行、经济效果显著。

具体实施方式

一种屎肠球菌，其分类命名为Enterococcus faecium GLM105，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.11155。

屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105在抑菌中的应用。

屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105在制备饲料添加剂中的应用。

一种固态发酵培养屎肠球菌的培养基，该培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸15％～25％，豆粕19％～29％，甘蔗糖蜜3％～5％，活性炭2％～4％，碳酸钙2％～6％，β-环状糊精2％～6％和水35％～45％。

优选的，上述培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸22％，豆粕22％，甘蔗糖蜜4％，活性炭3％，碳酸钙5％，β-环状糊精4％和水40％。

优选的，上述屎肠球菌为屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105。

一种制备屎肠球菌固体发酵产品的方法，该方法为将屎肠球菌Enterococcus faeciumGLM105菌种按2～4％v/v的接种量接种到上述所述的培养基中，于30～37℃的条件下密闭发酵，再将发酵产物于45～60℃烘干，即可。

优选的，上述发酵时间为24～72h。

优选的，上述烘干的温度为55℃，烘干的时间为4h。

一种制备屎肠球菌固体发酵产品，其制备方法为上述任一所述的制备屎肠球菌固体发酵产品的方法。

上述屎肠球菌固体发酵产品在制行饲料添加剂中的应用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1屎肠球菌分离、筛选、鉴定及保存

1.1菌株的分离

取干奶酪样品，研磨后，用无菌水分别进行10、100、1000倍稀释，分别取200ul涂布于MRS固体培养基，37℃培养48小时，挑取菌落，划线MRS培养基，经4次纯化后，挑取单菌落至MRS肉汤培养，20％甘油，-70℃下保存备用。经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16S rDNA测序。

1.2菌株形态学特征鉴定

取纯化菌株(GLM105)的单菌落，转接到MRS固体培养基(琼脂)上，于37℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株GLM105在MRS固体培养基上形成边缘整齐，光滑，粘稠，表面光泽，不透明的菌落。

1.3菌株的生理生化特征

挑取菌株GLM105在MRS固体培养基(琼脂)上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。结果显示，GLM105为革兰氏阳性杆菌。根据《常见细菌系统鉴定手册》结合法国梅里埃API20NE标准鉴定系统对菌株进行生理生化鉴定。

1.3.1API 20NE鉴定特征

利用法国梅里埃API20NE标准鉴定系统测定菌株GLM105利用碳源及产酸情况，API 20NE试验条是由20个含干燥底物或培养基的小管所组成。

1)API 20NEAUX培养基成分：(NH₄)₂SO₄2g，琼脂1.5g，无机盐基础82.8mg，氨基酸250mg，维生素和营养物底物35.9mg，磷酸缓冲液0.04M，加至1000ml，最终pH:7.0～7.2；

NaCl0.85％培养基：NaCl8.5g，H₂O 1000ml。

2)在平板上培养菌株，以接种针从分离物的平板上挑取1-4分纯单个菌落至2ml NaCl0.85％培养基中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，所需浓度为0.5麦氏单位标准浊度。打开AUX培养基的安瓿管加入200ul(6～8滴)剩下的生理盐水菌悬液至安瓿，仔细混匀，但要避免有气泡产生。

3)盐水菌悬液和接种的AUX培养基分别加入相应的试验条小管，GLU，ADH和CIRE则用矿物油覆盖。

4)盖上培养盒，于30℃培养24小时后观察现象，如表1所示。

表1菌株GLM105生化鉴定结果

底物	结果	底物	结果
				水杨苷	+	山梨醇	+
L-阿拉伯糖	+	鼠李糖	-
				七叶灵	+	蔗糖	-
果糖	+	密二糖	+
				半乳糖	-	苦杏仁苷	+
麦芽糖	+	棉子糖	-
				葡萄糖	+	纤维二糖	+
甘露醇	+	对照	-

注：+：表示反应为阳性；-：表示反应为阴性；

从表1中可以看出，本发明菌株可以水杨苷、L-阿拉伯糖、七叶灵、果糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、密二糖、苦杏仁苷和纤维二糖为碳源。

1.4菌株的分子生物学鉴定

1)利用天跟细菌基因组提取试剂盒(TIANAMP Bacteria DNA Kit)提取菌株GLM105的基因组DNA，步骤按厂家说明书要求所述。利用细菌通用引物27F，1492R扩增菌株16SrDNA片段。

2)如上所述的引物对序列为，1492R：TACCTTGTTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

3)菌株的16S rDNA测序的结果如SEQ ID NO.1。在NCBI上比对后发现其与模式菌株Enterococcus faecium ATCC 19434(T)的相似性为99.92％，综合菌株GLM105有关生理生化指标和分子生物学鉴定结果，结合其形态学特征，我们将其命名为Enterococcus faeciumGLM105，于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.11155。

1.5菌株的功能筛选

1.5.1耐酸性试验。

实验选取前期从健康仔猪肠道、植物、奶酪、市场同类产品等来源分离纯化到乳酸菌菌株作为对照，经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16S rDNA测序等鉴定，这些乳酸菌菌株分别属于粪肠球菌4株、屎肠球菌3株、发酵乳杆菌2株、干酪乳杆菌2株、戊糖乳杆菌2株、植物乳杆菌5株、罗伊氏乳杆菌3株、鼠李糖乳杆菌3株、唾液乳杆菌2株、嗜酸乳杆菌1株。16S rDNA测序比对分析结果见下表2。

表2乳酸菌菌株鉴定结果

1)实验方法：用HCl调节液体培养基至pH 2.0。将菌种以的5％(V/V)的接种量分别接种上述各菌种，37℃静置培养。在接种初始及接种后120min取上述各处理中培养菌液，进行平板计数，从而计算出细菌的存活率，以pH 6.0的菌液为对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH6.0的菌液活菌数×100％。实验结果见表3。

2)实验结果：

表3 GLM105与其它菌株耐酸实验对比结果

由实验结果可知，所分离的菌株在pH 2.0条件下时的存活率分别为1.2％～79.1％，其中菌株GLM105的存活率最高，达到79.1％。

1.5.2抑菌试验。

实验菌株选取实验室前期分离自植物、仔猪肠道等来源的植物乳杆菌，指示菌株选取大肠杆菌(Escherichia coliATCC 8739)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi CMCC(B)50071)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus ATCC 27562)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)。采用牛津杯法，将指示菌株分别涂布于MRS琼脂平板上，每杯加入0.2mL培养24h的乳酸菌培养液，恒温培养箱中培养，观察培养结果，测定平皿内抑菌圈直径大小，实验结果见表4。

1)实验结果：

表4菌株GLM105抑菌实验对比结果

注：实验重复3次，结果为三次平均值。

由实验结果可知，所分离的菌株对常见致病指示菌有良好的抑制作用，且菌株GLM105的对指示菌的抑菌能力都好与其它来源屎肠球菌。

1.5.3耐受胆盐试验。

实验菌株选取实验室前期分离自植物、仔猪肠道等来源的乳酸菌菌株(表2)，菌株培养16h后，在4℃12000g离心4分钟后收集菌体，用PBS溶液冲洗2次。加入含有胆盐0.7％(w/v)的PBS溶液中，37℃培养4h后，稀释至10^-4浓度涂布MRS平板，37℃厌氧培养48h后，观察MRS平板上菌落生长情况。

结果显示，在所有的实验平板中，仅GLM105、GLM271、GLM274、GLM280、GLM321、GLM322、GLM344、GLM347菌落数超过长出1.0*10⁸CFU/ml，其中菌株GLM105的存活量最高，达到3.8*10⁸CFU/ml，具体结果见表5：

表5胆盐0.7％(w/v)处理4h后存活菌量

注：----表示存活乳酸菌菌落数≦1.0*10⁶CFU/ml。

实施例2一种高密度固态发酵培养屎肠球菌的培养基

固态发酵培养基配方为：麦麸22％，豆粕22％，甘蔗糖蜜4％，活性炭3％，碳酸钙5％，β-环状糊精4％，含水量40％，其中百分比均为质量百分比。(除了该配方为，所述固态发酵培养基配方可以为：麦麸15％～25％，豆粕19％～29％，甘蔗糖蜜3％～5％，活性炭2％～4％，碳酸钙2％～6％，β-环状糊精2％～6％，含水量40％～50％，其中百分比均为质量百分比。)

上述培养基的配制方法：先按照常规方法配置基础培养基(麦麸、豆粕和水)，然后加入甘蔗糖蜜、活性炭、碳酸钙、β-环状糊精，搅拌均匀，115℃高压灭菌15min，冷却即可。其中原料中麦麸和豆粕均打碎过50目筛。

实施例3一种高密度固态发酵培养屎肠球菌的方法

1)菌种及其种子液制备

屎肠球菌GLM105菌株在MRS琼脂平板活化，挑取单菌落接种于MRS液体试管，37℃培养24后，以2％v/v接种量转接于MRS液体培养基，培养24后作为种子液。

MRS培养基主要成分是蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6。最适pH 6.0，最适温度37℃，兼性厌氧。

2)接种

以3％v/v接种量将制备的种子液接种到配置的培养基中混匀，即本发明高密度固态培养基(含麦麸22％，豆粕22％，甘蔗糖蜜4％，活性炭3％，碳酸钙5％，β-环状糊精4％，含水量40％，其中百分比均为质量百分比)。

3)发酵

将接好菌种的培养基在30～37℃下密闭发酵48h。然后将发酵产物在55℃下烘干4h，即得菌株GLM105固体发酵产品。

取上述发酵烘干产品，梯度稀释，涂布MRS培养基，厌氧培养48h后，计算菌落数，实验结果显示本发明发酵烘干产品中的活菌含量为3.8*10¹⁰CFU/g。

实施例4菌株GLM105固体发酵产品对保育猪生产性能的影响

1.实验动物与分组

选取35日龄的断奶仔猪，共293头，按照体重相近原则随机分为2个处理。对照组134头仔猪，平均初重9.53kg；实验组159头仔猪，平均初重9.48kg。实验历期50天。

2.实验设计

实验采用武汉安佑102教槽料、4011保育料和天津正大42中猪料。对照组1：基础日粮不添加菌株GLM105固体发酵产品；对照组2：基础日粮添加0.2％(质量百分比)市场某同类产品(与菌株GLM105固体发酵产品类似)；实验组：基础日粮中添加0.2％(质量百分比)菌株GLM105固体发酵产品(即实施例3中的发酵产品)。实验详细设计如表6所示。

表6日粮结构

3.实验时间

2013年3月25日—2013年4月29日

4.菌株GLM105固体发酵产品对保育猪体重增加的影响

体重增加情况如表7所示，实验组初重9.53kg/头，末重36.30kg/头，日增重535.4g；对照组初重9.48kg/头，末重32.24kg/头，日增重455.2g。实验组日增重比对照组多80.2g，在实验期间头均净增重多4.01kg。

表7菌株GLM105固体发酵产品对保育猪体重增加的影响

3.5菌株GLM105固体发酵产品对保育猪成活率的影响

保育猪成活率情况如表8所示，实验组共选取134头仔猪，实验结束时存栏132头，成活率为98.5％；对照组选取159头断奶仔猪，实验结束时存栏156头，成活率为98.1％。实验组比对照组成活率提高0.4％。

表8格莱姆G181#对保育猪成活率的影响

3.6菌株GLM105固体发酵产品对保育猪料肉比的影响

保育阶段的耗料情况如表9所示，在保育阶段，实验组的头均增重为26.77kg，头均耗料为43.18kg，料肉比为1.61；对照组的头均增重为22.76kg，头均耗料为39.29kg，料肉比为1.73。实验组比对照组的料肉比下降了0.12。

表9菌株GLM105固体发酵产品对保育阶段料肉比的影响

上述结果充分说明菌株GLM105固体发酵产品能够显著提高保育仔猪的日增重、成活率和饲料转化率，且效果明显好于市场销售的同类产品，经济效益明显，可作为饲料添加剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广州格拉姆生物科技有限公司

<120> 一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1319

<212> DNA

<213> 植物屎肠球菌 GLM105

<400> 1

ggaaaaagaa gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca tcagaagggg 60

ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaatcg aaaccgcatg gttttgattt 120

gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat ggacccgcgg tgcattagct agttggtgag 180

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tgttagagaa gaacaaggat gagagtaact gttcatccct tgacggtatc taaccagaaa 420

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gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg 780

cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga 840

attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 900

ccttaccagg tcttgacatc ctttgaccac tctagagata gagcttcccc ttcgggggca 960

aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020

gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc catcattcag ttgggcactc tagcaagact 1080

gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1140

gggctacaca cgtgctacaa tgggaagtac aacgagttgc gaagtcgcga ggctaagcta 1200

atctcttaaa gcttctctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca tgaagccgga 1260

atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacaca 1319

Claims (9)

1.一种屎肠球菌（Enterococcus faecium），其分类命名为Enterococcus faecium GLM105，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.11155。

2.权利要求1所述屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105在抑菌中的应用。

3.权利要求1所述屎肠球菌Enterococcus faecium GLM105在制备饲料添加剂中的应用。

4.一种固态发酵培养屎肠球菌的培养基，其特征在于：该培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸15%～25%，豆粕19%～29%，甘蔗糖蜜3%～5%，活性炭2%～4%，碳酸钙2%～6%，β-环状糊精2%～6%和水35%～45%；

所述屎肠球菌为权利要求1所述的屎肠球菌。

5.一种制备屎肠球菌固体发酵产品的方法，其特征在于：该方法为将权利要求1所述的屎肠球菌菌种按2～4％v/v的接种量接种到权利要求4所述的培养基中，于30～37℃的条件下密闭发酵，再将发酵产物于45～60℃烘干，即可。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵时间为24～72h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述烘干的温度为55℃，烘干的时间为4 h。

8.一种屎肠球菌固体发酵产品，其特征在于：其制备方法为权利要求5~7任一所述的方法。

9.权利要求8所述的屎肠球菌固体发酵产品在制备饲料添加剂中的应用。