CN111728081A - 一种饲料添加剂用复合菌发酵液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种饲料添加剂用复合菌发酵液及其制备方法，属于发酵饲料技术领域。本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液，主要由丁酸梭菌发酵离心液和乳酸菌菌株在以下原料的存在下发酵培养得到：糖类碳源；其中，糖类碳源在丁酸梭菌发酵离心液中的质量分数为1％～7％。本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液，通过对丁酸梭菌离心液接种乳酸菌菌种，并加入糖类碳源等营养物质同时对丁酸梭菌离心液中的乳酸菌和残留的丁酸梭菌进行发酵，从而达到利用丁酸梭菌离心液发酵乳酸菌的作用效果。在对丁酸梭菌发酵离心液无害化处理的同时又生产出了可应用于动物养殖产业中的含有大量乳酸菌活菌的丁酸梭菌饲料添加剂。

Description

一种饲料添加剂用复合菌发酵液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种饲料添加剂用复合菌发酵液及其制备方法，属于发酵饲料技术领域。
背景技术
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，又名酪酸菌、宫人菌，在自然界中存在于人与动物粪便、土壤中，为革兰氏阳性，属于梭状芽孢杆菌，厌氧，菌体为直或微弯，孢子圆形或椭圆形，为内生芽孢，常使菌体中部膨大呈梭形；对外界环境有较强的抵抗力，耐热耐酸，经80℃温度下保温30min、90℃温度下保温l0min的热处理后全部存活；加热到90℃温度下保温2min后95％存活；加热到100℃温度下保温5min后80％存活，pH为1.0-5.0时仍能存活、pH为4.0-9.8时能适合其生长。因此，酪酸菌能够抵抗饲料制粒过程中的高温高热，与目前广泛应用的非芽孢类活菌制剂相比，更具市场潜力。根据国内外研究进展，丁酸梭菌能够调整肠道菌群平衡，促进肠道有益菌增殖，增强免疫功能，预防肿瘤，在肠道内产生多种营养物质，如维生素K和B族维生素等。目前的丁酸梭菌主要应用于牲畜养殖和临床治疗感染性腹泻，炎症性肠病，肠易激综合征等因体内正常菌群失衡所引起的相关疾病。
丁酸梭菌发酵包括固态发酵和液体发酵。其中，固态发酵有着生长不易控制，产品不易分离，方法不够成熟等缺点，一般较少采用。目前丁酸梭菌发酵多数采用液体深层发酵法，一般的丁酸梭菌制剂经过液体发酵后采用离心、冻干或者喷雾干燥制得菌粉，但是制备过程中所采用的离心并不能除去所有的菌体及其代谢产物，会有部分菌体残留在离心液中，同时发酵时产生的乙酸、丁酸、淀粉酶、维生素K和B族维生素，以及未利用的培养基成分等也有部分残留在离心液中，离心液直接排放不仅污染水体，也造成了巨大的浪费。关于发酵废液的处理，传统的处理方式主要是作为废水直接处理，达标后排放，这种处理方式给企业造成一定的经济压力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种饲料添加剂用复合菌发酵液，该发酵饲料将丁酸梭菌发酵离心液变废为宝，且同时含有丁酸梭菌和乳酸菌及其代谢产物，效果更好。
本发明的第二个目的在于提供一种饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法。
丁酸梭菌发酵离心液可以直接作为液体饲料添加剂，但是，丁酸梭菌离心液中含有未完全利用的碳源、氮源、无机盐等营养物质，以及丁酸梭菌代谢产生的丁酸、乳酸、小肽、氨基酸、维生素、消化酶等物质，且丁酸梭菌离心液的pH值接近中性，储存过程中容易造成其他杂菌的生长繁殖，造成营养的损失及污染，不易长期储存，因此，为了将丁酸梭菌发酵离心液变废为宝，本发明提供了如下技术方案：
一种饲料添加剂用复合菌发酵液，主要由丁酸梭菌发酵离心液和乳酸菌菌株在以下原料的存在下发酵培养得到：糖类碳源；其中，糖类碳源在丁酸梭菌发酵离心液中的质量分数为1％～7％。
应当理解的是，发酵培养是在密闭的发酵罐中进行的，以100rpm的转速搅拌以保证物料及菌体分布均匀。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液，主要由丁酸梭菌发酵离心液与乳酸菌菌株和糖类碳源发酵得到。乳酸菌的生长降低了离心液的pH值，使得离心液便于储存，同时也丰富了益生菌及代谢产物的种类，制得的饲料添加剂用复合菌发酵液同时含有丁酸梭菌和乳酸菌及其代谢产物。其应用效果为丁酸梭菌、乳酸菌及二者代谢产物共同作用的结果。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液，通过对丁酸梭菌离心液接种乳酸菌菌种，并加入糖类碳源等营养物质同时对丁酸梭菌离心液中的乳酸菌和残留的丁酸梭菌进行发酵，从而达到利用丁酸梭菌离心液发酵乳酸菌的作用效果。在对丁酸梭菌发酵离心液无害化处理的同时又生产出了可应用于动物养殖产业中的含有大量乳酸菌活菌的丁酸梭菌饲料添加剂，有效解决了丁酸梭菌离心液不易污水处理，解决了丁酸梭菌离心液中残留菌体、富营养物质再利用的技术问题。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液中，丁酸梭菌发酵离心液可以是本领域常规的丁酸梭菌发酵离心液，比如，丁酸梭菌发酵离心液中的丁酸梭菌菌株保藏编号为CICC10390。
优选地，所述乳酸菌菌株以乳酸菌菌株溶液的形式存在，乳酸菌菌株溶液的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的1％～10％，所述乳酸菌菌株溶液中乳酸菌菌株的含量为2.0×109～5×1010CFU/mL。
为了在控制成本的同时，得到较高含量的乳酸菌，优选地，乳酸菌菌株的质量为丁酸梭菌发酵离心液体积的5％。
优选地，所述丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为1.0×105～5.0×108CFU/mL。
优选地，所所述乳酸菌菌株为嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌中的一种、两种或三种以上的组合。
嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌可以是本领域常规的菌株，优选地，JBHBS1嗜酸乳杆菌菌株保藏编号为ACCC05489，JBHBSC1粪肠球菌菌株保藏编号为CICC23658，JBHBGL干酪乳杆菌菌株保藏编号为CICC20995。植物乳杆菌简称为JBHBTS，屎肠球菌简称为JBHBS3。
为了进一步提高发酵效果，优选地，所述乳酸菌菌株为嗜酸乳杆菌、粪肠球菌与干酪乳杆菌的组合，其中，嗜酸乳杆菌、粪肠球菌与干酪乳杆菌的浓度比为2～4:1～3:2～4。可以理解的是，乳酸菌菌株以乳酸菌菌液的形式存在，乳酸菌菌液可以是由嗜酸乳杆菌菌液、粪肠球菌菌液与干酪乳杆菌菌液按照1:1:1的体积比混合得到的，且嗜酸乳杆菌菌液中嗜酸乳杆菌的含量为2.0×109～4.0×109CFU/mL，粪肠球菌菌液中粪肠球菌的含量为1.0×109～3.0×109CFU/mL，干酪乳杆菌菌液中干酪乳杆菌的含量为2.0×109～4.0×109CFU/mL。
优选地，所述糖类碳源为葡萄糖、红糖、糖蜜中的一种或两种以上的组合。
为了进一步提高发酵效果，在降低pH的同时提高最终乳酸菌的含量，优选地，所述糖类碳源为葡萄糖与糖蜜的组合，其中，所述葡萄糖的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的2.0％～3.5％，所述糖蜜的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.0％～3.5％。
优选地，所述糖类碳源为葡萄糖与糖蜜的组合，其中，所述葡萄糖的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的2.0％，所述糖蜜的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.5％。
为了进一步在降低pH的同时提高最终乳酸菌的含量，优选地，所述原料还包括氮源，氮源的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的0.5％～2％。
优选地，所述氮源为玉米浆、蛋白胨、酵母膏、牛肉粉、牛肉膏、肽粉中的一种或两种以上的组合。这些氮源均具有良好的效果。
为了进一步控制成本，在降低pH的同时提高最终乳酸菌的含量，优选地，所述氮源为玉米浆，玉米浆的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1％。
为了进一步在降低pH的同时提高最终乳酸菌的含量，优选地，所述原料还包括无机盐，所述无机盐为MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠，其中，MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠在丁酸梭菌发酵离心液中的质量分数为：0.025％～0.075％的MgSO4、0.015％～0.045％的MnSO4、0.1％～0.3％的K2HPO4、0.3％～0.9％的乙酸钠。
优选地，所述MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠在丁酸梭菌发酵离心液中的质量分数为：0.025％的MgSO4、0.015％的MnSO4、0.1％的K2HPO4、0.6％的乙酸钠。
一种饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：将原料和乳酸菌菌株加入丁酸梭菌发酵离心液中，在35～39℃下发酵培养20h以上，即得。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，只需要将原料加入丁酸梭菌发酵离心液中，然后发酵即可，该方法操作简便，适合大规模生产。
为了进一步提高发酵效果，优选地，一种饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将原料和乳酸菌菌株加入丁酸梭菌发酵离心液中，搅拌条件下，在37℃下控温发酵，当pH为4.0～4.6时，停止控温；
(2)然后静置自然发酵，当pH为4.0～4.3时，即得饲料添加剂用复合菌发酵液。
可以理解的是，步骤(2)中，静置自然发酵是在无搅拌下进行发酵，自然发酵的温度可以是20-37℃。
可以理解的是，获得的饲料添加剂用复合菌发酵液可作为液态产品直接作为饲料添加剂使用，也可经作为固体发酵的种子液使用。
优选地，步骤(2)中，饲料添加剂用复合菌发酵液中乳酸菌含量在5.0×109CFU/mL以上。饲料添加剂用复合菌发酵液中乳酸菌含量在5.0×109CFU/mL以上时，在动物肠道中更容易形成优势菌群。
优选地，一种丁酸梭菌离心液发酵乳酸菌的方法，包括以下步骤：
1)将适量的丁酸梭菌离心液抽入已灭菌并控温在37±2℃的发酵罐中；
2)加入2.0％～3.5％葡萄糖，1.0％～3.5％糖蜜作为碳源，0.5％～2.0％的玉米浆作为氮源，0.025％～0.075％MgSO4、0.015％～0.045％MnSO4、0.1％～0.3％K2HPO4、0.3％～0.9％乙酸钠作为发酵所需的无机盐和微量元素；
3)接种1％～10％的JBHBS1:JBHBSC1:JBHBGL＝1:1:1的乳酸菌作为发酵种子；
4)在37±2℃，100rpm的转速发酵18-24h，检测pH，应在4.5左右，停止控温。
5)然后静置自然发酵至96h，每天检测pH，待pH降至4.0-4.3左右，检测24h乳酸菌含量应大于等于5.0×109CFU/ml，然后过滤即得。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液和本发明制得的饲料添加剂用复合菌发酵液可通过拌料、饮水或灌服的方式用于家畜养殖，能够调节肠道微生态平衡，抑制病原菌生长，防止乳仔猪腹泻；提高仔猪采食量，提高饲料利用率，提高仔猪日增重；调节肥猪肠道菌群平衡，改善肠道环境，促进有益菌的定植，减少有害菌；增加后肠菌群优势，促进食靡的再次吸收利用，提高饲料利用率，促进采食，提高生长速度。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液应用在鱼、虾、蟹、海参等水产动物中，能够调节肠道菌群，每升饲料添加剂用复合菌发酵液拌料40公斤，连续用一周，可明显降低白便及肠炎的发生几率；每升饲料添加剂用复合菌发酵液拌料10-20公斤，丁酸梭菌和乳酸菌能调节肠道pH，促进养殖动物肠道的蠕动和消化吸收；还可用来减轻应激反应，改善水质等。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液也可通过饮水的方式应用在禽类养殖上，提升机体非特异性免疫力，提高饲料利用率，降低死淘率，提高蛋禽的产蛋率，降低料蛋比，降低肉禽的料肉比等。
本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液应用在蛋禽上，具有以下优势和作用：
1、促进雏禽卵黄吸收，提高育雏成活率、均匀度。
2、提升蛋禽产蛋率，增加蛋重，延长产蛋高峰，降低产蛋高峰下降速度。
3、改善蛋壳质量，减少沙壳蛋，软壳蛋和破蛋率。
4、维护机体粘膜屏障的完整性，提升机体非特异性免疫力及抗病能力。
5、有效解决肠炎、过料现象，提高蛋禽对饲料的利用率，降低料蛋比。
6、改善养殖环境，降低舍内氨气浓度，减少呼吸道病的发生。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
本发明实施例中，丁酸梭菌离心液所用的丁酸梭菌菌株保藏编号为CICC 10390。
本发明实施例中，JBHBS1嗜酸乳杆菌菌株保藏编号为ACCC05489。
本发明实施例中，JBHBSC1粪肠球菌菌株保藏编号为CICC23658。
本发明实施例中，JBHBGL干酪乳杆菌菌株保藏编号为CICC20995。
本发明实施例中，饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法中，均是在微氧环境中进行的。
本发明实施例中，所使用的乳酸菌菌液中的菌株为JBHBS1嗜酸乳杆菌菌株、JBHBSC1粪肠球菌菌株和JBHBGL干酪乳杆菌菌株的组合，乳酸菌菌液中嗜酸乳杆菌的含量为1.0×109CFU/mL，粪肠球菌的含量为7.0×108CFU/mL，干酪乳杆菌的含量为1.0×109CFU/mL。
一、本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液的具体实施例如下：
实施例1
本实施例的饲料添加剂用复合菌发酵液，由丁酸梭菌发酵离心液和以下原料发酵得到：乳酸菌菌株、糖类碳源、氮源、无机盐。
其中，丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为3.6×107CFU/mL。
乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的5％。
糖类碳源为葡萄糖和糖蜜的组合，葡萄糖的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的2.0％，糖蜜的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.5％。
氮源为玉米浆，玉米浆的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.0％。
无机盐为MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠，MgSO4的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的0.025％，MnSO4的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的0.015％，K2HPO4的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的0.1％，乙酸钠的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的0.6％。
实施例2～实施例4
实施例2～实施例4的饲料添加剂用复合菌发酵液，由丁酸梭菌发酵离心液和以下原料发酵得到：乳酸菌菌株、糖类碳源。
其中，丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为3.6×107CFU/mL。
乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的3％。
糖类碳源为葡萄糖，葡萄糖的浓度如表1所示。
表1葡萄糖的浓度
葡萄糖添加量(g/L)
实施例2 13
实施例3 26
实施例4 35
实施例5～实施例11
实施例5～实施例11的饲料添加剂用复合菌发酵液，由丁酸梭菌发酵离心液和以下原料发酵得到：乳酸菌菌株、糖类碳源。
其中，丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为3.6×107CFU/mL。
乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的3％。
糖类碳源的具体种类及其在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比如表2所示。
表2糖类碳源的具体种类及其在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比
葡萄糖％ 红糖％ 糖蜜％
实施例5 3.5 0 0
实施例6 0 3.5 0
实施例7 2.5 0 1.0
实施例8 2.5 1.0 0
实施例9 2.0 0 1.5
实施例10 2.0 1.5 0
实施例11 0 0 3.5
实施例12～实施例18
实施例12～实施例18的饲料添加剂用复合菌发酵液，由丁酸梭菌发酵离心液和以下原料发酵得到：乳酸菌菌株、糖类碳源、氮源。
其中，丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为3.6×107CFU/mL。
乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的3％。
糖类碳源为葡萄糖和糖蜜的组合，葡萄糖的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的2.0％，糖蜜的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.5％。
氮源的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.0％，氮源的具体种类如表3所示。
表3氮源的具体种类
Figure BDA0002438859130000071
Figure BDA0002438859130000081
实施例19～实施例22
实施例19～实施例22的饲料添加剂用复合菌发酵液，由丁酸梭菌发酵离心液和以下原料发酵得到：乳酸菌菌株、糖类碳源、氮源。
其中，丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为3.6×107CFU/mL。
乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的3％。
糖类碳源为葡萄糖和糖蜜的组合，葡萄糖的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的2.0％，糖蜜的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.5％。
氮源为玉米浆，玉米浆在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比如表4所示。
表4玉米浆在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比
玉米浆用量％
实施例19 0
实施例20 0.5％
实施例21 1％
实施例22 2％
实施例23～实施例31
实施例23～实施例31的饲料添加剂用复合菌发酵液，由丁酸梭菌发酵离心液和以下原料发酵得到：乳酸菌菌株、糖类碳源、氮源、无机盐。
其中，丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为3.6×107CFU/mL。
乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0.×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的3％。
糖类碳源为葡萄糖和糖蜜的组合，葡萄糖的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的2.0％，糖蜜的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.5％。
氮源为玉米浆，玉米浆的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.0％。
无机盐为MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠，MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比如表5所示。
表5 MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(％) MgSO<sub>4</sub>(％) MnSO<sub>4</sub>(％) 乙酸钠(％)
实施例23 0.1 0.025 0.015 0.3
实施例24 0.1 0.05 0.03 0.6
实施例25 0.1 0.075 0.045 0.9
实施例26 0.2 0.025 0.03 0.9
实施例27 0.2 0.05 0.045 0.3
实施例28 0.2 0.075 0.015 0.6
实施例29 0.3 0.025 0.045 0.6
实施例30 0.3 0.05 0.015 0.9
实施例31 0.3 0.075 0.03 0.3
二、本发明的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法的具体实施例如下：
实施例32
本实施例的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，制备的是实施例1的饲料添加剂用复合菌发酵液，步骤如下：
(1)将45L的丁酸梭菌离心液加入已灭菌并控温在37℃的发酵罐中。
(2)向发酵罐中加入碳源、氮源和无机盐。
(3)接种乳酸菌菌株。
(4)在37℃，100rpm的转速下进行发酵，在反应20-24h时检测pH，当pH值首次降至4.0～4.5时，停止控温。
(5)然后静置自然发酵(停止控温，自然发酵有助于降低能源消耗，自然发酵温度在20-37℃范围内即可)至96h，按照如表6所示的时间取样检测pH值及乳酸菌及丁酸梭菌的含量，96h后过滤除去发酵液中残留的不易溶解的物质，即得饲料添加剂用复合菌发酵液，并检测饲料添加剂用复合菌发酵液中淀粉酶、纤维素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、乳酸、乙酸、丁酸、乳酸菌含量、丁酸梭菌含量、pH值，得到的结果如表7所示。
表6发酵各时间的pH值、乳酸菌和丁酸梭菌的含量
时间 pH值 乳酸菌(CFU/ml) 丁酸梭菌(CFU/ml)
0h 5.92 0 3.6×10<sup>7</sup>
8h 5.46 8.7×10<sup>8</sup> 3.7×10<sup>7</sup>
12h 4.99 3.0×10<sup>9</sup> 3.6×10<sup>7</sup>
16h 4.65 6.5×10<sup>9</sup> 3.7×10<sup>7</sup>
20h 4.43 8.4×10<sup>9</sup> 3.5×10<sup>7</sup>
24h 4.41 8.5×10<sup>9</sup> 3.6×10<sup>7</sup>
48h 4.32 8.5×10<sup>9</sup> 3.4×10<sup>7</sup>
72h 4.27 8.3×10<sup>9</sup> 3.5×10<sup>7</sup>
96h 4.18 8.3×10<sup>9</sup> 3.4×10<sup>7</sup>
由表6可知，发酵过程中，整个反应体系中含有的丁酸梭菌在乳酸菌的发酵过程保持相对稳定，不受乳酸菌的生长抑制；随着时间的进行，乳酸菌的浓度逐渐提高，在24h时，乳酸菌的浓度趋于稳定；pH值随着发酵的进行逐渐降低，当发酵时间为72h和96h时，pH值达到了4.3以下，有利于饲料添加剂用复合菌发酵液的长期储存。
表7制得的饲料添加剂用复合菌发酵液中各物质含量
Figure BDA0002438859130000101
Figure BDA0002438859130000111
由表7可知，本实施例制得的饲料添加剂用复合菌发酵液中的丁酸梭菌、乳酸菌及二者代谢产物较多，得到的饲料添加剂用复合菌发酵液中，丁酸梭菌的含量为3.4×107CFU/mL，乳酸菌的含量高达8.2×109CFU/mL，且含有大量的淀粉酶、纤维素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、乳酸、乙酸、丁酸等物质(淀粉酶、纤维素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶有利于动物胃肠道内食靡的消化；乳酸、丁酸、乙酸可提供酸性环境，抑制有害菌生长繁殖，从而优化结肠菌群结构；丁酸可为结肠上皮细胞修复与再生提供能量物质，保持结肠正常的结构与功能，从而稳定水分与矿物盐代谢，保证肠道正常蠕动功能与动物肤色正常及蛋品质量)，且pH仅为4.18，有利于饲料添加剂用复合菌发酵液的长期储存。
实施例33～实施例35
实施例33～实施例35的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，制备的是实施例2～实施例4的饲料添加剂用复合菌发酵液，向丁酸梭菌发酵离心液中加入相应量的葡萄糖，然后接种乳酸菌菌株，在37℃静置发酵，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活如表8所示。
表8葡萄糖用量、pH值及乳酸菌菌活
葡萄糖添加量(g/L) pH 菌活(CFU/mL)
实施例33 13 4.97 9.1×10<sup>8</sup>
实施例34 26 4.79 1.9×10<sup>9</sup>
实施例35 35 4.64 2.4×10<sup>9</sup>
由表8可知，葡萄糖添加量为35g/L时，得到的饲料添加剂用复合菌发酵液的pH较低，且乳酸菌菌活含量较高。
实施例36～实施例42
实施例36～实施例42的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，制备的是实施例5～实施例11的饲料添加剂用复合菌发酵液，向丁酸梭菌发酵离心液中加入相应用量的糖类碳源(用量为在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比)，然后接种乳酸菌菌株，在37℃静置发酵，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活如表9所示。
表9糖类碳源、pH值及乳酸菌菌活
Figure BDA0002438859130000112
Figure BDA0002438859130000121
由表9可知，当糖类碳源为葡萄糖和糖蜜的组合，且葡萄糖的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的2.0％，糖蜜的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的1.5％(实施例40)时，得到的饲料添加剂用复合菌发酵液的pH较低，且乳酸菌菌活含量较高。
实施例43～实施例49
实施例43～实施例49的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，制备的是实施例12～实施例18的饲料添加剂用复合菌发酵液，按照实施例12～实施例18的配方，向丁酸梭菌发酵离心液中加入糖类碳源、氮源，然后接种乳酸菌菌株，在37℃静置发酵，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活如表10所示。
表10氮源的具体种类、pH值及乳酸菌菌活
添加氮源种类 初始pH pH 菌活(CFU/mL)
实施例43 无 6.08 4.53 2.4×10<sup>9</sup>
实施例44 玉米浆 5.82 4.45 2.9×10<sup>9</sup>
实施例45 蛋白胨 6.06 4.45 3.0×10<sup>9</sup>
实施例46 酵母膏 5.98 4.45 2.3×10<sup>9</sup>
实施例47 牛肉粉 6.06 4.45 3.1×10<sup>9</sup>
实施例48 牛肉膏 6.02 4.44 3.0×10<sup>9</sup>
实施例49 肽粉 6.16 4.48 2.9×10<sup>9</sup>
由表10可知，由实施例43～实施例49可知，添加氮源的实施例44～实施例49的pH值更低，且乳酸菌菌活浓度更高，尤其是实施例44的玉米浆，不仅成本很低，而且得到的饲料添加剂用复合菌发酵液的pH值较低，乳酸菌菌活浓度也较高。
实施例50～实施例53
实施例50～实施例53的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，制备的是实施例19～实施例22的饲料添加剂用复合菌发酵液，按照实施例19～实施例22的配方，向丁酸梭菌发酵离心液中加入糖类碳源、氮源，然后接种乳酸菌菌株，在37℃静置发酵，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活如表11所示。
表11玉米浆在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比、pH值及乳酸菌菌活
玉米浆用量％ 初始pH pH 菌活(CFU/mL)
实施例50 0 6.04 4.51 2.2×10<sup>9</sup>
实施例51 0.5％ 5.90 4.44 2.2×10<sup>9</sup>
实施例52 1％ 5.78 4.44 3.3×10<sup>9</sup>
实施例53 2％ 5.63 4.47 2.0×10<sup>9</sup>
由表11可知，玉米浆用量为1％时(实施例52)，得到的饲料添加剂用复合菌发酵液的pH值较低，乳酸菌菌活浓度也较高。
实施例54～实施例62
实施例54～实施例62饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，制备的是实施例23～实施例31的饲料添加剂用复合菌发酵液，按照实施例23～实施例31的配方，向丁酸梭菌发酵离心液中加入糖类碳源、氮源、无机盐，然后接种乳酸菌菌株，在37℃静置发酵，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活如表12所示。
表12各无机盐在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比、pH值及乳酸菌菌活
Figure BDA0002438859130000131
Figure BDA0002438859130000141
由表12可知，乙酸钠、K2HPO4、MgSO4、MnSO4四个因素对活菌数影响的大小顺序为：乙酸钠>K2HPO4>MnSO4>MgSO4，活菌数随K2HPO4、MnSO4、MgSO4用量的增加而增加，乙酸钠的用量过高或者过低都影响活菌数，乙酸钠用量低时，缓冲作用小，不能很好的调节pH，其pH值也都偏低，抑制了乳酸菌的生长；当乙酸钠用量大时，因盐浓度过高使得渗透压过高，不利于细胞的增殖。乙酸钠、K2HPO4、MgSO4、MnSO4用量分别为0.6％，0.1％，0.025％，0.015。
三、相关试验例
试验例1乳酸菌菌株的筛选
为判断各乳酸菌菌株的效果，在丁酸梭菌发酵离心液中不添加其他营养物质，直接接种含有不同的乳酸菌菌株的乳酸菌菌液，乳酸菌菌株在乳酸菌菌液(JBHBS1:JBHBSC1:JBHBGL＝1:1:1)中的总含量为2.7×109CFU/mL，接种量为3％，37℃下静置发酵，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活，各种乳酸菌菌株及对应的pH值及乳酸菌菌活如表13所示。
表13乳酸菌菌株及对应的pH值及乳酸菌菌活
乳酸菌菌株种类及含量 pH值 乳酸菌菌活(CFU/mL)
JBHBS<sub>1</sub>(3.0×10<sup>9</sup>CFU/mL) 5.85 4.5×10<sup>7</sup>
JBHBSC<sub>1</sub>(2.1×10<sup>9</sup>CFU/mL) 5.85 1.3×10<sup>8</sup>
JBHBTS(3.3×10<sup>8</sup>CFU/mL) 5.80 1.7×10<sup>8</sup>
JBHBGL(3.0×10<sup>9</sup>CFU/mL) 5.80 2.0×10<sup>8</sup>
JBHBS<sub>3</sub>(2.6×10<sup>9</sup>CFU/mL) 5.81 7.3×10<sup>7</sup>
JBHBS<sub>1</sub>:JBHBSC<sub>1</sub>:JBHBGL＝1:1:1 5.60 5.2×10<sup>8</sup>
由表13可知，乳酸菌菌株为JBHBS1:JBHBSC1:JBHBGL＝1:1:1(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)时，发酵20h后pH值最低，乳酸菌菌活含量最高。因此，选择JBHBS1:JBHBSC1:JBHBGL＝1:1:1(质量比)作为菌种。JBHBS1为嗜酸乳杆菌，JBHBSC1为粪肠球菌，JBHBGL为干酪乳杆菌，嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、干酪乳杆菌均被我国农业部列入《饲料添加剂品种目录(2013)》，且这三株菌我公司均送到权威检测机构进行过菌种鉴定。
将实施例1中的乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS1的含量为1.0×109CFU/mL，JBHBSC1的含量为7.0×108CFU/mL，JBHBGL的含量为1.0×109CFU/mL)分别替换为仅含JBHBTS的乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBTS的含量为3.3×108CFU/mL)和仅含JBHBS3的乳酸菌菌液(乳酸菌菌液中JBHBS3的含量为2.6×109CFU/mL)，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活如表14所示。
表14 JBHBTS和JBHBS3的发酵后的pH值及乳酸菌菌活
乳酸菌菌株种类 pH值 乳酸菌菌活(CFU/mL)
JBHBTS 4.57 5.7×10<sup>9</sup>
JBHBS<sub>3</sub> 4.59 5.3×10<sup>9</sup>
由表14可知，如果按照实施例1的方式加入糖类碳源、氮源、无机盐，仅含JBHBTS的乳酸菌菌液和仅含JBHBS3的乳酸菌菌液也具有良好的发酵效果，发酵20h即可使得pH降低至4.6以下，乳酸菌菌活达到5×109CFU/mL以上。
试验例2
为确定乳酸菌菌株的接种量，选择JBHBS1:JBHBSC1:JBHBGL＝1:1:1(乳酸菌菌液中嗜酸乳杆菌的含量为1.0×109CFU/mL，粪肠球菌的含量为7.0×108CFU/mL，干酪乳杆菌的含量为1.0×109CFU/mL)作为菌种，在丁酸梭菌发酵离心液中接种不同量的乳酸菌菌株，接种量如表15所示，37℃下静置发酵，检测发酵20h后的pH值及乳酸菌菌活，乳酸菌菌株的用量及各用量(在丁酸梭菌发酵离心液中所占的质量百分比)对应的pH值及乳酸菌菌活如表15所示。
表15乳酸菌菌株的用量及各用量对应的pH值及乳酸菌菌活
接种量％ 1 3 5 7 10
活菌数(CFU/mL) 2.7×10<sup>9</sup> 6.4×10<sup>9</sup> 7.5×10<sup>9</sup> 7.8×10<sup>9</sup> 7.9×10<sup>9</sup>
pH值 4.72 4.47 4.35 4.34 4.34
由表15可知，在一定接种量范围内(1％～5％)，随接种量的增加，乳酸菌菌活也提高，发酵液pH值降低，但在接种量5％以后，继续增加接种量对乳酸菌菌活的提高不明显，pH值也不再降低，本着降低成本的原则，优选接种量为5％。
试验例3
取实施例1的饲料添加剂用复合菌发酵液1L，然后兑水1-2吨，供海兰褐蛋鸡自由饮用，考察其对海兰褐蛋鸡产蛋能力的影响。
选用430日龄1800只海兰褐蛋鸡为研究对象，试验共分为3组，每组600只，设3个重复，每个重复200只，空白对照组为基础日粮组，饮水中不添加该饲料添加剂，实验组1为1L本品兑水1吨，实验组2为1L本品兑水2吨，预饲期7天，饲养期60天。
试验期间，每天观察海兰褐蛋鸡的粪便情况，统计每组产蛋数量，并对每组蛋重量进行称重，观察鸡蛋的蛋壳，每周统计耗料量，计算日只采食量、产蛋率、每组鸡蛋的平均蛋重以及料蛋比，得到的结果如表16所示。
表16日只采食量、产蛋率、每组鸡蛋的平均蛋重以及料蛋比
项目 日只采食量(g) 平均蛋重(g) 料蛋比 产蛋率
对照组 105.43 57.29 2.040 91.77％
实验组1 105.84 58.43 1.885 94.53％
实验组2 105.89 58.35 1.892 94.62％
每天的观察中发现，实验组明显比对照组粪便量变少，成型度好，蛋壳表面光滑，颜色均一，不易破碎；由表16可知，饲料转化率明显提高，蛋重有较为明显的增加，料蛋比明显下降，产蛋率也得到了明显的提升，在蛋鸡的应用上效果显著。

Claims (10)

1.一种饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，主要由丁酸梭菌发酵离心液和乳酸菌菌株在以下原料的存在下发酵培养得到：糖类碳源；
其中，糖类碳源在丁酸梭菌发酵离心液中的质量分数为1％～7％。
2.根据权利要求1所述的饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，所述乳酸菌菌株以乳酸菌菌株溶液的形式存在，乳酸菌菌株溶液的体积为丁酸梭菌发酵离心液体积的1％～10％，所述乳酸菌菌株溶液中乳酸菌菌株的含量为2.0×109～5×1010CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，所述丁酸梭菌发酵离心液中丁酸梭菌的含量为1.0×105～5.0×108CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，所述乳酸菌菌株为嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌中的一种、两种或三种以上的组合。
5.根据权利要求4所述的饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，所述乳酸菌菌株为嗜酸乳杆菌、粪肠球菌与干酪乳杆菌的组合，其中，嗜酸乳杆菌、粪肠球菌与干酪乳杆菌的浓度比为2～4:1～3:2～4。
6.根据权利要求1所述的饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，所述糖类碳源为葡萄糖、红糖、糖蜜中的一种或两种以上的组合。
7.根据权利要求1～6任一项所述的饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，所述原料还包括氮源，氮源的质量为丁酸梭菌发酵离心液质量的0.5％～2％。
8.根据权利要求1～6任一项所述的饲料添加剂用复合菌发酵液，其特征在于，所述原料还包括无机盐，所述无机盐为MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠，其中，MgSO4、MnSO4、K2HPO4和乙酸钠在丁酸梭菌发酵离心液中的质量分数为：
0.025％～0.075％的MgSO4、0.015％～0.045％的MnSO4、0.1％～0.3％的K2HPO4、0.3％～0.9％的乙酸钠。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将原料和乳酸菌菌株加入丁酸梭菌发酵离心液中，在35～39℃下发酵培养20h以上，即得。
10.根据权利要求9所述的饲料添加剂用复合菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将原料和乳酸菌菌株加入丁酸梭菌发酵离心液中，搅拌条件下，在37℃下控温发酵，当pH为4.0～4.6时，停止控温；
(2)然后静置自然发酵，当pH为4.0～4.3时，即得饲料添加剂用复合菌发酵液。
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