CN113773996A

CN113773996A - 一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113773996A
Application number: CN202111125288.1A
Authority: CN
Inventors: 郝宁; 卢宗梅; 郭格格; 周勇; 李涛; 陈影; 庞靖瀛; 刘利利; 佟毅; 仲磊
Original assignee: Nanjing Tech University; Cofco Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Tech University; Cofco Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2021-12-10

Abstract

本发明公开了一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法及其应用，将枯草芽孢杆菌进行高密度液态发酵后进行处理添加保护剂冷冻干燥制成菌剂作为饲用添加剂。菌株在发酵过程中种子液的接种量2%~10%（V/V）接入发酵培养基中，温度25℃~42℃，发酵20 h~48 h，菌落数为5.8*10¹⁰cfu/g。发酵培养基中包括糖蜜、玉米粉、豆渣等，从而显著降低生产成本。本发明发酵生产菌落数较传统发酵技术而言，菌落数明显增高，发酵周期短，安全环保，同时还采用豆渣、糖蜜等粗原料进行发酵生产，可用作饲料添加剂，改善畜禽的肠道环境，增强动物免疫力，促进动物生长的明显效果，将豆渣这类生产废弃物变废为宝，实现废弃资源的再利用，减少废弃材料对环境的污染，大大降低生产成本。

Description

一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物饲料添加剂及制备技术领域，具体涉及一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法及其应用。

背景技术

益生菌(probioty)，是一类通过调节动物肠道内微生物平衡，促进动物胃肠道内正常菌群生长繁殖，并且抑制病原致病菌群生长繁殖，从而提高动物生长性能的活菌制剂，同时益生菌替代抗菌素做为兽药和饲料添加剂受到广泛重视和应用。枯草芽孢杆菌可以改善宿主肠道细菌生态系统的平衡，并且有效的分解豆渣中的抗营养因子，使发酵豆渣及黄浆水中营养物质更加均衡。

枯草芽孢杆菌能与致病菌竞争，抑制有害菌的繁殖，改善肠道内环境，调整胃肠道菌群平衡，提高动物健康水平。在养猪生产中，应用枯草芽孢杆菌制剂可以达到提高日增重、改善料重比、增强机体抗病力、提高成活率、降低腹泻率、提高经济效益的效果，目前，报道的枯草芽孢杆菌仍存在菌落数较低、粗蛋白含量及氨基酸的含量偏低等问题，本发明中的枯草芽孢杆菌具备明显的优势，特别是益生菌数高、含有大量的粗蛋白、氨基酸等有效成分，对仔猪的喂养有明显的增重、减少腹泻和减少死亡率的效果。同时还能分解蛋白、淀粉、纤维素等组分，分解成小分子蛋白、小肽、游离氨基酸等易消化的成分，更利于畜禽肠道吸收。长期使用富含益生菌的饲料，能够改善畜禽的肠道环境，增强动物免疫力，促进动物生长的明显效果，有效地保障家畜产品的食用安全性。

江苏是大豆生产大省，每年会产生大量的黄浆水及豆渣。据不完全统计，我国每年豆制品的生产量较大，但其生产过程中的黄浆水的利用率却极低，大部分黄浆水和豆渣被当做废弃物直接排出、扔掉，造成环境污染和资源浪费。目前的报道中糖蜜和豆渣尚未出现将两者混合一起用枯草芽孢杆菌进行发酵生产饲用益生菌剂的先例。将二者共同发酵处理，能提高处理效率，改善处理效果，降低成本，进一步实现资源化利用的需求，具有广阔的市场前景，为此我们提出了新型的饲用益生菌剂方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法及其应用，所提供的枯草芽孢杆菌益生菌剂能够大大降低生产成本，提高经济效益，增强动物免疫力，改善畜禽的肠道环境，促进动物生长的明显效果。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，将枯草芽孢杆菌液态发酵后按照总接种量1％～10％(V/V)接入发酵培养基中，温度25℃～42℃，发酵24h～48h，所述发酵培养基配方为：豆渣15～30g/L，玉米粉20～30g/L，硫酸铵5～10g/L，糖蜜5～10g/L，氯化钠1～5g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨1～5g/L，氯化钙0.1～1g/L，磷酸氢二钠0.1～1g/L，磷酸二氢钠0.1～2g/L，豆腐黄浆水替代水作为液体补充，混合搅拌，110℃灭菌20分钟。

所述枯草芽孢杆菌益生菌剂的活菌含量在5.8*10¹⁰cfu/g以上。

所述用于一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，包括如下步骤，

(1)菌株平板、液体培养

枯草芽孢杆菌LB固体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂20g，加蒸馏水至1000ml，121℃灭菌20min；

枯草芽孢杆菌LB液体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，加蒸馏水至1000ml，121℃灭菌20min；

所述枯草芽孢杆菌，首先用固体培养基进行平板培养，培养的温度为37℃、培养时间为16～20h，接着用液体培养基进行摇瓶培养，接着按照5％(V/V)接种量接入液体培养基作为一级种子液，然后按照5％(V/V)接种量接入液体培养基作为二级种子液。所述枯草芽孢杆菌，保藏号CGMCC No.13932，首先用固体培养基进行平板培养，接着用液体培养基进行摇瓶培养，接着按照5％(V/V)接种量接入液体培养基作为一级种子液，然后按照5％(V/V)接种量接入液体培养基作为二级种子液。

(2)发酵培养基：豆渣15～30g/L，玉米粉20～30g/L，硫酸铵5～10g/L，糖蜜5～10g/L，氯化钠1～5g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨1～5g/L，氯化钙0.1～1g/L，磷酸氢二钠0.1～1g/L，磷酸二氢钠0.1～2g/L，黄浆水替代水作为液体补充，混合搅拌，110℃灭菌20分钟。

(3)枯草芽孢杆菌发酵工艺

将步骤(1)种子液培养后的枯草芽孢杆菌采用比浊法调整浓度，按照总接种量2％～10％(V/V)接入步骤(2)中制备的发酵培养基中，温度25℃～42℃，发酵24h～48h。

(4)对发酵产物直接进行处理，添加保护剂后进行冷冻干燥，即得饲料添加剂成品。

所述接种量优选为4％-6％(V/V)；发酵温度优选为32～37℃。

所述的保护剂为菊粉、麦芽糊精或者淀粉中的一种或几种混合，优选菊粉与麦芽糊精按质量比1:0.5混合而成，所述的保护剂的用量为15％～35％。

本发明中的饲料添加剂，其益生菌数高、含有大量的粗蛋白等成分。

本发明具有以下优点：

1.发酵菌株的创新，选择枯草芽孢杆菌CGMCC No.13932为饲用益生菌剂，该生产菌株生长较快、发酵周期较短、菌落数较高、粗蛋白产量高，适应多种条件，具有调整动物肠道微生物平衡、提高动物饲料转化率并同时有效的提高机体免疫力等作用。

2.发酵培养基的创新，利用豆渣和糖蜜成分进行发酵培养，大大降低生产成本，变废为宝，较一般的仔猪饲料添加剂而言，该培养方式能够明显提高菌落数以及粗蛋白的含量利于饲料生产，一定程度上也提高生产的综合效益。

3.发酵工艺简单、易操作。

具体实施方式

通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。

实施例1：

分别将种子液不同的接种量比例的接入发酵培养基，进行发酵实验，接种比例分别为1％、3％、5％、7％、9％，发酵温度为37℃、培养时间为16～20h，发酵的培养基为豆渣21g/L，玉米粉25g/L，硫酸铵6.5g/L，糖蜜10g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.25g/L，酵母粉12g/L，蛋白胨3g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸氢二钠0.2g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，黄浆水替代水作为液体补充，混合搅拌，110℃灭菌。测定菌剂的菌落数，粗蛋白结果见表1。

表1不同菌种比例对发酵中活菌数的影响

种子液比例	总菌落数，cfu/mL	粗蛋白，％
			2％	1.24×10<sup>8</sup>	20.34±0.04
4％	1.23×10<sup>9</sup>	22.24±0.03
			6％	5.60×10<sup>9</sup>	23.15±0.02
8％	7.80×10<sup>8</sup>	19.23±0.01
			10％	4.80×10<sup>7</sup>	18.15±0.03

实施例2：

将按5％(V/V)的接种量接入发酵培养基，发酵温度为25℃、30℃、32℃、35℃、37℃、42℃，接种量为6％、培养时间为16～20h，发酵的培养基为豆渣25g/L，玉米粉25g/L，硫酸铵8g/L，糖蜜6g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.15g/L，酵母粉20g/L，蛋白胨5g/L，氯化钙0.5g/L，磷酸氢二钠0.2g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，黄浆水替代水作为液体补充，混合搅拌，110℃灭菌。，测定总菌落数，cfu/mL，粗蛋白，％，结果见表2。因此，最佳发酵温度为37℃。

表2不同发酵温度对发酵产物各理化指标的影响

发酵温度，℃	总菌落数，cfu/mL	粗蛋白，％
			25	2.34×10<sup>7</sup>	17.16±0.04
30	5.80×10<sup>8</sup>	19.44±0.03
			32	1.24×10<sup>9</sup>	21.13±0.03
35	2.56×10<sup>9</sup>	22.31±0.02
			37	8.10×10<sup>9</sup>	24.15±0.01
42	7.80×10<sup>7</sup>	18.16±0.04

实施例3：

本发明对一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法及其应用进行了考察，对以下三种培养基进行比较：(1)培养基A：豆渣25g/L，玉米粉25g/L，硫酸铵8g/L，糖蜜8g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.3g/L，酵母粉20g/L，蛋白胨4g/L，氯化钙0.5g/L，磷酸氢二钠0.3g/L，磷酸二氢钠0.3g/L，黄浆水替代水作为液体补充；(2)培养基B：葡萄糖20g/L，玉米粉25g/L，硫酸铵8g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.3g/L，酵母粉20g/L，蛋白胨3g/L，氯化钙0.6g/L，磷酸氢二钠0.2g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，水作为液体补充，；(3)培养基C：葡萄糖30g/L，玉米粉25g/L，硫酸铵10g/L，糖蜜8g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.4g/L，酵母粉20g/L，蛋白胨5g/L，氯化钙0.6g/L，磷酸氢二钠0.3g/L，磷酸二氢钠0.3g/L，水作为液体补充，发酵时间18h、发酵温度37℃，接种量为6％，结果见表3。加入适量的豆渣、糖蜜和黄浆水，一定程度上能够降低了生产成本，提高了生产的综合效益。

表3不同发酵培养基对发酵产物各理化指标的影响

发酵培养基	总菌落数，cfu/g	粗蛋白，％
			A	8.20×10<sup>9</sup>	23.68±0.02
B	2.85×10<sup>8</sup>	20.01±0.01
			C	1.34×10<sup>9</sup>	21.35±0.03

实施例4：

将枯草芽孢杆菌的种子液以5％的接种量接入发酵培养基，在37℃下培养24h。对发酵产物进行处理，添加不同保护剂(菊粉、麦芽糊精、淀粉)添加量为27％，冷冻干燥，即得饲料添加剂成品，测定菌落数。

表4不同保护剂对发酵产物各理化指标的影响

保护剂	总菌落数，cfu/g	粗蛋白(干基计)，％
			菊粉+麦芽糊精(1:0.5)	7.98×10<sup>10</sup>	24.16±0.03
麦芽糊精	2.36×10<sup>10</sup>	21.25±0.02
			麦芽糊精+淀粉(1:0.5)	3.56×10<sup>10</sup>	23.15±0.04
菊粉	1.34×10<sup>10</sup>	20.11±0.01

实施例5：

将所制得饲料添加剂以0.02％(w/w)的比例添加到饲料中作为试验组，同时以未添加本发明饲料添加剂作为空白对照组，进行试验。仔猪自由采食，饲喂50天，饲喂结果如表:5。

表5本发明益生菌剂饲料添加剂对断奶仔猪的影响

由表4可以看出：和空白对照组相比，在饲料中添加本发明枯草芽孢杆菌益生菌剂饲料添加剂的试验组断奶仔猪日增重提高40.00％，料肉比降低8.556％，腹泻率降低57.14％，成活率提高2.631％。

总菌落数的测定

参考国标GB 4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定。

粗蛋白质(干基计)的测定

参考国标GB/T 6432饲料中粗蛋白测定方法。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）枯草芽孢杆菌首先用固体培养基进行平板培养，接着用液体培养基进行摇瓶培养，接入液体培养基作为一级种子液，再接入液体培养基作为二级种子液；

2）将步骤（1）种子液培养后的枯草芽孢杆菌调整浓度，然后按照接种量1%~10%（V/V）接入发酵培养基中，温度25 ℃~42 ℃，好氧发酵24 h~48 h；

3) 对发酵产物进行处理，并且在菌体中添加保护剂后进行冷冻干燥，即得饲料添加剂成品;

步骤2）中所述发酵培养基为豆渣 15~30 g/L，玉米粉 20~30 g/L，硫酸铵 5~10 g/L，糖蜜5~10 g/L，氯化钠1~5 g/L，硫酸镁0.1~0.5g/L，酵母粉10~20g/L，蛋白胨1~5g/L，氯化钙0.1~1g/L，磷酸氢二钠0.1~1g/L，磷酸二氢钠 0.1~2g/L，黄浆水替代水作为液体补充，混合搅拌，110℃灭菌。

2.根据权利要求1所述一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤1)所述固体培养基为：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10g、琼脂20 g，加蒸馏水至1000 ml，121℃灭菌20 min。

3.根据权利要求1所述一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤1)所述液体培养基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10g，加蒸馏水至1000 ml，121℃灭菌20 min。

4.根据权利要求1所述一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的保护剂为菊粉、麦芽糊精或者淀粉中的一种或几种混合。

5.根据权利要求1所述一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述接种量为4%-6%（V/V）。

6.根据权利要求1所述一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤2）中发酵温度为32~37℃。

7.根据权利要求1所述一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的保护剂的添加量为15%~35%。

8.根据权利要求1所述一种饲用枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为保藏号CGMCC No .13932的枯草芽孢杆菌。

9.权利要求1至8中制备得到的饲用枯草芽孢杆菌在作为饲料添加剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌以质量比0.02%~0.06%的比例添加到饲料中。