CN111733091B

CN111733091B - 一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基及其制备方法、枯草芽孢杆菌制剂的制备方法

Info

Publication number: CN111733091B
Application number: CN202010239413.0A
Authority: CN
Inventors: 朱广跃; 李克克; 谢璐璐; 冯利菲; 李光华; 韩亚坤; 买超梁; 韩娅楠
Original assignee: Henan Jinbaihe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Henan Jinbaihe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111733091A

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基及其制备方法、枯草芽孢杆菌制剂的制备方法。该发酵培养基由豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、无机盐、蛋白酶、淀粉酶与水制成，各组分的用量为：豆粕粉63～74g/L，玉米淀粉82～90g/L，玉米浆5～7g/L，牛肉膏2～3g/L，蛋白胨8～12g/L，葡萄糖8～12g/L，蛋白酶2～3g/L，淀粉酶2～3g/L，无机盐5.73～11.08g/L，其中蛋白酶的酶活力为1800～2000U/g，淀粉酶的酶活力为1800～2000U/g。本发明的发酵培养基能够为枯草芽孢杆菌提供适宜生长的营养环境，提高发酵液中的活菌数、芽孢数。

Description

一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基及其制备方法、枯草芽孢杆菌制剂的制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基及其制备方法、枯草芽孢杆菌制剂的制备方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，因易在枯草浸汁中繁殖而得名。枯草芽孢杆菌无荚膜，有鞭毛，能活动，革兰氏染色为阳性，芽孢((0.6～0.9)μm×(1.0～1.5)μm)位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时常形成皱壁，为好氧型细菌；可以利用蛋白质、多种糖，分解色氨酸。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的益生菌之一，相对其他益生菌，是较早应用到饲料中的微生态制剂，其可有效调节动物肠道微生态平衡。枯草芽孢杆菌为需氧菌，其产酶能力较强，能产生蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等，同时可降解饲料中的抗营养因子，提高动物的消化吸收率，从而促进动物生长。

枯草芽孢杆菌对动物肠道的调节主要表现为以下几点：(1)枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。(2)枯草芽孢杆菌迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长。(3)刺激动物(人体)免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。(3)枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。(4)能合成维生素B₁、B₂、B₆、烟酸等多种B族维生素，提高动物体(人体)内干扰素和巨噬细胞的活性。

目前，枯草芽孢杆菌已经广泛应用到的畜牧业动物保健、微生物菌肥等领域，由于微生态产业在我国起步较晚，行业内产品质量参差不齐，枯草芽孢杆菌制剂中活菌数较低、芽孢数较低。申请公布号为CN106947715A的中国发明专利申请中公开一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的制备方法，采用由碳源、氮源、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、高温淀粉酶组成的液体发酵培养基，发酵时分时间段控制温度及风量，发酵共24h，所得枯草芽孢杆菌发酵液中活菌数最高为160亿cfu/mL，芽孢率最高为96％。

现有发酵工艺所得的枯草芽孢杆菌发酵液中活菌数不高、芽孢率较低，并且培养时间长、稳定性较差，枯草芽孢杆菌的发酵工艺水平急需提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基，以解决现有的枯草芽孢杆菌用发酵培养基所得发酵液中活菌数低、芽孢率低的问题。

本发明的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基的制备方法，以解决现有的制备方法所得的枯草芽孢杆菌用发酵培养基用于枯草芽孢杆菌发酵培养时活菌数低、芽孢率低的问题。

本发明的第三个目的是提供一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，以解决现有的制备方法发酵培养时间长、稳定性差，并且发酵液中活菌数不高、芽孢率较低的问题。

为实现上述目的，本发明的枯草芽孢杆菌用发酵培养基的具体技术方案为：

一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基，由豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、无机盐、蛋白酶、淀粉酶与水制成，各组分的用量为：豆粕粉63～74g/L，玉米淀粉82～90g/L，玉米浆5～7g/L，牛肉膏2～3g/L，蛋白胨8～12g/L，葡萄糖8～12g/L，蛋白酶2～3g/L，淀粉酶2～3g/L，无机盐5.73～11.08g/L，其中蛋白酶的酶活力为1800～2000U/g，淀粉酶的酶活力为1800～2000U/g。

本发明的枯草芽孢杆菌用发酵培养基，以葡萄糖、玉米淀粉作为碳源，其中葡萄糖为速效碳源，玉米淀粉为缓效碳源；豆粕粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨作为氮源，其中豆粕粉为缓效氮源，玉米浆、牛肉膏、蛋白胨为速效氮源；培养基中碳源、氮源配比合理，并且各自组成中的速效组分、迟效组分也配比合理，有利于为枯草芽孢杆菌提供适宜生长的营养环境；无机盐中包括枯草芽孢杆菌生长所需的大量元素磷、硫、钾、钠、钙、铁等及微量元素锰。

本发明选用成本较低的豆粕粉和玉米淀粉作为主要原料，降低了生产成本；通过豆粕粉和玉米淀粉的分步酶解，提高了发酵培养基的营养成分和利用效率；豆粕粉酶解后剩余的颗粒物经过枯草芽孢杆菌分泌的多种酶的共同作用形成了多孔状结构，使得芽孢可以进入其中得到保护，提高了枯草芽孢杆菌制剂的稳定性。

进一步的，选用常用的化学试剂作为无机盐的来源，枯草芽孢杆菌用发酵培养基中无机盐为：氯化钠2～4g/L，碳酸钙3～5g/L，磷酸氢二钾0.4～1.2g/L，氯化铁0.3～0.8g/L，硫酸锰0.03～0.08g/L。

上述发酵培养基中所用玉米浆中干物质含量为46.6～49.2％，总氮含量为3.33～3.67％。

本发明的枯草芽孢杆菌用发酵培养基的制备方法的具体技术方案为：

一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：将豆粕粉、玉米粉与水混匀，加入蛋白酶酶解，再加入淀粉酶酶解，加入玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、无机盐，混匀，即可。

本发明的枯草芽孢杆菌用发酵培养基的制备方法，先将难以被枯草芽孢杆菌直接吸收利用的豆粕粉、玉米粉通过蛋白酶、淀粉酶分步酶解，利于充分发挥发酵培养基中营养成分的作用，提高发酵培养基中营养成分的利用率。

进一步的，选择蛋白酶、淀粉酶的合适酶解温度以提高酶解效率，蛋白酶酶解的温度为40～45℃，时间为2～3h，所述淀粉酶酶解的温度为65～70℃，时间为2～3h。

本发明的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法的具体技术方案为：

一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌种子液接种到枯草芽孢杆菌用发酵培养基中，在37～40℃培养18～20h，然后升温至45～50℃，维持2～3h，再降温至常温，发酵结束。

本发明的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，在枯草芽孢杆菌发酵培养结束前，提高发酵温度，可以为枯草芽孢杆菌提供一个抗逆性环境，有效提高枯草芽孢杆菌的转孢率，转孢率可达99％以上。

进一步的，枯草芽孢杆菌种子液的浓度为1～10亿cfu/mL，以使枯草芽孢杆菌菌种在发酵罐中的密度适宜，利于菌体生长、增殖。

为维持发酵液中枯草芽孢杆菌较高的芽孢率，将发酵液升温、保温后迅速降温，降温的速率为2～10℃/min。

为保证枯草芽孢杆菌菌种在发酵罐中的密度适宜，利于菌体生长，接种的体积百分比为8～12％。

一般的，发酵培养的搅拌速度为170～240r/min。

为使种子液接种到发酵培养基后能够迅速增殖，选择生命力旺盛的处于对数期的种子，种子液的制备包括以下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌菌种接种到一级种子培养基中，37～40℃培养6～8h，得到种子培养液；

(2)将步骤(1)所得种子培养液以体积百分比1-5％接种到二级种子培养基中，37～40℃培养4～6h。

为在短时间内获得数量大、质量高的枯草芽孢杆菌菌种，以满足后续发酵生产的需要，选择营养丰富、完全的营养物质，选择容易被菌体吸收利用的碳源和氮源。所述一级种子培养基由牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖及水制成，各组分的用量为：牛肉膏3～6g/L，蛋白胨9～13g/L，氯化钠4～6g/L，葡萄糖6～9g/L。所述二级种子培养基由牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖及水制成，各组分的用量为：牛肉膏3～6g/L，酵母膏2～4g/L，蛋白胨14～18g/L，氯化钠4～6g/L，葡萄糖12～18g/L。一级种子培养基的作用是让处于休眠状态的枯草芽孢杆菌芽孢快速萌发，转变为生殖体并快速增殖，所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖；二级种子培养基是为了让枯草芽孢杆菌能够持续快速增殖，获得大量茁壮的枯草芽孢杆菌生殖体，也更接近与发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。

附图说明

图1为本发明实施例5及对比例3的枯草芽孢杆菌制剂的稳定性实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例具体说明本发明所述方法的应用。特别需要指出的是，本发明说明书所举实施例只是为了帮助理解本发明，它们不具任何限制作用，即本发明除说明书所举实施例外，还可以有其他实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围中。

一、本发明的枯草芽孢杆菌用发酵培养基的具体实施例

实施例1

本实施例的发酵培养基组成为：豆粕粉72g/L，玉米淀粉88g/L，玉米浆5g/L，牛肉膏2.6g/L，蛋白胨11.4g/L，氯化钠3.2g/L，葡萄糖10.2g/L，碳酸钙4.5g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化铁0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，蛋白酶(2000U/g)2.8g/L，淀粉酶(2000U/g)2.8g/L，其中，玉米浆中干物质含量为47.3％，总氮含量为3.47％。

实施例2

本实施例的发酵培养基组成为：豆粕粉64g/L，玉米淀粉84g/L，玉米浆6.8g/L，牛肉膏2.2g/L，蛋白胨11.6g/L，氯化钠3.8g/L，葡萄糖12.0g/L，碳酸钙4.8g/L，磷酸氢二钾0.9g/L，氯化铁2.2g/L，硫酸锰0.04g/L，蛋白酶(2000U/g)2.2g/L，淀粉酶(2000U/g)2.2g/L，其中，玉米浆中干物质含量为49.0％，总氮含量为3.62％。

实施例3

本实施例的发酵培养基组成为：豆粕粉70g/L，玉米淀粉83g/L，玉米浆5.5g/L，牛肉膏2.7g/L，蛋白胨8.1g/L，氯化钠2.2g/L，葡萄糖8.4g/L，碳酸钙3.7g/L，磷酸氢二钾0.7g/L，氯化铁0.7g/L，硫酸锰0.06g/L，蛋白酶(1800U/g)2.9g/L，淀粉酶(1800U/g)3.0g/L，其中，玉米浆中干物质含量为48.0％，总氮含量为3.52％。

二、本发明的枯草芽孢杆菌用发酵培养基的制备方法的具体实施例

实施例4

本实施例对实施例1中的枯草芽孢杆菌发酵培养基的制备方法进行说明，具体包括以下步骤：将称量好的豆粕粉和玉米淀粉放入烧杯中，然后加入适量的水，边加入边搅拌，直到溶液变成稀糊状，然后加热到40～45℃，投入称量好的蛋白酶，继续保温2.5h；保温完成后继续升温至65～70℃，投入称量好的淀粉酶，继续保温2.5h；保温完成后投入其余物料，混合均匀，补足水，即可。

在其他枯草芽孢杆菌用发酵培养基的制备方法的实施例中，具体步骤与实施例4中相同。

三、本发明的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法的具体实施例

实施例5

本实施例的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌从斜面接种到一级种子培养基，37℃培养6.5h，得到种子培养液，搅拌速度为180r/min，，其中，一级种子培养基的组成为：牛肉膏4g/L，蛋白胨12g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖6.5g/L；

(2)将步骤(1)中所得种子培养液以体积百分比2％的接种量接种到二级种子培养基，37℃培养4h，得到浓度为2×10⁸cfu/mL的种子液，搅拌速度为180r/min，，其中，二级种子培养基的组成为：牛肉膏5g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨14g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖14g/L；

(3)将步骤(2)中所得种子液按体积百分比10％的接种量接种到实施例4的发酵培养基中，37℃继续培养18h，搅拌速度180r/min，将发酵温度升高到45℃，维持2.0h，然后以4～6℃/min迅速降温到常温，发酵结束。

四、对比例

对比例1

本对比例的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法与实施例5相同，区别在于：步骤(3)为将步骤(2)中所得种子液按体积百分比10％的接种量接种到发酵培养基中，37℃继续培养18h，发酵结束。

对比例2

本对比例的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法与实施例5相同，区别在于：发酵培养基中添加的蛋白酶、淀粉酶为经121℃灭菌20min的失活酶。

对比例3

本对比例的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法与对比例2相同，区别在于：所使用的发酵培养基的组成中将豆粕粉换为等量的大豆蛋白胨，其余组分及用量与对比例2相同。

五、实验例

(1)活菌数与转孢率

分别采用实施例5与对比例1的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法进行实验，分别设置3个重复实验，对发酵结束时的发酵液进行活菌数、芽孢数检测，结果如表1所示。

表1

对比以上数据可知，在发酵结束前将发酵温度升高再迅速降低，有利于枯草芽孢杆菌菌体内抗逆性的休眠体构造—芽孢的形成和保持，从而显著提高发酵液中枯草芽孢杆菌的转孢率。

分别采用实施例5与对比例2的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法进行实验，分别设置3个重复实验，对发酵结束时的发酵液进行活菌数、芽孢数检测，结果如表2所示。

表2

对比以上数据可知，发酵培养基中添加蛋白酶、淀粉酶，所得发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数、芽孢数提高率达80％以上，并且转孢率也有一定的提高，有利于获得高密度、高转孢率的枯草芽孢杆菌制剂。

(2)稳定性

分别采用实施例5与对比例3的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法进行实验，对发酵结束时的发酵液直接喷雾干燥得到枯草芽孢杆菌菌粉，分别取实施例5和对比例3的适量菌粉，各分成25等份，每份重量为60±5g，装入自封袋中，然后将菌粉放入40℃培养箱中，每过一周，分别取出样品一份，做活菌数检测，结果如图1所示。

对比图1中实验组、对照组菌粉在实验期间的枯草芽孢杆菌存活率变化趋势可知，采用本发明的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法所获得的枯草芽孢杆菌菌粉稳定性好，有利于保持由本发明的枯草芽孢杆菌制剂生产的产品的货架期。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌种子液接种到枯草芽孢杆菌用发酵培养基中，在37~40℃培养18~20h，然后升温至45~50℃，维持2~3h，再降温至常温，发酵结束；所述降温的速率为2~10℃/min；所述枯草芽孢杆菌用发酵培养基由豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、无机盐、蛋白酶、淀粉酶与水制成，各组分的用量为：豆粕粉63~74g/L，玉米淀粉82~90g/L，玉米浆5~7g/L，牛肉膏2~3g/L，蛋白胨8~12g/L，葡萄糖8~12g/L，蛋白酶2~3g/L，淀粉酶2~3g/L，无机盐5.73~11.08g/L，其中，蛋白酶的酶活力为1800~2000U/g，淀粉酶的酶活力为1800~2000U/g。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌用发酵培养基中无机盐为：氯化钠2~4g/L，碳酸钙3~5g/L，磷酸氢二钾0.4~1.2g/L，氯化铁0.3~0.8g/L，硫酸锰0.03~0.08g/L。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌用发酵培养基的制备包括以下步骤：将豆粕粉、玉米粉与水混匀，加入蛋白酶酶解，再加入淀粉酶酶解，加入玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、无机盐，混匀，即可。

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶酶解的温度为40~45℃，时间为2~3h，所述淀粉酶酶解的温度为65~70℃，时间为2~3h。

5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子液的浓度为1~10亿cfu/mL。

6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述接种的体积百分比为8~12%。

7.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的搅拌速度为170~240r/min。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述种子液由包括以下步骤的方法制备：

（1）将枯草芽孢杆菌菌种接种到一级种子培养基中，37~40℃培养6~8h，得到种子培养液；

（2）将步骤（1）所得种子培养液以体积百分比1-5%接种到二级种子培养基中，37~40℃培养4~6h。