CN109825446A - 一种高产枯草芽孢杆菌的工业化生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种高产枯草芽孢杆菌的工业化生产方法，将枯草芽孢杆菌接种于摇瓶培养基在三角瓶中进行培养，作为一级发酵种子液，接种到发酵培养基中进行一级种子培养，发酵温度30℃‑35℃，转速120rpm‑150rpm，pH为7.0‑7.2条件下发酵培养10h，作为二级培养种子液，接种到发酵培养基中进行二级种子培养，发酵温度30℃‑35℃，转速120rpm‑150rpm，pH为7.0‑7.2条件下发酵培养12h，发酵结束后，收集二级发酵种子液，接种至发酵罐中，进行发酵培养，发酵结束，收集罐内发酵液；喷雾干燥，制得菌粉微生物制剂。优点是：工艺合理，成本低廉，成孢速率高，产品活菌数高，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产枯草芽孢杆菌的工业化生产方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌是一种用途很广的微生态制剂。1989年被美国食品与药物管理局(FDA)和 1999年被我国农业部正式批准使用的益生菌，该菌具有菌种单一、对抗生素无耐药性及对动 物无毒性等特点。因其在芽孢状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃ 高温，在120℃温度下能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和 胆汁的攻击，是微生物中可100％直达大小肠的活菌。
目前，枯草芽孢杆菌的扩培仍停留在实验室阶段，培养基主要选用胰蛋白胨，成本较高， 不适合工化投产。而工业化生产，普遍存在成孢速率低，产品活菌数低，产品没有市场竞争 力，阻碍了枯草芽孢杆菌微生态制剂规模化工业生产的发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种工艺合理，成本低廉，成孢速率高，产品活菌数高， 适合工业化生产的高产枯草芽孢杆菌的工业化生产方法。
本发明的技术解决方案是：
一种高产枯草芽孢杆菌的工业化生产方法，其具体步骤如下：
(1)培养基组成
摇瓶培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、葡萄糖5g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO40.2g， 用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0-7.2；
发酵培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、玉米浆5g、葡萄糖5g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.2g、CaCO3 2g，用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0-7.2；
(2)三角瓶培养
将枯草芽孢杆菌接种于摇瓶培养基在三角瓶中进行培养，培养条件为：温度30℃-35℃， 时间为24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到发酵培养基中进行一级种子培养，接种量为3％-5％，发酵温度 30℃-35℃，转速120rpm-150rpm，pH为7.0-7.2条件下发酵培养10h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到发酵培养基中进行二级种子培养，接种量为3％-5％，发酵温度 30℃-35℃，转速120rpm-150rpm，pH为7.0-7.2条件下发酵培养12h，发酵结束后，收集二 级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为3％-5％，发酵温度30℃-35℃，通气量0.68vvm-1.2vvm，转速120rpm-150rpm，pH为7.0-7.2条件下发酵培养，培养基残糖≤0.10％后，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液中加入1％-5％氯化钠和5％-10％的可溶性淀粉，经过离心喷雾干燥，进风温度 180℃，出风温度80℃，制得菌粉微生物制剂。
用氨水控制pH值在发酵过程中的稳定。
所述枯草芽孢杆菌的保藏号CGMCC.NO.1.0775。
本发明的有益效果：
以枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Subsp)1.0775为菌种(中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心)，经优化菌种活化，发酵工艺优化控制，确立了稳定的产业化发酵生产 工艺，采用本方法发酵后可生产出芽孢数为3.0×1011CFU/g以上的微生态粉剂，芽孢数较以 前的工艺提升了50％以上。大大减少了枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产成本，促进规模化工 业生产微生态制剂。
附图说明
图1-图2是本发明实施例1的菌种鉴定报告。
具体实施方式
实施例1
(1)培养基组成
摇瓶培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、葡萄糖5g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO40.2g， 用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0；
发酵培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、玉米浆5g、葡萄糖5g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.2g、CaCO3 2g，用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0；
(2)三角瓶培养
将枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Subsp)，CGMCC.NO.1.0775接种于摇瓶培养基在三角 瓶中进行培养，培养条件为：温度30℃，时间为10h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到发酵培养基中进行一级种子培养，接种量为3％，发酵温度30℃， 转速120rpm，pH为7.0条件下发酵培养10h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到发酵培养基中进行二级种子培养，接种量为3％，发酵温度30℃， 转速120rpm，pH为7.0条件下发酵培养12h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为3％，发酵温度30℃，通 气量0.68vvm，转速120rpm，pH为7.0条件下发酵培养，用氨水控制pH值在发酵过程中的稳定,培养基残糖≤0.10％后，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液中加入1％氯化钠和10％的可溶性淀粉，经过离心喷雾干燥，进风温度180℃， 出风温度80℃，制得菌粉微生物制剂。
实施例2
(1)培养基组成
摇瓶培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、葡萄糖5g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO40.2g， 用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.2；
发酵培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、玉米浆5g、葡萄糖5g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.2g、CaCO3 2g，用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.2；
(2)三角瓶培养
选用枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Subsp)，CGMCC.NO.1.0775；
将枯草芽孢杆菌接种于摇瓶培养基在三角瓶中进行培养，培养条件为：温度35℃，时间 为24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到发酵培养基中进行一级种子培养，接种量为5％，发酵温度35℃， 转速150rpm，pH为7.2条件下发酵培养10h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到发酵培养基中进行二级种子培养，接种量为5％，发酵温度35℃， 转速150rpm，pH为7.2条件下发酵培养12h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为5％，发酵温度35℃，通 气量1.2vvm，转速150rpm，pH为7.2条件下发酵培养，用氨水控制pH值在发酵过程中的稳定,培养基残糖≤0.10％后，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液中加入5％氯化钠和5％的可溶性淀粉，经过离心喷雾干燥，进风温度180℃， 出风温度80℃，制得菌粉微生物制剂。
实施例3
(1)培养基组成
摇瓶培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、葡萄糖5g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO40.2g，用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.1；
发酵培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、玉米浆5g、葡萄糖5g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.2g、CaCO3 2g，用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.1；
(2)三角瓶培养
选用枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Subsp)，CGMCC.NO.1.0775；
将枯草芽孢杆菌接种于摇瓶培养基在三角瓶中进行培养，培养条件为：温度32℃，时间 为24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到发酵培养基中进行一级种子培养，接种量为4％，发酵温度32℃， 转速130rpm，pH为7.1条件下发酵培养10h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到发酵培养基中进行二级种子培养，接种量为4％，发酵温度32℃， 转速130rpm，pH为7.1条件下发酵培养12h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为4％，发酵温度32℃，通 气量1.0vvm，转速130rpm，pH为7.1条件下发酵培养，用氨水控制pH值在发酵过程中的稳定,培养基残糖≤0.10％后，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液中加入3％氯化钠和6％的可溶性淀粉，经过离心喷雾干燥，进风温度180℃， 出风温度80℃，制得菌粉微生物制剂。
在发酵过程中，培养基是发酵生产的基础。本发明利用摇瓶和发酵罐相结合进行培养基 和生产工艺的优化，并对菌种的活化进行检测评估。本着高产出、低成本的原则，枯草芽孢 杆菌(CGMCC.NO.1.0775.)可以玉米粉、葡萄糖、玉米淀粉为碳源，菌体量多，其中以玉米 粉菌体生长快、菌体量多；可以用蛋白胨、豆粕粉、麸皮粉、氨水、玉米浆等作为氮源，其 中，豆粕粉为最佳氮源，且获取、储存、使用容易，使枯草芽孢杆菌菌体量多。
通过研究证明，金属离子对枯草芽孢杆菌(CGMCC.NO.1.0775.)形成芽孢有一定的作 用，Cu离子、Fe离子对芽孢形成有抑制作用，而K离子、Ga离子、Mg离子、Mn离子对芽 孢形成有促进作用。
发酵过程中，物料灭菌和菌体代谢产物会使发酵液中的微生物生长环境的pH发生较大的 变化，在发酵培养基和发酵过程中本发明使用氨水控制发酵工程的pH变化，使用氨水控制 物料灭菌过程带来的pH变化。
本发明在发酵液在处理中加入辅料，经过离心喷雾干燥，进风温度180℃、出风温度80℃ 一次性制得菌粉微生物制剂。离心喷雾干燥所得到的菌粉微生物制剂为淡黄色、细粉状，无 结块、无潮解。
目前，本发明已完成中试后投入规模化工业生产，采用国家标准GB/T26428-2010进行检 测，用60m3发酵罐连续生产80个批次，菌粉平皿芽孢数平均在3.0×1011CFU/g以上，其芽 孢存活率经国标GB/T26428-2010检测如表1所述：
表1
| 时间 | 0 | 1个月 | 2个月 | 3个月 | 6个月 | 12个月 |
| 芽孢数×10<sup>11</sup>CFU/g | 3.25 | 3.26 | 3.23 | 3.24 | 3.25 | 3.23 |
| 存活率％ | 100 | 100 | 99.4 | 99.7 | 100 | 99.4 |
菌株经16SrDNA序列测序鉴定，确定该菌株为芽孢杆菌科芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌。
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、 改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种高产枯草芽孢杆菌的工业化生产方法，其特征是：
具体步骤如下：
(1)培养基组成
摇瓶培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、葡萄糖5g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO40.2g，用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0-7.2；
发酵培养基：豆粕粉40g、玉米粉40g、玉米浆5g、葡萄糖5g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、MgSO40.2g、CaCO3 2g，用蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0-7.2；
(2)三角瓶培养
将枯草芽孢杆菌接种于摇瓶培养基在三角瓶中进行培养，培养条件为：温度30℃-35℃，时间为24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到发酵培养基中进行一级种子培养，接种量为3％-5％，发酵温度30℃-35℃，转速120rpm-150rpm，pH为7.0-7.2条件下发酵培养24h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到发酵培养基中进行二级种子培养，接种量为3％-5％，发酵温度30℃-35℃，转速120rpm-150rpm，pH为7.0-7.2条件下发酵培养24h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为3％-5％，发酵温度30℃-35℃，通气量0.68vvm-1.2vvm，转速120rpm-150rpm，pH为7.0-7.2条件下发酵培养，培养基残糖≤0.10％后，发酵结束，收集罐内发酵液。
2.用氨水控制pH值在发酵过程中的稳定。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN111733091A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-10-02 | 河南金百合生物科技股份有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基及其制备方法、枯草芽孢杆菌制剂的制备方法 |
| CN112410238A (zh) * | 2019-08-21 | 2021-02-26 | 朝阳华星生物工程有限公司 | 一种高产蜡样芽孢杆菌工业生产发酵工艺 |
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2017
- 2017-11-23 CN CN201711181835.1A patent/CN109825446A/zh active Pending
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| CN111733091A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-10-02 | 河南金百合生物科技股份有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌用发酵培养基及其制备方法、枯草芽孢杆菌制剂的制备方法 |
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