CN104593315A - 一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括步骤：菌种活化、菌体增殖、菌体筛选和芽孢诱导；其中，在菌体筛选时在培养基表面覆盖有1～5张无菌滤纸，在芽孢诱导时在培养基中加入5～10重量份的PEG6000。本发明通过改进培养基的配方及培养条件，可在短时间内大批量制备芽孢，且培养基成分廉价易得，工艺条件简单、生产周期短，整个制备工艺一个批次耗时在90小时内，本案提供了一种简单的培养方法和工业化发酵培养的路线，它诱导生产的芽孢纯度高，含量可达1×109个/mL，芽孢转化率大于98％。
Description
技术领域
本发明涉及微生物芽孢诱导领域，具体涉及一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，特别涉及一种可用于大规模生产的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法。
背景技术
嗜热脂肪芽孢杆菌为革兰阳性菌，需氧或兼性厌氧，利用葡萄糖产酸不产气。嗜热脂肪芽孢杆菌可产芽孢，最佳生长温度为55-60℃，最高生长温度为65-75℃，属于嗜热菌。中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)收藏编号为CICC：10267，即ATCC：7953。
嗜热脂肪芽孢杆菌所产芽孢无致病性、无热原、无毒。其芽孢对一定灭菌因子有确定的抗力，尤其对压力蒸汽的抗力强于大多数微生物，因此在我国，欧洲，美国，日本等地作为热力灭菌生物指示剂的标准菌株。嗜热脂肪芽孢杆菌含有多种抗药性隐蔽质粒，因此在国标GB/T4789.27-2008中规定了运用嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法检测鲜乳中的抗生素含量。嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法(专利号：2009100662870，公开了一种利用嗜热脂肪芽孢杆菌检测抗生素的方法)。嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢因其特性，在消毒检验监测领域的应用越来越广泛。因此对芽孢生成机理及诱导条件等方面的工作需要继续深入。
目前，现有技术中，已经可以实现对嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢进行小剂量的制备，但在大规模量产时，却存在许多技术障碍：1)如何在固态的培养基上简便高效地刮取大量的高活性高产率的菌株；2)如何开发出一款成本低廉，适合大批量生产的诱导产孢培养基。
发明内容
针对上述不足之处，本发明的目的是提出一种成本低廉，操作简便，可大规模制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在50～60℃下培养12～24h后，所述菌种长出菌苔；所述活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将含所述菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在50～60℃环境中，转速100～250rpm/min条件下培养12h；所述增殖培养基由以下重量份的材料组成：5～10重量份的胰蛋白胨、5～10重量份的大豆蛋白胨、5～10重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤纸1～5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在50～60℃下培养24h；所述筛选培养基由以下重量份的材料组成：1～5重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的酵母提取物、1～5重量份的牛肉浸膏、0.01～0.1重量份的KH2PO4、0.1～1重量份的MnSO4·H2O、0.1～1重量份的MgSO4·2H2O、0.01～1重量份的CaCl2·2H2O、10～20重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在50～60℃环境中，转速100～200rpm/min条件下培养12h后，改变温度至30～50℃，继续培养12h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；所述产孢培养基由以下重量份的材料组成：1～5重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的酵母提取物、0.01～0.1重量份的NaCl、0.1～1重量份的MnSO4·H2O、0.1～1重量份的MgSO4·2H2O、0.01～1重量份的CaCl2·2H2O、5～10重量份的PEG6000、0.5～5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，在所述活化培养基、增殖培养基、筛选培养基和产孢培养基中用HCl或NaOH调节pH在7.0～7.3之间。
优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，所述增殖培养基由以下重量份的材料组成：7.5重量份的胰蛋白胨、7.5重量份的大豆蛋白胨、7.5重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，所述筛选培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、0.05重量份的KH2PO4、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，所述产孢培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0.05重量份的NaCl、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、7.5重量份的PEG6000、2.5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，在步骤3)中无菌滤纸的数量为5张，且选取第三张或第四张滤纸放入步骤4)的产孢培养基中。
本发明的有益效果是：本发明通过改进培养基的配方及培养条件，可在短时间内大批量制备芽孢，且培养基成分廉价易得，工艺条件简单、生产周期短，整个制备工艺一个批次耗时在90小时内，本案提供了一种简单的培养方法和工业化发酵培养的路线，它诱导生产的芽孢纯度高，含量可达1×109个/mL，芽孢转化率大于98％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案提出一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在50～60℃下培养12～24h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在50～60℃环境中，转速100～250rpm/min条件下培养12h；增殖培养基由以下重量份的材料组成：5～10重量份的胰蛋白胨、5～10重量份的大豆蛋白胨、5～10重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤纸1～5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在50～60℃下培养24h；筛选培养基由以下重量份的材料组成：1～5重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的酵母提取物、1～5重量份的牛肉浸膏、0.01～0.1重量份的KH2PO4、0.1～1重量份的MnSO4·H2O、0.1～1重量份的MgSO4·2H2O、0.01～1重量份的CaCl2·2H2O、10～20重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在50～60℃环境中，转速100～200rpm/min条件下培养12h后，改变温度至30～50℃，使其在低温下能够形成休眠体，以提高芽孢转化的速率，继续培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：1～5重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的酵母提取物、0.01～0.1重量份的NaCl、0.1～1重量份的MnSO4·H2O、0.1～1重量份的MgSO4·2H2O、0.01～1重量份的CaCl2·2H2O、5～10重量份的PEG6000、0.5～5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
芽孢的培养对培养体系的pH值有较严格的要求，因此在活化培养基、增殖培养基、筛选培养基和产孢培养基中，它们的pH值应被限制，可用HCl或NaOH调节使其pH稳定在7.0～7.3之间。
本方法中所用的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物和牛肉浸膏均是市售的成熟商品，它们具有多种购买渠道，且都具有清楚明确的成分组成。其中，胰蛋白胨的CAS号为91079-40-2，可购自Sigma-Aldrich试剂公司，产品编号T7293。大豆蛋白胨的CAS号为91079-46-8，可购自Sigma-Aldrich试剂公司，产品编号87972。酪蛋白胨的CAS号为91079-40-2，可购自Sigma-Aldrich试剂公司，产品编号22090。牛肉浸膏的CAS号为68990-09-0，可购自Sigma-Aldrich试剂公司，产品编号B4888。酵母提取物的CAS号为8013-01-2，可购自Sigma-Aldrich试剂公司，产品编号Y1000；或购自上海浩然生物技术有限公司，产品货号LP0021。
传统工艺中的菌体筛选，是将菌苔置于以琼脂为主体的固态培养基表面来培养，当菌苔形成芽孢聚集体后，将该芽孢聚集体上刮下，随后再进行后续的芽孢诱导。从传统工艺可以看出，刮取操作不仅耗时长，且操作的稳定性和重复性不佳，不适宜量产工艺，在刮取高产率的菌株时，容易顺带刮下低产率的菌株，从而导致总体芽孢率(即芽孢转化率)偏低。在本案的改进工艺中，将无菌滤纸覆盖于培养基的表面，由于高产率菌株的芽孢生长速度快，它会先于低产率菌株从培养基中生长至滤纸表面，当筛选结束时，无需刮取，直接将滤纸取出，就可快速方便的得到高产率菌株培养出的芽孢聚集体。此法不仅成本低廉，最关键的它十分适用于大规模生产。经过大量试验发现，优选的是，无菌滤纸的数量为5张，且选取第三张或第四张滤纸放入步骤4)的产孢培养基中，以此筛选得到的菌体活性最高，芽孢转化率也最高。
步骤4)芽孢诱导时，在产孢培养基中加入了5～10重量份的PEG6000，若没有PEG6000这一成分，则产孢培养基仍然是一个以琼脂为骨架的固相培养基，芽孢的生长只能在其表面进行，由于这种培养基的表面积十分有限，这使得此类培养基只能用于极小批量的生产，根本无法满足量产的要求。当加入PEG6000，其将固相型培养基改变为了一种具有一定粘稠度的液相培养基，对于芽孢的培养来说，液相培养基的培养原理类似于“液体发酵”，它不再受限于培养基表面积的不足，单位重量的液相培养基的培养能力是传统培养基的上万倍，因此它完全可以满足大规模生产的要求。但需要注意的是，结合产孢培养基上述的配方，PEG6000的含量因被限制，优选添加的量是5～10重量份，若PEG6000的添加量小于5重量份，则导致培养基体系粘度过大，体系内添加成分分散不均，从而降低了培养基的培养能力，影响最终的芽孢率；若PEG6000的添加量大于10重量份，则会降低培养基中核心成分的相对浓度，从而降低芽孢的生长速率，影响芽孢的最终产率。
芽孢的培养对培养基的成分及其含量、培养温度和培养时间均有严格的要求，因此上述制备方法中的培养时间、培养温度及培养基中各个添加物质的种类和添加量都应被限制，尤其是培养基的成分及其含量，若改变物质的种类或超出其优选的添加量范围，则会导致培养基的培养能力发生改变，尤其是它不再是针对嗜热脂肪芽孢杆菌具有最佳培养效率的配方，导致最终的芽孢率降低，因此上述生产方法中的参数及培养基配方是一个不可分割的有机整体，它们的结合恰好匹配于对嗜热脂肪芽孢杆菌这一特殊菌种的最优培养模式。
芽孢转化率可通过对菌体进行革兰氏染色并计算获得，芽孢呈绿色，没有芽孢的菌体呈红色。
实施例1
一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在50℃下培养12h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在50℃环境中，转速100rpm/min条件下培养12h；增殖培养基由以下重量份的材料组成：5重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、1重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤纸1张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在50℃下培养24h；筛选培养基由以下重量份的材料组成：1重量份的酪蛋白胨、1重量份的酵母提取物、1重量份的牛肉浸膏、0.01重量份的KH2PO4、0.1重量份的MnSO4·H2O、0.1重量份的MgSO4·2H2O、0.01重量份的CaCl2·2H2O、10重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在50℃环境中，转速100rpm/min条件下培养12h后，改变温度至30℃，继续培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：1重量份的酪蛋白胨、1重量份的酵母提取物、0.01重量份的NaCl、0.1重量份的MnSO4·H2O、0.1重量份的MgSO4·2H2O、0.01重量份的CaCl2·2H2O、5重量份的PEG6000、0.5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
实施例2
一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在60℃下培养24h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在60℃环境中，转速250rpm/min条件下培养12h；增殖培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、10重量份的大豆蛋白胨、10重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤纸5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在60℃下培养24h；筛选培养基由以下重量份的材料组成：5重量份的酪蛋白胨、5重量份的酵母提取物、5重量份的牛肉浸膏、0.1重量份的KH2PO4、1重量份的MnSO4·H2O、1重量份的MgSO4·2H2O、1重量份的CaCl2·2H2O、20重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在60℃环境中，转速200rpm/min条件下培养12h后，改变温度至50℃，继续培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：5重量份的酪蛋白胨、5重量份的酵母提取物、0.1重量份的NaCl、1重量份的MnSO4·H2O、1重量份的MgSO4·2H2O、1重量份的CaCl2·2H2O、10重量份的PEG6000、5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
实施例3
一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在58℃下培养18h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在58℃环境中，转速200rpm/min条件下培养12h；增殖培养基由以下重量份的材料组成：7.5重量份的胰蛋白胨、7.5重量份的大豆蛋白胨、7.5重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤纸5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在58℃下培养24h；筛选培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、0.05重量份的KH2PO4、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的第3张或第4张无菌滤纸放入产孢培养基中，在58℃环境中，转速150rpm/min条件下培养12h后，改变温度至40℃，继续培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0.05重量份的NaCl、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、7.5重量份的PEG6000、2.5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
对比例1
一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在58℃下培养18h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在58℃环境中，转速200rpm/min条件下培养12h；增殖培养基由以下重量份的材料组成：7.5重量份的胰蛋白胨、7.5重量份的大豆蛋白胨、7.5重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，将步骤2)所得菌液加到筛选培养基中，在58℃下培养24h；筛选培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、0.05重量份的KH2PO4、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)筛选培养基表面形成芽孢聚集体的菌种刮取出，放入产孢培养基中，在58℃环境中，转速150rpm/min条件下培养12h后，改变温度至40℃，继续培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0.05重量份的NaCl、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、7.5重量份的PEG6000、2.5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
对比例2
一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在58℃下培养18h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在58℃环境中，转速200rpm/min条件下培养12h；增殖培养基由以下重量份的材料组成：7.5重量份的胰蛋白胨、7.5重量份的大豆蛋白胨、7.5重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤纸5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在58℃下培养24h；筛选培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、0.05重量份的KH2PO4、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的第3张或第4张无菌滤纸放入产孢培养基中，在58℃环境中，转速150rpm/min条件下培养12h后，改变温度至40℃，继续培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0.05重量份的NaCl、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、2.5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
下表是按照实施例1～3及对比例1和2的方法进行生产的参数结果：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 芽孢纯度/％ | 99.2％ | 99.4％ | 99.9％ | 95.0％ | 98.0％ |
| 芽孢转化率/％ | 98.3％ | 98.6％ | 99.1％ | 95.2％ | 96.8％ |
| 芽孢密度 | 1×109个/mL | 1.2×109个/mL | 1.4×109个/mL | 6.4×105个/mL | 2.7×106个/mL |
| 单次投产最大量 | 90kg | 90kg | 100kg | 10kg | 0.1kg |
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (6)
1.一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在50～60℃下培养12～24h后，所述菌种长出菌苔；所述活化培养基由以下重量份的材料组成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤2)菌体增殖：将含所述菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在50～60℃环境中，转速100～250rpm/min条件下培养12h；所述增殖培养基由以下重量份的材料组成：5～10重量份的胰蛋白胨、5～10重量份的大豆蛋白胨、5～10重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤纸1～5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在50～60℃下培养24h；所述筛选培养基由以下重量份的材料组成：1～5重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的酵母提取物、1～5重量份的牛肉浸膏、0.01～0.1重量份的KH2PO4、0.1～1重量份的MnSO4·H2O、0.1～1重量份的MgSO4·2H2O、0.01～1重量份的CaCl2·2H2O、10～20重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在50～60℃环境中，转速100～200rpm/min条件下培养12h后，改变温度至30～50℃，继续培养12h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；所述产孢培养基由以下重量份的材料组成：1～5重量份的酪蛋白胨、1～5重量份的酵母提取物、0.01～0.1重量份的NaCl、0.1～1重量份的MnSO4·H2O、0.1～1重量份的MgSO4·2H2O、0.01～1重量份的CaCl2·2H2O、5～10重量份的PEG6000、0.5～5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，在所述活化培养基、增殖培养基、筛选培养基和产孢培养基中用HCl或NaOH调节pH在7.0～7.3之间。
3.根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，所述增殖培养基由以下重量份的材料组成：7.5重量份的胰蛋白胨、7.5重量份的大豆蛋白胨、7.5重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，所述筛选培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、0.05重量份的KH2PO4、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，所述产孢培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0.05重量份的NaCl、0.5重量份的MnSO4·H2O、0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.5重量份的CaCl2·2H2O、7.5重量份的PEG6000、2.5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
6.根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，在步骤3)中无菌滤纸的数量为5张，且选取第三张或第四张滤纸放入步骤4)的产孢培养基中。
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