CN106867940A - 一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长萌发的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长和萌发的方法，将促进嗜热脂肪芽孢杆菌的菌种在活化培养基上进行划线培养得到活化的菌种；将活化的菌种在产孢培养基上进行划线培养或者涂布培养得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；将得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用灭菌生理盐水制成芽孢复溶液，然后向1ml检测培养基中添加10‑20μL芽孢复溶液混匀得混合菌液；混合菌液加入到无菌微孔板微孔中，向其中加入100μL纯牛奶即可检测。本发明利用嗜热脂肪芽孢杆菌检测牛奶中抗生素的残留，提供一种促进芽孢的生长和芽孢萌发的方法，大大降低了生产成本，缩短了检测时间，可提高产品的竞争力。

Description

一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长萌发的方法
技术领域
本发明涉及芽孢诱导和微生物检测领域，具体涉及一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长和萌发的方法。
背景技术
嗜热脂肪芽孢杆菌属于嗜热性需氧兼厌氧芽孢杆菌，利用葡萄糖产酸不产气。其最适生长繁殖温度为56～65℃，最高生长温度为65～75℃，属于嗜热菌。当营养细胞受到营养缺乏、代谢产物积累或温度变化等因素影响时，产生具有休眠特性且无毒、无热源、无致病性的芽孢。芽孢对辐射、热、干燥、极端pH和一些有毒化学物品等有很强的抵抗能力。该菌在微生物检测领域有一个重要的用途，就是用来检测牛奶中抗生素的残留，国际乳品联合会推荐的微生物检测抗生素菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌。
目前牛奶中抗生素的检测方法中，微生物检测法以其操作简便，经济实惠的特点被国内外广泛采用。其基本原理是将芽孢及其生长必须的营养物质和产酸指示剂(溴甲酚紫)固定在微孔板内，通过添加牛奶待测样品后，在一定温度培养一定时间，若芽孢正常萌发会产酸，使指示剂由紫色变成黄色，说明微孔板中的芽孢正常萌发，牛奶中不含有抗生素；若牛奶中含有抗生素，会抑制芽孢的萌发，指示剂不变色(保持紫色)。目前国际上最完善的产品是戴尔沃公司生产的检测体系，其产品检测所需时间为2.5-3小时，国内的产品检测时间通常为3小时或更长，如果能够缩短检出时间，提高检测效率，会大大提高产品的竞争力。
芽孢对外界环境极为敏感，一旦其探测到外部存在适宜萌发的条件，芽孢就开始萌发，迅速生长恢复到营养细胞状态。本发明利用嗜热脂肪芽孢杆菌作为牛奶抗生素检测的敏感菌株，发明了一种促进芽孢生长及芽孢萌发的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，提供一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长的方法，并将该芽孢应用到牛奶抗生素残留检测过程，大大降低了生产成本。，同时提供一种促进芽孢萌发的方法，从而缩短牛奶抗生素的检测时间，提高产品的竞争力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将促进嗜热脂肪芽孢杆菌的菌种在活化培养基上进行划线培养得到活化的菌种；
所述的划线培养的培养温度为55-65℃；
所述的划线培养的培养时间为12-24h；
所述的活化培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂2％，蒸馏水补足至100％，调其pH为7.2±0.2后在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用。
(2)产孢培养：将步骤(1)得到的活化的菌种在产孢培养基上进行划线培养或者涂布培养得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；
所述的划线培养或者涂布培养的培养温度为55-65℃；
所述的划线培养或者涂布培养的培养时间为24-30h；
所述的产孢培养基由以下重量百分比的原料组成：胰蛋白胨1.7％，植物蛋白胨0.3％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.25％，琼脂2％、吐温-80 0.5-1％，蒸馏水补足至100％，调其pH为7.3±0.2后在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用；
当培养方式为涂布培养时，需要将步骤(1)得到的活化的菌种接种到无菌生理盐水中制成菌悬液，然后再将菌悬液涂布到产孢培养基上。
芽孢的产生率可通过对嗜热脂肪芽孢杆菌进行芽孢染色获得，芽孢呈绿色，没有形成芽孢的菌体呈现红色；本发明中所采用的芽孢染色方法为：取菌体至玻片上，自然干燥后火焰加热数次将菌体固定在玻片上，滴加3-5滴5％孔雀绿染液于已固定的菌体上，在火焰上加热5min，使染液冒蒸汽但不沸腾，倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色，干燥后用油镜观察。
本发明还提供一种上述方法得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。
本发明还提供一种上述方法得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用。
上述方法得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用时包括以下步骤：
(3)制备芽孢复溶液：将步骤(2)得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用灭菌生理盐水按照质量比1:10-1:20比例刮下，在100℃煮沸30min后在5000rpm下离心5min，收集菌体再用灭菌生理盐水按照质量比1:10-1:20比例复溶，混匀后得到芽孢复溶液备用；
(4)制作试剂盒微孔板：在无菌操作台中，向1ml检测培养基中添加10-20μL步骤(3)得到的芽孢复溶液，充分混匀得混合菌液；取100-130μL混合菌液加入到无菌微孔板微孔中，待凝固后封口，冰箱保存；
所述的检测培养基为以下三种培养基中的任意一种：
所述的检测培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，0.2-0.5％红糖，蒸馏水补足至100％；调其pH为7-8.5后在115℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用；
所述的检测培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，0.2-0.5％红糖，0.1-0.5％吐温-80，蒸馏水补足至100％；调其pH为7-8.5后在115℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用；
所述的检测培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，，0.2-0.5％红糖，0.1-0.5％吐温-80，0.1-0.5％KCl，0.1-0.5％天冬氨酸，蒸馏水补足至100％；调其pH为7-8.5后在115℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用；
(5)抗生素检测：向步骤(4)制备好的微孔板微孔中加入100μL纯牛奶，同时向另外的微孔中加入终浓度为1ppb的青霉素牛奶混合物作为阳性对照，将微孔板放入60-65℃恒温培养，记录试剂盒微孔板变色时间。
本发明和现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明根据嗜热脂肪芽孢杆菌的特点，在固体培养平板上通过添加特殊的化学成分吐温80，促进该菌芽孢的生成，提高了生产效率，降低了成本。整个芽孢生产过程需要32-54h，芽孢最高转化率大于99％。
本发明在现有牛奶抗生素检测方法的基础上，通过调节微孔板检测培养基的化学成分，促进试剂盒微孔板中芽孢的萌发，可以使牛奶抗生素的检测时间由2.5-3h缩短至2.2-2.7h。缩短了芽孢萌发时间，提高了试剂盒检测效率，增加了产品的竞争力。
具体实施方式
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
实施例1：
一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：保存的菌种在活化培养基上进行划线培养，培养温度为65℃，培养时间为12h；
活化培养基按照质量百分比组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂2％，蒸馏水补足至100％，pH 7.2，灭菌条件为121℃30min。
(2)产孢培养：在产孢培养基上进行涂布培养培养，将活化的菌种接种到无菌生理盐水中，制成菌悬液，再将菌悬液涂布到产孢培养基；培养温度为65℃，培养时间为24h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；
产孢培养基按照质量百分比组成为：胰蛋白胨1.7％，植物蛋白胨0.3％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.25％，琼脂2％，吐温-80 0.75％，蒸馏水补足至100％，pH 7.3，灭菌条件为121℃20min。
对上述得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用芽孢染色方法染色，芽孢形成率为99％。
实施例2:
实施例1得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用，包括以下步骤：
(3)制备芽孢复溶液：将步骤(2)获得的芽孢用灭菌生理盐水按照1:20比例刮下，在100℃煮沸30min，5000rpm离心5min，收集菌体再用灭菌生理盐水按照质量比1:20比例复溶，混匀备用。
(4)制作试剂盒微孔板：在无菌操作台，取1ml检测培养基加入20μL步骤(3)得到的芽孢复溶液，充分混匀的混合菌液，取110μL混合菌液加入到无菌微孔板微孔中，待凝固后封口，冰箱保存。
检测培养基为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，红糖0.5％，蒸馏水补足至100％，调pH 8.2，在115℃灭菌20min。
(5)抗生素检测：步骤(4)制备好的微孔板微孔中加入100μL纯牛奶，同时向另外的微孔中加入终浓度为1ppb的青霉素牛奶混合物作为阳性对照，将微孔板放入65℃恒温培养，加入纯牛奶的微孔板在2.4h由紫色变成黄色，阳性对照保持紫色不变。
实施例3:
实施例1得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用，包括以下步骤：
(3)制备芽孢复溶液：将步骤(2)获得的芽孢用灭菌生理盐水按照1:20比例刮下，在100℃煮沸30min，5000rpm离心5min，收集菌体再用灭菌生理盐水按照1:20比例复溶，混匀备用。
(4)制作试剂盒微孔板：在无菌操作台，取1ml检测培养基加入20μL步骤(3)得到的芽孢复溶液，充分混匀的混合菌液，取110μL混合菌液加入到无菌微孔板微孔中，待凝固后封口，冰箱保存。
检测培养基为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，红糖0.5％，吐温-80 0.5％，蒸馏水补足至100％，调pH 8.2，在115℃灭菌20min。
(5)抗生素检测：步骤(4)制备好的微孔板微孔中加入100μL纯牛奶，同时向另外的微孔中加入终浓度为1ppb的青霉素牛奶混合物作为阳性对照，将微孔板放入65℃恒温培养，加入纯牛奶的微孔板在2.3h由紫色变成黄色，阳性对照保持紫色不变。
实施例4:
实施例1得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用，包括以下步骤：
(3)制备芽孢复溶液：将步骤(2)获得的芽孢用灭菌生理盐水按照1:20比例刮下，在100℃煮沸30min，5000rpm离心5min，收集菌体再用灭菌生理盐水按照1:20比例复溶，混匀备用。
(4)制作试剂盒微孔板：在无菌操作台，取1ml检测培养基加入20μL步骤(3)得到的芽孢复溶液，充分混匀的混合菌液，取110μL混合菌液加入到无菌微孔板微孔中，待凝固后封口，冰箱保存。
检测培养基为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，红糖0.5％，吐温-80 0.5％，KCl 0.5％，天冬氨酸0.5％，蒸馏水补足至100％，调pH 8.2，在115℃灭菌20min。
(5)抗生素检测：步骤(4)制备好的微孔板微孔中加入100μL纯牛奶，同时向另外的微孔中加入终浓度为1ppb的青霉素牛奶混合物作为阳性对照，将微孔板放入65℃恒温培养，加入纯牛奶的微孔板在2.2h由紫色变成黄色，阳性对照保持紫色不变。
实施例5:
一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长和萌发的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：保存的菌种在活化培养基上进行划线培养，培养温度为65℃，培养时间为12h；
活化培养基按照质量百分比组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂2％，蒸馏水补足至100％，pH 7.2，灭菌条件为121℃30min。
(2)产孢培养：在产孢培养基上进行划线培养，培养温度为65℃，培养时间为30h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；
产孢培养基按照质量百分比组成为：胰蛋白胨1.7％，植物蛋白胨0.3％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.25％，琼脂2％，吐温-80 0.75％，蒸馏水补足至100％，pH 7.3，灭菌条件为121℃20min。
对上述得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用芽孢染色方法染色，芽孢形成率为100％。
得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用，包括以下步骤：
(3)制备芽孢复溶液：将步骤(2)获得的芽孢用灭菌生理盐水按照1:20比例刮下，在100℃煮沸30min，5000rpm离心5min，收集菌体再用灭菌生理盐水按照1:20比例复溶，混匀备用。
(4)制作试剂盒微孔板：在无菌操作台，取1ml检测培养基加入20μL步骤(3)得到的芽孢复溶液，充分混匀的混合菌液，取110μL混合菌液加入到无菌微孔板微孔中，待凝固后封口，冰箱保存。
检测培养基为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，红糖0.5％，吐温80 0.5％，KCl 0.5％，天冬氨酸0.5％，蒸馏水补足至100％，调pH 8.2，在115℃灭菌20min。
(5)抗生素检测：步骤(4)制备好的微孔板微孔中加入100μL纯牛奶，同时向另外的微孔中加入终浓度为1ppb的青霉素牛奶混合物作为阳性对照，将微孔板放入65℃恒温培养，加入纯牛奶的微孔板在2.2h由紫色变成黄色，阳性对照保持紫色不变。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将促进嗜热脂肪芽孢杆菌的菌种在活化培养基上进行划线培养得到活化的菌种；
所述的划线培养的培养温度为55-65℃；
所述的划线培养的培养时间为12-24h；
(2)产孢培养：将步骤(1)得到的活化的菌种在产孢培养基上进行划线培养或者涂布培养得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；
所述的划线培养或者涂布培养的培养温度为55-65℃；
所述的划线培养或者涂布培养的培养时间为24-30h。
2.根据权利要求1所述的促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的活化培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂2％，蒸馏水补足至100％，调其pH为7.2±0.2后在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用。
3.根据权利要求1所述的促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢生长的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的产孢培养基由以下重量百分比的原料组成：胰蛋白胨1.7％，植物蛋白胨0.3％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.25％，琼脂2％、吐温-80 0.5-1％，蒸馏水补足至100％，调其pH为7.3±0.2后在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用。
4.一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢，其特征在于，是通过权利要求1-3任一项所述的方法生产出来的。
5.一种权利要求4所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在检测牛奶中抗生素的残留中的应用时包括以下步骤：
(3)制备芽孢复溶液：将权利要求1的步骤(2)得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用灭菌生理盐水按照质量比1:10-1:20比例刮下，在100℃煮沸30min后在5000rpm下离心5min，收集菌体再用灭菌生理盐水按照质量比1:10-1:20比例复溶，混匀后得到芽孢复溶液备用；
(4)制作试剂盒微孔板：在无菌操作台中，向1ml检测培养基中添加10-20μL步骤(3)得到的芽孢复溶液，充分混匀得混合菌液；取100-130μL混合菌液加入到无菌微孔板微孔中，待凝固后封口，冰箱保存；
(5)抗生素检测：向步骤(4)制备好的微孔板微孔中加入100μL纯牛奶，同时向另外的微孔中加入终浓度为1ppb的青霉素牛奶混合物作为阳性对照，将微孔板放入60-65℃恒温培养，记录试剂盒微孔板变色时间。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述的检测培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，0.2-0.5％红糖，蒸馏水补足至100％；调其pH为7-8.5后在115℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述的检测培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，0.2-0.5％红糖，0.1-0.5％吐温-80，蒸馏水补足至100％；调其pH为7-8.5后在115℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述的检测培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，溴甲酚紫0.004％，琼脂0.5％，0.2-0.5％红糖，0.1-0.5％吐温-80，0.1-0.5％KCl，0.1-0.5％天冬氨酸，蒸馏水补足至100％；调其pH为7-8.5后在115℃下灭菌20-30min后冷却至室温待用。
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