CN108504602A - 一种富硒乳酸菌的制备方法 - Google Patents

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卢家兴
王婷
段冉冉
沈兰芳
刘婵婵
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Abstract

本发明提供了一种富硒乳酸菌的制备方法，采用发酵手段并在发酵过程中通过调控无机硒浓度及pH值等条件提高乳酸菌的富硒程度，得到的植物乳杆菌细胞内的硒含量高达847.52μg/g，无机硒的转化率达98.3％。本发明具有成本低、产量高、发酵周期短，易于放大培养等优点。

Description

一种富硒乳酸菌的制备方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)富集硒的方法。
背景技术
硒已被联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization，FAO)/国际原子能组织(International Atomic Energy Agency，IAEA)/世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)共同确认为人体必需的微量元素，与维持机体正常生理功能及预防多种疾病均相关，是哺乳动物体内多种酶活性中心的元素。
研究表明，谷物、蔬菜、水果中的硒含量较低，不能满足人体对于硒(推荐膳食摄入量：55μg/d)的需求。日常补硒主要通过无机硒、有机硒两种方式，但无机硒有较强的毒副作用，相对于无机硒，有机硒的毒副作用小且易于人体吸收，如何将无机硒转换为有机硒受到国内外相关学者的广泛关注。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，具有多种保健作用，可以降低断骨春，抑制致病菌，对人体进行免疫调节。相较其他同类型发酵菌，具有活菌数高、成本低、易于驯化等优点。植物乳杆菌最适生长温度为30～35℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH为6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。
目前，无机硒转化为有机硒的途径有动物转化法、植物自然转化法、微生物转化法等。动物转化法虽然能提高动物肉产品中的含硒量，但转化率、含量较低；植物转化法因长期施加硒肥，不仅成本高，而且容易造成环境污染；微生物转化法具有高吸收、培养便利、各种条件易于控制、营养均衡的特点，可以作为将无机硒转化为有机硒的主要来源。
目前国内外仅发现少量关于富硒乳酸菌的报道。例如，路文彬等的“富硒乳酸杆菌的研究”中给出的富硒条件为：37℃培养48小时。富硒乳酸菌的制备尚存在以下不足：1)目前的研究关注于乳制品发酵，并未明确给出无机硒的转化率及胞内有机硒含量及提高无机硒转化率的工艺措施，不足以为富硒菌剂的工业化生产提供实践依据；2)目前还缺乏符合工业化生产要求的富硒乳酸菌培养方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富硒乳酸菌的制备方法，为富硒微生物生物发酵的工业化生产提供实践依据。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1)将乳酸菌经扩大培养后接种于发酵培养基中，然后于34-37℃及110-130r/min条件下培养24-36h，培养过程中保持培养体系pH为7.5-8.0；所述发酵培养基在接种前预先添加有70-85μg/mL的亚硒酸钠；
2)培养结束后，收集乳酸菌菌体。
优选的，所述乳酸菌的接种量为2％-6％。
优选的，所述培养过程中通过添加PBS缓冲液保持培养体系pH稳定。
优选的，所述扩大培养包括以下步骤：将保存的乳酸菌活化后接种至种子培养基中，然后于34-37℃及110-130r/min条件下培养24-36小时。
优选的，所述种子培养基选自MRS肉汤液体培养基。
优选的，所述发酵培养基为MRS肉汤液体培养基。
优选的，所述乳酸菌选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
优选的，所述步骤1)中，培养的条件具体为：在pH值维持在8.0且亚硒酸钠初始浓度为80μg/mL的环境下，于37℃及120r/min下培养24h。
本发明的有益效果体现在：
本发明采用发酵手段并在发酵中通过调控无机硒浓度及pH值等条件提高乳酸菌的富硒程度。本发明具有成本低、产量高、发酵周期短，培养规模易于放大等优点，为富硒微生物工业化生产提供实践依据。
进一步的，本发明选择植物乳杆菌为富硒培养对象，该菌种符合食品安全要求，且得到的植物乳杆菌细胞内的硒含量高达847.52μg/g，无机硒的转化率达98.3％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明将低温保存的植物乳杆菌接入MRS肉汤培养基中进行活化，在一定的接种量及培养温度下，通过调节pH值、亚硒酸钠浓度确定生产富硒植物乳杆菌的最佳发酵条件。利用催化吸光光度法测定细胞内有机硒的含量。
1.菌株
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)来源于CICC，菌株编号23941，保藏于陕西科技大学天然产物微生物制造实验室。
2.培养基
MRS肉汤液体培养基组成：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L及吐温80 0.05g/L，pH＝6.2±0.2。
MRS肉汤固体培养基组成：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、吐温80 0.05g/L及琼脂粉20g/L，pH＝6.2±0.2。
3.活菌数的测定
采用稀释涂布平板计数法，具体步骤为：在无菌条件下，取1mL的植物乳杆菌培养液于9mL无菌水中，稀释成1/10稀释液，按此方法进行10倍递增，稀释至合适浓度，取0.1mL稀释液均匀涂布于已灭菌的MRS肉汤固体培养基中，每个样品做两个稀释度，每个稀释度3个平行，然后置于37℃恒温培养箱培养24h，选取30～300个之间的菌落群，计算单位活菌数。
4.硒含量的测定
4.1无机硒测定
采用紫外分光光度法，测定原理：有机硒不能与3,3’-二氨基联苯胺(DAB)络合生成黄色络合物(Se-DAB)，而无机硒在酸性条件下，可与3,3’-二氨基联苯胺作用，生成Se-DAB。在pH7.0～7.5左右时，用甲苯萃取，根据有机层显色的程度，用分光光度法测定吸光度，从而确定亚硒酸钠的含量。测得亚硒酸钠的标准曲线为y＝0.0547x+0.0062(R2＝0.9995)
具体操作：准确量取5mL的菌液置于离心管中，4000r/min离心20min，取上清液。再加入5mL的水复洗1次，取上清液，加入5mL的蒸馏水，用甲酸调节pH至2～3。加入4mL、0.2M的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)以掩盖干扰离子，然后加2mL 0.5％的DAB摇匀，于60℃水浴20min，取出，用浓氨水调节pH至7～7.5，准确移入4mL甲苯剧烈晃动1min，静置3～4min分层，然后将有机层通过脱脂棉滤到1cm的比色皿中，于420nm处测定溶液的吸光度，得到亚硒酸钠的含量，计算得到亚硒酸钠的转化率。
4.2有机硒测定
采用催化吸光光度法，测定原理：硒能够催化氯酸钾氧化苯腆生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮染料，生成的红色偶氮染料的吸光度与一定浓度范围的硒成正比，因而可利用催化吸光光度法测定植物乳杆菌中的硒含量。
具体操作：将新鲜的富硒植物乳杆菌放于Tris-HCl-甘油缓冲液中，加入二氧化硅进行研磨，在电子显微镜下观察，待细胞完全破碎后，装入事先处理好的透析袋内，扎紧上端，于蒸馏水中透析，期间不断换水，用无机硒和有机硒的定性鉴别方法，分别检测透析外液和透析内液，直到透析外液中检测不出硒时，停止透析。称取一定透析袋内样品于锥形瓶中，加入一定量的混合酸(浓硝酸40mL与高氯酸10mL混匀)加热至发烟，待溶液变为淡黄色后，再加热2～3min。此时溶液变为无色，冷却后定容，得到用于测定有机硒的含量的样品预处理液。
确定标准曲线：分别取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL的亚硒酸钠标准溶液(1μg/mL)于比色管中，加入0.02mol/L EDTA 2mL、0.2mol/L HCl-KCl缓冲液4mL、0.6mol/L氯酸钾4mL、0.03mol/L变色酸4mL以及0.03mol/L盐酸苯阱2mL，然后加水至30mL，摇匀，在沸水浴中加热30min，于冷水中冷却后，用1cm比色皿于520nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。测得标准曲线为y＝0.0539x+0.0053(R2＝0.9993)，线形关系良好。
按照确定标准曲线同样的方法，处理并测定样品预处理液吸光度，根据标准曲线计算有机硒的含量，最后换算为细胞内的有机硒含量。
5.细胞重量的测定
5.1细胞湿重
取5mL菌液经过8000r/min离心5min后倒去上清液，对菌体称重，计算湿重。
5.2细胞干重
称取离心管的重量，取新鲜的发酵液5mL，8000r/min离心5min，用蒸馏水洗涤离心收集的新鲜的富硒植物乳杆菌2～3次，在85℃烘干至恒重，称重，用恒重后的重量减去初始离心管的重量，得到细胞干重。
6.发酵液pH值的测定
采用pH计进行测定。
7.吸光度的测定
在600nm波长下测定植物乳杆菌浓度，绘制生长曲线。
8.富硒植物乳杆菌的制备工艺路线
活化：将﹣20℃保存的植物乳杆菌粉剂接入MRS肉汤液体培养基，于37℃、120r/min摇床中培养16-18h，然后于MRS肉汤固体培养基上划线培养24h(37℃)。
种子制备：挑取MRS肉汤固体培养基上的单菌落接入MRS肉汤液体培养基，于37℃、120r/min摇床中培养24h，制备得到植物乳杆菌种子液。
发酵：以一定接种量将种子液接种于装有50mL培养液的100mL三角瓶，加入亚硒酸钠并调节pH，于37℃、120r/min摇床中发酵培养。发酵结束后，离心，收集菌体，制成冻干型菌剂。
9.发酵中植物乳杆菌转化亚硒酸钠影响因素
(1)植物乳杆菌生长曲线的测定及培养时间的确定
将植物乳杆菌种子液按照2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基(采用上述MRS肉汤液体培养基)中，于37℃、120r/min摇床培养48h，期间每隔6个小时测活菌数、湿重以及pH值，结果显示，菌体在18～24h达到对数生长末期，此时培养液中的活菌数为1.3×107CFU/mL，pH值为5.4，菌体湿重为3.2×10-1g/mL；24h～36h为稳定期，活菌数和湿重保持相对稳定，从36h后活菌数开始下降，菌体开始进入衰亡期。故在对数生长的中后期菌体量可以达到最大。
(2)亚硒酸钠添加浓度对植物乳杆菌的影响
制备添加亚硒酸钠浓度分别为0、20、40、60、80、100、120、140和160μg/mL的MRS肉汤液体培养基，接种2％(v/v)的种子液，于37℃、120r/min条件下继续培养24h。结果表明：初始培养液中亚硒酸纳浓度为80μg/mL时，培养所得发酵液中活菌量较高、有机硒的含量最高，初始培养液中亚硒酸纳浓度为160μg/mL时，培养所得发酵液中有机硒的含量较高，但是活菌量较少。
(3)pH值对植物乳杆菌生长的影响。
制备pH值分别为3.4、5.4和8.0的MRS肉汤液体培养基。接种2％(v/v)的种子液，于37℃、120r/min摇床中培养24小时，培养过程中利用PBS缓冲液保持pH稳定。培养结束后测其活菌量，结果表明，当pH值低于8.0时菌体量随着pH值的降低而降低，当pH高于8.0时菌体量随着pH值的升高而降低。在pH＝8.0时菌体量达到最高值。
(4)植物乳杆菌生产有机硒的最佳条件(多因素优化)
通过调控接种量、加入亚硒酸钠的量、培养体系pH值等条件，得到植物乳杆菌富集有机硒的最适发酵条件为：接种2％(v/v)的植物乳杆菌种子液，在pH值维持在8.0，亚硒酸钠初始浓度为80μg/mL的环境下，于37℃、120r/min培养24h。经过发酵培养后，植物乳杆菌对亚硒酸钠转化率高达98.3％，细胞内硒的含量高达847.52μg/g，细胞干重达0.23g。最适发酵条件下，活菌量最大且有机硒含量最高，即制得了富硒植物乳杆菌。
总之，本发明发现并利用了pH和亚硒酸钠浓度在发酵培养体系内的相互作用关系，通过控制pH和发酵工艺，实现植物乳杆菌在旺盛生长的过程中高效率的完成无机硒到有机硒的生物转化和积累，且能保证发酵初期植物乳杆菌可以耐受高浓度的亚硒酸钠，因此，为同时提高转化效率和转化量创造了条件。本发明为富硒微生物(富硒乳酸菌)高密度发酵的工业化生产提供实践依据，具有生产成本低、产量高、培养周期短、易于放大培养、绿色安全等优点。

Claims (8)

1.一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将乳酸菌经扩大培养后接种于发酵培养基中，然后于34-37℃、110-130r/min条件下培养24-36h，培养过程中保持培养体系pH为7.5-8.0；所述发酵培养基在接种前预先添加有70-85μg/mL的亚硒酸钠；
2)培养结束后，收集乳酸菌菌体。
2.根据权利要求1所述一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：所述乳酸菌的接种量为2％-6％。
3.根据权利要求1所述一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：所述培养过程中通过添加PBS缓冲液保持培养体系pH稳定。
4.根据权利要求1所述一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：所述扩大培养包括以下步骤：将保存的乳酸菌活化后接种至种子培养基中，然后于34-37℃、110-130r/min条件下培养24-36小时。
5.根据权利要求4所述一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：所述种子培养基选自MRS肉汤液体培养基。
6.根据权利要求1所述一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基为MRS肉汤液体培养基。
7.根据权利要求1所述一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：所述乳酸菌选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
8.根据权利要求1所述一种富硒乳酸菌的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养的条件具体为：在培养体系pH维持在8.0、亚硒酸钠初始浓度为80μg/mL的环境下，于37℃、120r/min下培养24h。
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