CN104195079A - 一种解淀粉乳杆菌l5及其在发酵豆腐黄浆水中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了解淀粉乳杆菌L5及其在发酵黄浆水中的应用。该解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5的保藏号为CGMCC NO.9371；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO1。应用时，先将黄浆水在115-121℃灭菌；按黄浆水体积计，接入3％-6％的解淀粉乳杆菌L5的种子液；在35-47℃保温酸化24-48h，黄浆水的酸度值达60°T-90 °T，获得了一种新型的豆腐点浆剂。本发明解决了自然发酵酸浆水中微生物生长杂乱的问题，提高了酸浆豆腐的质量安全性。本发明直接利用黄浆水中的低聚糖和淀粉等生长产酸，无需补充其它碳源和营养素即可达到点浆剂所需酸度，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸菌和豆制品加工领域，具体涉及一株解淀粉乳酸菌(Lactobacillus amylolyticus)L5及其在制备豆腐凝固剂中的应用。
背景技术
黄浆水为豆腐制作过程中产生的黄色沥水，含有大量水溶性的糖类如水苏糖、棉籽糖等低聚糖，以及异黄酮、蛋白质和维生素等营养物质，非常适合微生物的生长。直接排放不仅会造成资源的浪费，而且会严重污染环境与土壤，因此实现对黄浆水的综合利用引起了国内外科学工作者的关注。
我国传统豆腐生产过程中，石膏和盐卤作为凝固剂长期使用。使用盐卤点浆的豆腐风味极佳，但持水性差，不易放置时间过长；使用石膏作为点浆剂的豆腐持水性好，但成品略带有苦涩味，缺乏大豆香气。近年来研究发现，豆制品加工过程中产生的黄浆水，在存贮的过程中经自然发酵所生成的酸浆水，是一种良好的豆腐凝固剂，已在部分豆制品生产厂家使用，以酸浆水制成的豆腐色泽微黄、口感鲜嫩，无化学点浆剂的苦涩味，属纯天然食品。但目前使用的酸浆水均为自然发酵，所涉及到的微生物除产酸的乳酸菌外，还含有部分其它的细菌和酵母等，其中也有可能污染蜡样芽孢杆菌、葡萄球菌等杂菌，对豆腐及其制品的食用安全性构成危害。
当使用商用乳酸菌如嗜酸乳杆菌对黄浆水进行纯种发酵制备点浆剂时，虽然可以获得安全性高的酸浆水，但需要补充营养素如蔗糖才能达到合适的酸度，增加了生产成本，因此寻找适宜发酵黄浆水的乳酸菌具有重要实际意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一株乳酸菌即解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5。
本发明的另一目的在于提供上述乳酸菌Lactobacillus amylolyticus L5在发酵豆腐黄浆水中的一种应用，解决自然发酵酸浆水中微生物生长杂乱的问题，提高了酸浆豆腐的质量安全性，并降低成本。
本发明通过以下技术方案予以实现：
一株解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.9371，保藏日期为2014年6月23日。
本发明中解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5是通过稀释平板法筛选获得。使用无菌采样瓶现场采样自然发酵而成的酸浆水，低温带回；立即使用无菌水分别稀释至10-3、10-4、10-5倍，涂布于改良的MRS固体培养基上；然后放入37℃的恒温培养箱中，培养48h；挑取疑似菌落，进行平板划线分离，如此重复4～5次，直至获得纯的单菌落。将纯化的单菌落穿刺接种到MRS固体培养基内，于4℃冰箱保存。其中改良MRS液体培养基(g/L)配方为：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，K2HPO4·3H2O2 g，NaAc·3H2O 5 g，柠檬酸三铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，加入蒸馏水到1 L，调pH到6.4±0.2(MRS固体培养基在液体培养基的基础上添加2％或0.7％的琼脂)，121℃灭菌15 min。
本发明中乳杆菌L5的生物活性特征如下：在MRS固体培养基平板上菌落突起，呈圆形，直径一般为1-3 mm，灰白色，不透明，湿润光滑(见图1a)；菌体为革兰氏染色阳性无芽孢杆菌，呈细短杆状，成对或堆状排列(见图1b)；葡萄糖同型发酵，生长温域宽(30-52℃可正常生长，见图2)，生长速度快；常规生理生化实验结果(见表1)表明菌株L5为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、可利用淀粉、同型发酵的无芽孢杆菌(表1)。将所测16S rDNA序列(如SEQ.ID.NO1)通过BLAST比对，鉴定其为解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)(见图3)。
本发明提供解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5在发酵豆腐黄浆水中的应用。
该应用方法包括如下步骤：
(1)将黄浆水在115-121℃灭菌，灭菌的时间为15-30分钟；
(2)按黄浆水体积计，接入3％-6％的解淀粉乳杆菌L6的种子液；
(3)在35-47℃保温酸化24-48h，将黄浆水的酸度值达到60°T以上。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
(1)将Lactobacillus amylolyticus L5种子液接入到灭菌的黄浆水中，进行纯种发酵，获得了一种新型的豆腐点浆剂，解决了自然发酵酸浆水中微生物生长杂乱的问题，提高了酸浆豆腐的质量安全性。
(2)该菌株可以直接利用黄浆水中的低聚糖和淀粉等生长产酸，无需补充其它碳源和营养素即可达到点浆剂所需酸度，降低了生产成本。
(3)该菌株产酸速度快，培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
本发明提供解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5在制备酸豆乳中的应用。
附图说明
图1a为本发明Lactobacillus amylolyticus L5菌株的菌落形态图；
图1b为本发明Lactobacillus amylolyticus L5菌株的菌体形态图；
图2为本发明Lactobacillus amylolyticus L5菌株对温度的适应性曲线示意图；
图3为本发明Lactobacillus amylolyticus L5菌株根据16S rDNA序列所做的系统进化树。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但实施例不构成对本发明要求保护范围的限定。
实施例中需要说明的是：
(1)革兰氏染色、形状观察及常用生理生化鉴定培养基参考凌代文主编的《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》(1999年版)。
(2)对温度的适应性检测按照以下方法：
取100mL三角瓶，加入50 mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，冷却后接种Lactobacillus amylolyticus L5菌株，37℃培养过夜，作为种子培养液备用。在灭菌的改良MRS液体培养基三角瓶中加入1mL种子培养物(发酵接种量为2％(V/V))，分别在22℃，27℃，32℃，37℃，42℃，47℃，52℃等温度下恒温培养，设置3组平行发酵，18 h后，用紫外-可见分光光度计在600 nm处测其OD值。
(3)改良MRS液体培养基(用于乳酸菌的培养)：
牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，K2HPO4·3H2O 2g，NaAc·3H2O 5 g，柠檬酸三铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g；蒸馏水1 L，pH 6.4±0.2(MRS固体培养基在液体培养基的基础上添加0.7-2％的琼脂)，121℃灭菌15 min。
(4)酸度测定参照GB 541334-2010的方法进行测定。具体操作为：将样品搅拌均匀，精确称取10g样品，加入20mL无CO2的蒸馏水，混匀，加入0.5mL酚酞指示剂，用0.1N NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色，且在30s内不变色为终点，酸度的计算按照下面的公式：
X＝(C×V×100)/(m×0.1)
X——样品的酸度，单位°T；
C——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位mol/L；
V——消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位mL；
m——样品的质量，单位g。
实施例1 菌株筛选
(1)使用无菌采样瓶，现场采样自然发酵而成的酸浆水，低温带回。立即使用无菌水分别稀释至10-3、10-4、10-5倍，涂布于改良的MRS固体培养基上。然后放入37℃的恒温培养箱中，培养48h。挑取疑似菌落，进行平板划线分离，如此重复4～5次，直至获得纯的单菌落。将纯化的单菌落用接种针插入含有MRS固体培养基的试管中心，于4℃冰箱内保存。
(2)从自然发酵的酸浆水中分离出菌株L5，其在MRS培养基上的菌落呈圆形、直径一般为1-2 mm，灰白色、不透明状，湿润光滑(图1a)；进行革兰氏染色和细胞形状观察，菌株L5的菌体呈圆端长杆状，单生或链状排列(图1b)。常规生理生化实验结果(见表1，Lactobacillus amylolyticus L5菌株的生理生化特性表)表明菌株L5为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、同型发酵的无芽孢杆菌。葡萄糖同型发酵，生长温域宽(30-52℃可正常生长，见图2)，生长速度快；
表1
注：“+”，阳性反应；“(+)”弱阳性反应；“—”，阴性反应。
实施例2 菌株鉴定
将所得菌株L5活化培养，送专业的检测机构测序，获得16S rDNA序列(见 SEQ.ID.NO1)，结果在NCBI的基因库上进行比对，找出与此菌亲缘相近的标准菌株KC456629.1(Lactobacillus amylolyticus strain TUST015)和KC456630.1(Lactobacillus amylolyticus strain TUST016)，将菌株L5的16S rDNA的部分序列与标准菌进行相似度分析，L5与解淀粉乳杆菌Lactobacillus amylolyticus strain TUST015序列同源性超过97％，应为同一种。使用Clustal X和PHYLIP软件绘制系统生育树(见图3)，再结合菌落、菌体形态，生理生化特征将菌株L5鉴定为解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)。
解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.9371，保藏日期为2014年6月23日。
实施例3 Lactobacillus amylolyticus L5菌株碳水化合物试验
解淀粉乳杆菌L5的碳水化合物发酵试验使用API 50CH与API 50CHL培养基(法国生物梅里埃股份有限公司)。操作步骤按照说明书进行，略有改动。置于42℃的恒温培养箱中培养。试验结果见表2。
表2
注：“+”，阳性反应；“(+)”弱阳性反应；“—”，阴性反应。
解淀粉乳杆菌L5能利用单糖中的D-葡萄糖，D-半乳糖，D-果糖，D-甘露糖。双糖中的D-麦芽糖，D-蔗糖以及多糖中的D-棉子糖和淀粉等都能被菌株所利用。显示出菌株具有水解部分糖苷键的能力。但是，菌株L5不能利用D-乳糖。由于豆腐黄浆水中富含蛋白、油脂、淀粉以及其他糖类，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、水苏糖和棉子糖等。结果显示出解淀粉乳杆菌L5可以利用豆腐黄浆水中富含的低聚糖，适宜在黄浆水中生长。
实施例4 Lactobacillus amylolyticus L5菌株在35℃、42℃、47℃发酵黄浆水的效果
(1)取100mL三角瓶，加入50 mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，接种Lactobacillus amylolyticus L5菌株，42℃培养过夜，作为种子培养液备用。
(2)将豆腐黄浆水分装于1.8×20 cm试管中，使液体高度达到18 cm，用橡胶塞紧塞，作为培养基。121℃灭菌15 min，在无菌环境中按6％(V/V)的添加量接入Lactobacillus amylolyticus L5种子培养液，分别在35℃下恒温培养24h和48 h。
(3)经检测，35℃发酵24h时，酸度值为48.34 °T，发酵48h时，酸度值为60.04 °T；42℃发酵24h，酸度值为71.54 °T，发酵48h时，酸度值为81.45 °T。47℃发酵24h，酸度值为80.75°T，发酵48h时，酸度值为90.41 °T。
利用乳酸菌发酵大豆黄浆水制备豆腐凝固剂主要是经过乳酸菌利用其中的碳水化合物生产有机酸来实现，但是由于大豆黄浆水中的碳水化合物多为低聚糖，并不适宜所有乳酸菌，只有能够利用低聚糖的乳酸菌才可适宜；因此可以利用酸度值的变化来体现本发明菌株的优势。
Claims (5)
1.一种解淀粉乳杆菌L5，其特征在于，该解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)的保藏号为CGMCC NO.9371。
2.根据权利要求1所述的解淀粉乳杆菌L5，其特征在于，解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L5的16S rDNA序列为SEQ.ID.NO1。
3.权利要求1所述解淀粉乳杆菌L5在发酵豆腐黄浆水中的一种应用。
4.根据权利要求3所述的解淀粉乳杆菌L5在发酵豆腐黄浆水中的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)将黄浆水在115-121℃灭菌；
(2)按黄浆水体积计，接入3％-6％的解淀粉乳杆菌L5的种子液；
(3)在35-47℃保温酸化24-48h，黄浆水的酸度值可达到60°T-90 °T。
5.根据权利要求3所述的解淀粉乳杆菌L5在发酵豆腐黄浆水中的应用，其特征在于，所述灭菌的时间为15-30分钟。
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|---|---|---|---|---|
| CN109504617A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-03-22 | 华南理工大学 | 一种哈尔滨乳杆菌及其应用 |
| CN112136904A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-29 | 广东广中皇食品有限公司 | 一种酸水及其制备方法 |
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