CN103131652B - 大豆根瘤菌培养基以及采用其制备大豆液体根瘤菌剂的方法 - Google Patents
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Abstract
大豆根瘤菌培养基以及采用其制备大豆液体根瘤菌剂的方法，它涉及根瘤菌培养基以及采用其制备大豆根瘤菌剂的方法。本发明的目的是为了解决现有存在的大豆液体根瘤菌剂营养不均衡、菌体活性低和发酵工艺制备的大豆根瘤菌在室温下不能稳定存活的问题，本发明的大豆根瘤菌培养基是由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液，通过控制发酵罐条件，即得。本发明的菌剂20℃保存12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上。
Description
技术领域
本发明涉及根瘤菌培养基以及采用其制备大豆根瘤菌剂的方法。
背景技术
中国耕地面积占全世界耕地面积的7%，而氮肥用量却占全球总用量的25%，是世界平均用量的3.75倍。生产化工合成氮肥将消耗大量的、不可再生的石化原料，如天然气、石油和煤炭等。随着自然能源有限储量的不断减少，石油天然气的价格将持续攀升，从而不可避免地拉动化肥价格上涨。化肥工业还是造成环境污染，产生温室气体的重要源头。化肥在施入田间后会造成土壤板结，降低土地生产潜力。植物对化肥的吸收利用率只有30%，这意味着有70%的氮肥不仅没有滋养作物，而且进入地下水源和空气中，造成饮用水和空气质量下降，进而危害我们的身体健康。
事实上大豆生长所需的氮素营养基本上由根瘤菌提供，如果没有根瘤菌的存在，每亩要施一百多公斤尿素才能满足亩产180公斤大豆的氮肥需求。
一亩地产180公斤大豆，同时还要产270公斤的秸秆；
大豆蛋白质含量按40%计算：180×0.4=72公斤（蛋白质）；
秸秆蛋白质含量按10%计算:270×0.1=27公斤（蛋白质）；
一亩地产蛋白质：72+27=99公斤；
蛋白质的氮含量为16%，生产99公斤蛋白质需99×0.16=15.84公斤纯氮；
15.84公斤纯氮折合尿素：15.84÷0.46=34.43公斤尿素；
考虑到尿素的利用率一般在30%以下，34.43÷0.3=115公斤。
这就是说，如果没有根瘤菌提供氮肥，每生产180公斤大豆需要施115公斤尿素才能满足氮素需求。所以说大豆的氮肥基本上是根瘤菌贡献的。由此可见，根瘤菌的好与坏对大豆的生产至关重要。
根瘤菌接种技术之所以在我国未能广泛采用，除了科学知识普及不够，农民对根瘤菌的作用不甚了解外，最主要原因是根瘤菌产品质量不过关，保质期短。根瘤菌剂的有效成份是活的根瘤菌，但如果制剂不过关，当产品经过一个长的供应链到达农民手中时往往只有少量活性根瘤菌，实际应用效果不明显。
目前，采用文献公开报道的培养基和常规发酵工艺（主要是用于芽孢杆菌发酵）的方法生产大豆液体根瘤菌剂，存在着营养不平衡、菌体活性低的弊端，而且，目前培养大豆根瘤菌的培养基碳源交单一，虽然大多数培养基能很好地支持根瘤菌生长，菌数可达30-80亿/毫升，但它们基本上都难以在室温下稳定存活，其常温放置2个月的活菌数仅为1~10%。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有存在的大豆液体根瘤菌剂营养不均衡、菌体活性低和发酵工艺制备的大豆根瘤菌在室温下不能稳定存活的问题，而提供大豆根瘤菌培养基以及采用其制备大豆液体根瘤菌剂的方法。
本发明的大豆根瘤菌培养基，是由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，丙三醇浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、葡萄糖浓度为1~3克/升、鼠李糖浓度为1~3克/升、果糖浓度为1~3克/升、α-酮戊二酸浓度为0.5~1.5克/升、酵母粉浓度为2.5~4.5克/升、丝氨酸浓度为0.13~0.25克/升、精氨酸浓度为0.1~0.2克/升、NH4Cl浓度为0.65～1.6克/升、K2HPO4浓度为1~3克/升、KH2PO4浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4·7H2O浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2·2H2O浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4·7H2O浓度为0.005~0.011克/升、NaCl浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.01~0.03克/升以及生物素浓度为0.0005~0.002克/升，所述的水溶液pH为6.8~7.5。
本发明的大豆液体根瘤菌剂的制备方法是按以下步骤进行的：
一、按丙三醇的浓度为1~3克/升、甘露醇的浓度为1~3克/升、葡萄糖的浓度为1~3克/升、鼠李糖的浓度为1~3克/升、果糖的浓度为1~3克/升、α-酮戊二酸的浓度为0.5～1.5克/升、酵母粉的浓度为2.5~4.5克/升、丝氨酸的浓度为0.13~0.25克/升、精氨酸的浓度为0.1~0.2克/升、NH4Cl的浓度为0.65~1.6克/升、K2HPO4的浓度为1~3克/升、KH2PO4的浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.005~0.011克/升、NaCl的浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.01~0.03克/升和生物素的浓度为0.0005~0.002克/升称取上述物质，并依次加入到纯水中混合均匀，调节pH至6.8~7.5，得大豆液体根瘤菌培养基；
二、将步骤一得到的大豆液体根瘤菌培养基加入到发酵罐中，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至30℃时，将大豆根瘤菌按体积百分含量为5%~10%的接种量接种至灭菌的大豆液体根瘤菌培养基中，在温度为25℃~35℃、搅拌速度为50~150r/min、空气流量为0.3~0.6v/v/m、罐压为0.05~0.2kPa、溶氧为60%~80%、发酵液pH为6.5~7.5的条件下，发酵72～144h，即得大豆液体根瘤菌剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用甘油、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸等物质组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，并用优化的发酵工艺控制大豆根瘤菌的生产过程，制备得到的大豆液体根瘤菌剂在20℃恒温柜中保存12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上，中国农业部微生物肥料及食用菌菌种质量检测中心对本发明的菌剂抽样检测的结果为110亿/毫升，杂菌数为0。目前我国的农业微生物菌剂（包括根瘤菌剂）的国家标准为2亿/克活菌数，相比提高了50倍。国外液体大豆根瘤菌剂最好产品的实测活菌数为50亿左右，保质期为12个月，保证最低活菌数不低于20亿/毫升。本产品的活菌数高于国外最好产品。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的大豆根瘤菌培养基，是由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，丙三醇浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、葡萄糖浓度为1~3克/升、鼠李糖浓度为1~3克/升、果糖浓度为1~3克/升、α-酮戊二酸浓度为0.5~1.5克/升、酵母粉浓度为2.5~4.5克/升、丝氨酸浓度为0.13~0.25克/升、精氨酸浓度为0.1~0.2克/升、NH4Cl浓度为0.65～1.6克/升、K2HPO4浓度为1~3克/升、KH2PO4浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4·7H2O浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2·2H2O浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4·7H2O浓度为0.005~0.011克/升、NaCl浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为001~0.03克/升以及生物素浓度为0.0005~0.002克/升，所述的水溶液pH为6.8~7.5。
本实施方式采用甘油、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸等物质组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，并用优化的发酵工艺控制大豆根瘤菌的生产过程，制备得到的大豆液体根瘤菌剂在20℃恒温柜中保存12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上，中国农业部微生物肥料及食用菌菌种质量检测中心对本发明的菌剂抽样检测的结果为110亿/毫升，杂菌数为0。目前我国的农业微生物菌剂（包括根瘤菌剂）的国家标准为2亿/克活菌数，相比提高了50倍。国外液体大豆根瘤菌剂最好产品的实测活菌数为50亿左右，保质期为12个月，保证最低活菌数不低于20亿/毫升。本产品的活菌数高于国外最好产品。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的丙三醇浓度为1.5~2.5克/升、甘露醇浓度为1.5~2.5克/升、葡萄糖浓度为1.5~2.5克/升、鼠李糖浓度为1.5~2.5克/升、果糖浓度为1.5~2.5克/升、α-酮戊二酸浓度为0.75~1.25克/升、酵母粉浓度为3.0~4.0克/升、丝氨酸浓度为0.15~0.20克/升、精氨酸浓度为0.125~0.175克/升、NH4Cl浓度为0.8~1.25克/升、K2HPO4浓度为1.1~1.6克/升、KH2PO4浓度为0.25~0.4克/升、MgSO4·7H2O浓度为0.15~0.25克/升、CaCl2·2H2O浓度为0.11~0.15克/升、FeSO4·7H2O浓度为0.006~0.009克/升、NaCl浓度为0.08~0.12克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.015~0.025克/升和生物素浓度为0.0008~0.0012克/升。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述的丙三醇浓度为2.0克/升、甘露醇浓度为2.0克/升、葡萄糖浓度为2.0克/升、鼠李糖浓度为2.0克/升、果糖浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸浓度为1.0克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、丝氨酸浓度为0.18克/升、精氨酸浓度为0.15克/升、NH4Cl浓度为1.1克/升、K2HPO4浓度为1.2克/升、KH2PO4浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O浓度为0.2克/升、CaCl2·2H2O浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O浓度为0.0083克/升、NaCl浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升和生物素浓度为0.001克/升。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述的水溶液pH为7.0~7.2。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述的水溶液pH为7.1。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式的大豆液体根瘤菌剂的制备方法是按以下步骤进行的：
一、按丙三醇的浓度为1~3克/升、甘露醇的浓度为1~3克/升、葡萄糖的浓度为1~3克/升、鼠李糖的浓度为1~3克/升、果糖的浓度为1~3克/升、α-酮戊二酸的浓度为0.5~1.5克/升、酵母粉的浓度为2.5~4.5克/升、丝氨酸的浓度为0.13~0.25克/升、精氨酸的浓度为0.1~0.2克/升、NH4Cl的浓度为0.65~1.6克/升、K2HPO4的浓度为1~3克/升、KH2PO4的浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.005~0.011克/升、NaCl的浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.01~0.03克/升和生物素的浓度为0.0005~0.002克/升称取上述物质，并依次加入到纯水中混合均匀，调节pH至6.8~7.5，得大豆液体根瘤菌培养基；
二、将步骤一得到的大豆液体根瘤菌培养基加入到发酵罐中，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至30℃时，将大豆根瘤菌按体积百分含量为5%~10%的接种量接种至灭菌的大豆液体根瘤菌培养基中，在温度为25℃~35℃、搅拌速度为50~150r/min、空气流量为0.3~0.6v/v/m、罐压为0.05~0.2kPa、溶氧为60%~80%、发酵液pH为6.5~7.5的条件下，发酵72～144h，即得大豆液体根瘤菌剂。
本实施方式中的v/v/m为发酵行业专有的表示空气流量的单位，0.3~0.6v/v/m表示每分钟进入发酵罐的空气体积是培养基体积的0.3~0.6倍。
本实施方式通过搅拌速度的变化来达到控制溶氧的目的，当溶氧低于60%时控制系统自动增加转速，当溶氧高于80%时控制系统自动降低转速。
本实施方式采用甘油、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸等物质组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，并用优化的发酵工艺控制大豆根瘤菌的生产过程，制备得到的大豆液体根瘤菌剂在20℃恒温柜中保存12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上，中国农业部微生物肥料及食用菌菌种质量检测中心对本发明的菌剂抽样检测的结果为110亿/毫升，杂菌数为0。目前我国的农业微生物菌剂（包括根瘤菌剂）的国家标准为2亿/克活菌数，相比提高了50倍。国外液体大豆根瘤菌剂最好产品的实测活菌数为50亿左右，保质期为12个月，保证最低活菌数不低于20亿/毫升。本产品的活菌数高于国外最好产品。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤一中所述的按丙三醇浓度为1.5~2.5克/升、甘露醇浓度为1.5~2.5克/升、葡萄糖浓度为1.5~2.5克/升、鼠李糖浓度为1.5~2.5克/升、果糖浓度为1.5~2.5克/升、α-酮戊二酸浓度为0.75~1.25克/升、酵母粉浓度为3.0~4.0克/升、丝氨酸浓度为0.15~0.20克/升、精氨酸浓度为0.125~0.175克/升、NH4Cl浓度为0.8~1.25克/升、K2HPO4浓度为1.1~1.6克/升、KH2PO4浓度为0.25~0.4克/升、MgSO4·7H2O浓度为0.15~0.25克/升、CaCl2·2H2O浓度为0.11~0.15克/升、FeSO4·7H2O浓度为0.006~0.009克/升、NaCl浓度为0.08~0.12克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.015~0.025克/升和生物素浓度为0.0008~0.0012克/升称取上述物质。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：步骤一中所述的按丙三醇浓度为2克/升、甘露醇浓度为2.0克/升、葡萄糖浓度为2.0克/升、鼠李糖浓度为2.0克/升、果糖浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸浓度为1.0克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、丝氨酸浓度为0.18克/升、精氨酸浓度为0.15克/升、NH4Cl浓度为1.1克/升、K2HPO4浓度为1.2克/升、KH2PO4浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O浓度为0.2克/升、CaCl2·2H2O浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O浓度为0.0083克/升、NaCl浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升以及生物素浓度为0.001克/升称取上述物质。其它与具体实施方式六或七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：步骤二中所述的大豆液体根瘤菌培养基占发酵罐总体积的60%~80%。其它与具体实施方式六至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：步骤二中所述的大豆液体根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70%。其它与具体实施方式六至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式六至十之一不同的是：步骤二中所述的在温度为29~31℃、搅拌速度为75~125r/min、空气流量为0.35~0.55v/v/m、罐压为0.075~0.18kPa、溶氧为65~75%、发酵液pH为6.8~7.3的条件下，发酵72~144h。其它与具体实施方式六至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式六至十一之一不同的是：步骤二中所述的在温度为30℃、搅拌速度为100r/min、空气流量为0.45v/v/m、罐压为0.1kPa、溶氧为70%、发酵液pH为7.2的条件下，发酵72~144h。其它与具体实施方式六至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式六至十二之一不同的是：步骤二中所述的发酵80~130h。其它与具体实施方式六至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式六至十三之一不同的是：步骤二中所述的发酵90~120h。其它与具体实施方式六至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式六至十四之一不同的是：步骤二中所述的发酵100h。其它与具体实施方式六至十四之一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式六至十五之一不同的是：步骤一中所述的调节pH至7.0~7.3。其它与具体实施方式六至十五之一相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式六至十六之一不同的是：步骤一中所述的调节pH至7.2。其它与具体实施方式六至十六之一相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式六至十七之一不同的是：步骤一中所述的调节pH至7.2。其它与具体实施方式六至十七之一相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式六至十八之一不同的是：待培养基温度降至30℃。其它与具体实施方式六至十八之一相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式六至十九之一不同的是：步骤二中所述的将大豆根瘤菌按7%~9%的接种量接种至灭菌的大豆液体根瘤菌培养基中。其它与具体实施方式六至十九之一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式六至二十之一不同的是：步骤二中所述的将大豆根瘤菌按8%的接种量接种至灭菌的大豆液体根瘤菌培养基中。其它与具体实施方式六至二十之一相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式六至二十一之一不同的是：步骤二中所述的大豆根瘤菌为慢生型大豆根瘤菌。其它与具体实施方式六至二十一之一相同。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
试验1
本试验摇瓶制备大豆液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
一、按丙三醇的浓度为2.0克/升、甘露醇的浓度为2.0克/升、葡萄糖的浓度为2.0克/升、鼠李糖的浓度为2.0克/升、果糖的浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸的浓度为1.0克/升、酵母粉的浓度为3.5克/升、丝氨酸的浓度为0.18克/升、精氨酸的浓度为0.15克/升、NH4Cl的浓度为1.1克/升、K2HPO4的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.13克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.0083克/升、NaCl的浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.02克/升和生物素的浓度为0.001克/升称取上述物质，并依次加入到1L纯水中混合均匀，调节pH至7.2，得大豆液体根瘤菌培养基；
二、摇瓶培养试验：将100mL步骤一配制大豆液体培养基分装入一个250mL的三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却到30℃后接种一环慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)活化的斜面菌种，在温度为30℃、转速为180r/min的条件下振荡培养96h，得种子菌液；将灭菌过的装有100mL大豆液体根瘤菌培养基的三个250mL三角瓶，分为摇瓶1、摇瓶2和摇瓶3；将5mL种子菌液转至摇瓶1、摇瓶2和摇瓶3中，然后在温度为30℃、转速为180r/min的条件下振荡培养120h，即得大豆液体根瘤菌剂。
本试验的慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大学微生物菌种保藏中心，地址：北京圆明园西路2号，保藏编号：CCBAU15464。
将摇瓶1、摇瓶2和摇瓶3得到的大豆液体根瘤菌剂在温度为20℃条件下，分别放置3个月、6个月以及9个月，通过平板计数检测菌数，结果见表1。
表1摇瓶培养大豆根瘤菌试验数据
*注：由于三角瓶的瓶塞具有透气性，储存过程会有水分损失，每个月补加无菌水至原体积。
由表1可知，摇瓶发酵得到的大豆液体根瘤菌剂，起始菌数为81.7亿/mL，在20°C条件下放置3个月后菌数高于刚培养结束时的菌数，表明根瘤菌在摇瓶中可缓慢增长，随后菌数就缓慢下降，9个月时活菌数仍有72亿/mL。
试验2
本试验小试发酵制备大豆液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
一、按丙三醇的浓度为2.0克/升、甘露醇的浓度为2.0克/升、葡萄糖的浓度为2.0克/升、鼠李糖的浓度为2.0克/升、果糖的浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸的浓度为1.0克/升、酵母粉的浓度为3.5克/升、丝氨酸的浓度为0.18克/升、精氨酸的浓度为0.15克/升、NH4Cl的浓度为1.1克/升、K2HPO4的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.13克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.0083克/升、NaCl的浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.02克/升和生物素的浓度为0.001克/升称取上述物质，并依次加入到1L纯水中混合均匀，调节pH至7.2，得大豆液体根瘤菌培养基；
二、将装有步骤一得到的大豆液体根瘤菌培养基的三个5升台式发酵罐，分为1批、2批和3批样品；将慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)活化的菌种按体积百分含量5%的接种量分别接种到装有1批、2批和3批样品发酵罐内，然后在温度为30℃、转速为250r/min、空气流量为1.58L/min、发酵液pH为6.5~7.5的条件下发酵120h，即得大豆液体根瘤菌剂，在无菌条件下分装到灭菌的三角瓶中，20℃储存备检。
本试验的慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大学微生物菌种保藏中心，地址：北京圆明园西路2号，保藏编号：CCBAU15464。
将第1批、第2批和第3批得到的大豆液体根瘤菌剂在温度为20℃条件下，分别放置3个月和6个月，通过平板计数检测菌数，结果见表2。
表2小试发酵生产大豆根瘤菌试验数据
*注：由于三角瓶的瓶塞具有透气性，储存过程会有水分损失，每个月补加无菌水至原体积。
由表2可知，小试发酵得到的大豆液体根瘤菌剂，起始菌数为115亿/mL，在20°C条件下放置3个月后菌数高于刚培养结束时的菌数，表明根瘤菌在摇瓶中可缓慢增长，随后菌数就缓慢下降，6个月时活菌数仍有126亿/mL。
而现有的YMB培养基是最常用的根瘤菌培养基，其组成如下：10克/升的甘露醇、0.5克/升的K2HPO4、0.2克/升的MgSO4·7H2O、0.1克/升的NaCl、0.5克/升的酵母粉和1000毫升纯水（详见Vincent J.M.1970A manual for the practical study of root-nodule bacteria.IBP handbook15.Blackwell Scientific Publications,Oxford.)。
采用YMB培养基按照本试验的方法培养慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)只能获得20~30亿/毫升的菌数，而且在室温下保存2个月后90%的菌死亡，无法用作大规模生产液体大豆根瘤菌剂。由此可知，20°C保存6个月后本试验的方法培养慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)与YMB培养基培养相比提高35倍以上。
试验3
本试验中试发酵制备大豆液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
一、按丙三醇的浓度为2.0克/升、甘露醇的浓度为2.0克/升、葡萄糖的浓度为2.0克/升、鼠李糖的浓度为2.0克/升、果糖的浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸的浓度为1.0克/升、酵母粉的浓度为3.5克/升、丝氨酸的浓度为0.18克/升、精氨酸的浓度为0.15克/升、NH4Cl的浓度为1.1克/升、K2HPO4的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.13克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.0083克/升、NaCl的浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.02克/升和生物素的浓度为0.001克/升称取上述物质，并依次加入到1L纯水中混合均匀，调节pH至7.2，得大豆液体根瘤菌培养基；
二、向三个300升304不锈钢发酵罐内加入210升步骤一得到的大豆液体根瘤菌培养基，即大豆根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70%；将慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)活化的种子菌液按体积百分含量7.5%的接种量分别接种到发酵罐内，然后在温度为30℃、搅拌速度为100r/min、空气流量为0.45v/v/m、罐压为0.1kPa、溶氧为70%、发酵液pH为7.2的条件下发酵120h，即得液体大豆根瘤菌剂，在无菌条件下分装到伽马线灭菌的双层塑料袋中，每袋装225mL，备用。
本试验中的v/v/m为发酵行业专有的表示空气流量的单位，0.45v/v/m表示每分钟进入发酵罐的空气体积是培养基体积的0.45倍。本试验通过搅拌速度的变化来达到控制溶氧的目的，当溶氧低于70%时控制系统自动增加转速，当溶氧高于70%时控制系统自动降低转速。
本试验的慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大学微生物菌种保藏中心，地址：北京圆明园西路2号，保藏编号：CCBAU15464。
将第1批、第2批和第3批得到的大豆液体根瘤菌剂在温度为20℃条件下，分别放置3个月和6个月，通过平板计数检测活菌数，结果见表3。
表3中试发酵罐生产大豆根瘤菌试验数据
*注：根瘤菌液装在密封的塑料袋中，无水分损失。
由表3可知，中试发酵得到的大豆液体根瘤菌剂，起始菌数为120亿/mL，在20°C条件下放置3个月后菌数高于刚培养结束时的菌数，表明根瘤菌在塑料袋中可缓慢增长，随后菌数就缓慢下降，6个月时活菌数仍有87亿/mL。
试验4
本试验大规模发酵制备大豆液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
一、按丙三醇的浓度为2.0克/升、甘露醇的浓度为2.0克/升、葡萄糖的浓度为2.0克/升、鼠李糖的浓度为2.0克/升、果糖的浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸的浓度为1.0克/升、酵母粉的浓度为3.5克/升、丝氨酸的浓度为0.18克/升、精氨酸的浓度为0.15克/升、NH4Cl的浓度为1.1克/升、K2HPO4的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.13克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.0083克/升、NaCl的浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.02克/升和生物素的浓度为0.001克/升称取上述物质，并依次加入到1L纯水中混合均匀，调节pH至7.2，得大豆液体根瘤菌培养基；
二、向三个5吨304不锈钢发酵罐内分别加入3.5吨步骤一得到的大豆液体根瘤菌培养基，即大豆液体根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70%；将其分为1批、2批和3批培养基；然后将1批、2批和3批培养基在121℃温度下高压蒸汽灭菌20min，待培养基温度降至30℃时，将慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japoicum)活化的菌种按体积百分含量7.5%的接种量分别接种到装有1批、2批和3批样品不锈钢发酵罐内，然后在温度为30℃、搅拌速度为100r/min、空气流量为0.45v/v/m、罐压为0.1kPa、溶氧为70%、发酵液pH为7.2的条件下发酵120h，即得大豆液体根瘤菌剂，在无菌条件下分装到伽马线灭菌的双层塑料袋中，每袋装225mL，备用。
本试验中的v/v/m为发酵行业专有的表示空气流量的单位，0.45v/v/m表示每分钟进入发酵罐的空气体积是培养基体积的0.45倍。本试验通过搅拌速度的变化来达到控制溶氧的目的，当溶氧低于70%时控制系统自动增加转速，当溶氧高于70%时控制系统自动降低转速。
本试验的慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大学微生物菌种保藏中心，地址：北京圆明园西路2号，保藏编号：CCBAU15464。
将第1批、第2批和第3批得到的大豆液体根瘤菌剂，每批取20袋在温度为20℃条件下，分别放置3个月、6个月、9个月和12个月，通过平板计数检测菌数，结果见表4。
表4大规模发酵生产大豆根瘤菌试验数据
由表4可以看出，5吨发酵罐的控制系统更完善，可以为根瘤菌的生长提供更为有利的环境，活菌数更高。在20°C恒温柜中保存12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上；由中国农业部微生物肥料及食用菌菌种质量检测中心对本次试验进行抽样检测的结果为110亿/毫升。
在种子上存活期长短是衡量液体根瘤菌剂产品的另一个重要指标。如果根瘤菌施到种子上后迅速死亡，等到种子发芽时只有少数菌存活，那么接种根瘤菌的效果会大打折扣。
将本试验得到的大豆液体根瘤菌剂与以YMB为培养基，按照本试验的方法制备的大豆液体根瘤菌剂进行对比试验：将本试验得到的大豆液体根瘤菌剂与YMB培养的大豆液体根瘤菌剂分别按每千克大豆种子接种2.8毫升根瘤菌剂然后在15℃条件下储存，定期测定种子上活菌数，结果见表5；其中，YMB培养基是最常用的根瘤菌培养基，其组成如下：10克/升的甘露醇、0.5克/升的K2HPO4、0.2克/升的MgSO4·7H2O、0.1克/升的NaCl、0.5克/升的酵母粉和1000毫升纯水（详见Vincent J.M.1970A manual for the practical study ofroot-nodulebacteria.IBP handbook15.Blackwell Scientific Publications,Oxford.)。
表5种子上活菌数数据
由表5可知，在168小时后，本试验所产根瘤菌剂在种子上的活菌数是YMB所产根瘤菌的130倍，由此可知，本试验制备得到的大豆液体根瘤菌剂营养均衡、菌体活性高、在种子上存活时间长。
Claims (6)
1.大豆根瘤菌培养基，其特征在于所述的大豆根瘤菌培养基，是由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，丙三醇的浓度为2.0克/升、甘露醇的浓度为2.0克/升、葡萄糖的浓度为2.0克/升、鼠李糖的浓度为2.0克/升、果糖的浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸的浓度为1.0克/升、酵母粉的浓度为3.5克/升、丝氨酸的浓度为0.18克/升、精氨酸的浓度为0.15克/升、NH4Cl的浓度为1.1克/升、K2HPO4的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.13克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.0083克/升、NaCl的浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.02克/升和生物素的浓度为0.001克/升，所述的水溶液pH为6.8～7.5。
2.利用权利要求1所述的大豆根瘤菌培养基制备大豆液体根瘤菌剂的方法，其特征在于大豆液体根瘤菌剂的制备方法是按以下步骤进行的：
一、按丙三醇的浓度为2.0克/升、甘露醇的浓度为2.0克/升、葡萄糖的浓度为2.0克/升、鼠李糖的浓度为2.0克/升、果糖的浓度为2.0克/升、α-酮戊二酸的浓度为1.0克/升、酵母粉的浓度为3.5克/升、丝氨酸的浓度为0.18克/升、精氨酸的浓度为0.15克/升、NH4Cl的浓度为1.1克/升、K2HPO4的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34克/升、MgSO4·7H2O的浓度为0.13克/升、CaCl2·2H2O的浓度为0.13克/升、FeSO4·7H2O的浓度为0.0083克/升、NaCl的浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O的浓度为0.02克/升和生物素的浓度为0.001克/升称取上述物质，并依次加入到纯水中混合均匀，调节pH至6.8～7.5，得大豆液体根瘤菌培养基；
二、将步骤一得到的大豆液体根瘤菌培养基加入到发酵罐中，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至30℃时，将大豆根瘤菌按体积百分含量为5%～10%的接种量接种至灭菌的大豆液体根瘤菌培养基中，在温度为25～35℃、搅拌速度为50～150r/min、空气流量为0.3～0.6v/v/m、罐压为0.05～0.2kPa、溶氧为60%～80%、发酵液pH为6.5～7.5的条件下，发酵72～144h，即得大豆液体根瘤菌剂。
3.根据权利要求2所述的大豆液体根瘤菌剂的制备方法，其特征性在于步骤二中所述的大豆液体根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70%。
4.根据权利要求2所述的大豆液体根瘤菌剂的制备方法，其特征性在于步骤二中所述的在温度为29～31℃、搅拌速度为75～125r/min、空气流量为0.35～0.55v/v/m、罐压为0.075～0.18kPa、溶氧为65～75%、发酵液pH为6.8～7.3的条件下，发酵72～144h。
5.根据权利要求2或4所述的大豆液体根瘤菌剂的制备方法，其特征性在于步骤二中所述的在温度为30℃、搅拌速度为100r/min、空气流量为0.45v/v/m、罐压为0.1kPa、溶氧为70%、发酵液pH为7.2的条件下，发酵72～144h。
6.根据权利要求2所述的大豆液体根瘤菌剂的制备方法，其特征性在于步骤二中所述的大豆根瘤菌为慢生型大豆根瘤菌。
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