CN107245469A - 花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生液体根瘤菌剂的方法 - Google Patents

花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生液体根瘤菌剂的方法 Download PDF

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姜亚军
司海丽
曹宝玲
宋少华
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Abstract

本发明涉及花生根瘤菌剂技术领域，具体涉及花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生液体根瘤菌剂的方法。该花生根瘤菌培养基，是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液。由于采用海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、赖氨酸、组氨酸和尿素组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，使得能够精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，并且该花生根瘤菌培养基能够在室温下稳定存活。该制备花生液体根瘤菌剂的方法制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高的优点。

Description

花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生液体根瘤菌剂的方法
技术领域
本发明涉及花生根瘤菌剂技术领域，具体涉及花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生液体根瘤菌剂的方法。
背景技术
中国耕地面积占全世界耕地面积的7%，而氮肥用量却占全球总用量的25%，是世界平均用量的3.75倍。生产化工合成氮肥将消耗大量的、不可再生的石化原料，如天然气、石油和煤炭等。随着自然能源有限储量的不断减少，石油天然气的价格将持续攀升，从而不可避免地拉动化肥价格上涨。化肥工业还是造成环境污染，产生温室气体的重要源头。化肥在施入田间后会造成土壤板结，降低土地生产潜力。植物对化肥的吸收利用率只有30%，这意味着有70%的氮肥不仅没有滋养作物，而且进入地下水源和空气中，造成饮用水和空气质量下降，进而危害我们的身体健康。
事实上花生生长所需的氮素营养基本上由根瘤菌提供，如果没有根瘤菌的存在，每亩要施一百多公斤尿素才能满足亩产200公斤花生的氮肥需求。
每亩按400公斤花生，400公斤秸秆来计算：
花生蛋白质含量平均为25%；秸秆含蛋白质10%
400 x 25% + 400 x 10%= 140 公斤蛋白质
140公斤蛋白质折合纯氮
140/ 6.25 = 22.4公斤纯氮
22.4 公斤纯氮等于48.7公斤尿素，
考虑到尿素的植物吸收利用率为30%左右，48.7÷30%=162.3，这意味着如果没有花生根瘤菌提供的氮素营养，每亩要施162公斤尿素才能生产400公斤花生。所以说花生的氮肥基本上是根瘤菌贡献的。由此可见，根瘤菌的好与坏对花生的生产至关重要。
根瘤菌接种技术之所以在我国未能广泛采用，除了科学知识普及不够，农民对根瘤菌的作用不甚了解外，最主要原因是根瘤菌产品质量不过关，保质期短。根瘤菌剂的有效成份是活的根瘤菌，但如果制剂不过关，当产品经过一个长的供应链到达农民手中时往往只有少量活性根瘤菌，实际应用效果不明显。
目前，采用文献公开报道的培养基和常规发酵工艺（主要是用于芽孢杆菌发酵）的方法生产花生液体根瘤菌剂，存在着营养不平衡、菌体活性低的弊端，而且，目前培养花生根瘤菌的培养基碳源单一，虽然大多数培养基能很好地支持根瘤菌生长，菌数可达30-80亿/毫升，但它们基本上都难以在室温下稳定存活，其常温放置2个月的活菌数仅为1~10%。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供花生根瘤菌培养基，该花生根瘤菌培养基的碳源丰富，能够在室温下稳定存活。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，该方法制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高的优点。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供花生根瘤菌培养基，是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，海藻糖浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、蔗糖浓度为1~3克/升、柠檬酸浓度为1~3克/升、酵母粉浓度为2.5~4.5克/升、赖氨酸浓度为0.13~0.25克/升、组氨酸浓度为0.1~0.2克/升、尿素浓度为1~3克/升、KH2PO4浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.05~0.11克/升、NaCl浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.01~0.03克/升、生物素浓度为0.0005~0.002克/升，所述的水溶液pH为6.8~7.5；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为1~30克/升。
优选的，所述的花生根瘤菌培养基，海藻糖浓度为1.5~2.5克/升、甘露醇浓度为1.5~2.5克/升、蔗糖浓度为1.5~2.5克/升、柠檬酸浓度为1.5~2.5克/升、酵母粉浓度为3.0~4.0克/升、赖氨酸浓度为0.17~0.21克/升、组氨酸浓度为0.13~0.17克/升、尿素浓度为1.5~2.5克/升、KH2PO4浓度为0.3~0.4克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.15~0.25克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.12~0.16克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.07~0.09克/升、NaCl浓度为0.08~0.12克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.015~0.025克/升、生物素浓度为0.0007~0.0011克/升；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为5~25克/升。
更为优选的，所述的花生根瘤菌培养基，海藻糖浓度为2克/升、甘露醇浓度为2克/升、蔗糖浓度为2克/升、柠檬酸浓度为2克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、赖氨酸浓度为0.19克/升、组氨酸浓度为0.15克/升、尿素浓度为2克/升、KH2PO4浓度为0.35克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.12克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.14克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.08克/升、NaCl浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升、生物素浓度为0.0009克/升；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为15克/升。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供一种采用上述所述的花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、按照海藻糖浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、蔗糖浓度为1~3克/升、柠檬酸浓度为1~3克/升、酵母粉浓度为2.5~4.5克/升、赖氨酸浓度为0.13~0.25克/升、组氨酸浓度为0.1~0.2克/升、尿素浓度为1~3克/升、KH2PO4浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.05~0.11克/升、NaCl浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.01~0.03克/升和生物素浓度为0.0005~0.002克/升的配方量称取上述物质，并将所称取的上述物质依次加入到水中混合均匀，然后调节pH至6.8~7.5，制得花生根瘤菌培养基；
步骤二、往发酵罐中添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，然后将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，于一定温度下高压灭菌一定时间，待花生根瘤菌培养基的温度降至一定温度时，将花生根瘤菌按体积百分含量为5%~10%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为25~35℃、搅拌速度为50~150 r/min、空气流量为0.3~0.6v/v/ m、罐压为0.05~0.2kPa、溶氧为60%~80%、发酵液pH为6.5~7.5的条件下，发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂。
上述技术方案中，所述步骤二中，所述高压灭菌的温度为118~125℃，所述高压灭菌的时间为15~25min。
上述技术方案中，所述步骤二中，待花生根瘤菌培养基的温度降至25~35℃时，将花生根瘤菌培养基按体积百分含量为5%~10%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中。
上述技术方案中，所述步骤二中，所述花生根瘤菌培养基占所述发酵罐总体积的65%~75%。
上述技术方案中，优选的，所述步骤二中，在温度为29~31℃、搅拌速度为70~120r/min、空气流量为0.4~0.6v/v/ m、罐压为0.08~0.18kPa、溶氧为65~75%、发酵液pH为6.8~7.2的条件下，发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂。
上述技术方案中，优选的，所述步骤二中，在温度为30℃、搅拌速度为95r/min、空气流量为0.5v/v/m、罐压为0.11kPa、溶氧为70%、发酵液pH为7.1的条件下，发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂；
所述步骤二中，在将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，浓度为1~30克/升，聚乙烯吡咯烷酮PVP90在加入根瘤菌液之前需要灭菌，将聚乙烯吡咯烷酮PVP90按150克/升溶解在纯净水中，在另外一个发酵罐中灭菌，121°C灭菌20分钟，冷却到30°C以下，按根瘤菌菌液11%的量加入PVP90，使根瘤菌液的PVP90的最终含量达到15克/升。
上述技术方案中，所述步骤二中，所述花生根瘤菌为慢生型花生根瘤菌。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
（1）本发明提供的花生根瘤菌培养基，由于采用海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、赖氨酸、组氨酸和尿素组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，使得能够精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，结合精确控制发酵工艺参数，使得花生根瘤菌的活菌数提高。在灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，聚乙烯吡咯烷酮PVP90可以显著提高花生根瘤菌在包装袋内的存活率，延长保质期，还为根瘤菌在种子上干燥条件下的存活提供保护作用。因此，该花生根瘤菌培养基的碳源丰富，并且该花生根瘤菌培养基能够在室温下稳定存活。
（2）本发明提供的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，由于利用优化的发酵工艺控制花生根瘤菌的生产过程，制备得到的花生液体根瘤菌剂在20℃恒温柜中保存12个月后其活菌数仍然达到每毫升100亿以上，中国农业部微生物肥料及食用菌菌种质量检测中心对本发明的花生液体根瘤菌剂抽样检测的结果为活菌数达110亿/毫升，杂菌数为0。目前我国的农业微生物菌剂（包括根瘤菌剂）的国家标准为2亿/克活菌数，本发明相比提高了50倍。国外液体花生根瘤菌剂最好产品的实测活菌数为50亿左右，保质期为12个月，保证最低活菌数不低于20亿/毫升。而本发明制得的花生液体根瘤菌剂的活菌数高于国外最好产品。因此，本发明制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高、产品保质期延长、并能提高在干燥情况下存活率的优点。另外，步骤二中，在灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，浓度为1~30克/升， 聚乙烯吡咯烷酮PVP90可以显著提高花生根瘤菌在包装袋内的存活率，延长保质期。
（3）本发明提供的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，具有方法简单，生产成本低，并能够适用于工业化大规模生产的特点。
（4）本发明提供的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，是一种新方法，利用可溶性聚合物材料来进一步提高花生根瘤菌在包装袋中的稳定性，特别是提高花生根瘤菌在施用到花生种子上的干燥条件下的存活期。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
花生根瘤菌培养基，是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，海藻糖浓度为2克/升、甘露醇浓度为2克/升、蔗糖浓度为2克/升、柠檬酸浓度为2克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、赖氨酸浓度为0.19克/升、组氨酸浓度为0.15克/升、尿素浓度为2克/升、KH2PO4浓度为0.35克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.12克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.14克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.08克/升、NaCl浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升、生物素浓度为0.0009克/升，水溶液pH为7.0；；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为15克/升。
一种采用上述的花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，它包括以下步骤：
步骤一、按照海藻糖浓度为2克/升、甘露醇浓度为2克/升、蔗糖浓度为2克/升、柠檬酸浓度为2克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、赖氨酸浓度为0.19克/升、组氨酸浓度为0.15克/升、尿素浓度为2克/升、KH2PO4浓度为0.35克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.12克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.14克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.08克/升、NaCl浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升、生物素浓度为0.0009克/升的配方量称取上述物质，并将所称取的上述物质依次加入到水中混合均匀，然后调节pH至7.0，制得花生根瘤菌培养基；
步骤二、往发酵罐中添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，然后将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，于121℃下高压灭菌20min，待花生根瘤菌培养基的温度降至30℃时，将花生根瘤菌按体积百分含量为8%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为30℃、搅拌速度为95r/min、空气流量为0.5v/v/m、罐压为0.11kPa、溶氧为70%、发酵液pH为7.1的条件下，发酵100h，即得花生液体根瘤菌剂。
本实施例中，花生根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70%。
本实施例中，花生根瘤菌为慢生型花生根瘤菌。
本实施例的花生根瘤菌培养基，由于采用海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、赖氨酸、组氨酸和尿素组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，使得能够精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，因此，该花生根瘤菌培养基的碳源丰富，并且该花生根瘤菌培养基能够在室温下稳定存活。另外，本实施例的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高的优点。发酵完成后，灌装前加入PVP90，进一步提高花生根瘤菌产品的稳定性。
实施例2。
花生根瘤菌培养基，是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，海藻糖浓度为1克/升、甘露醇浓度为1克/升、蔗糖浓度为1克/升、柠檬酸浓度为1克/升、酵母粉浓度为2.5克/升、赖氨酸浓度为0.13克/升、组氨酸浓度为0.1克/升、尿素浓度为1克/升、KH2PO4浓度为0.2克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.1克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.1克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.05克/升、NaCl浓度为0.05克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.01克/升、生物素浓度为0.0005克/升，水溶液pH为6.8；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为1克/升。
一种采用上述的花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，它包括以下步骤：
步骤一、按照海藻糖浓度为1克/升、甘露醇浓度为1克/升、蔗糖浓度为1克/升、柠檬酸浓度为1克/升、酵母粉浓度为2.5克/升、赖氨酸浓度为0.13克/升、组氨酸浓度为0.1克/升、尿素浓度为1克/升、KH2PO4浓度为0.2克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.1克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.1克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.05克/升、NaCl浓度为0.05克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.01克/升、生物素浓度为0.0005克/升的配方量称取上述物质，并将所称取的上述物质依次加入到水中混合均匀，然后调节pH至6.8，制得花生根瘤菌培养基；
步骤二、往发酵罐中添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，然后将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，于118℃下高压灭菌25min，待花生根瘤菌培养基的温度降至25℃时，将花生根瘤菌按体积百分含量为5%%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为25℃、搅拌速度为50 r/min、空气流量为0.3v/v/ m、罐压为0.05kPa、溶氧为60%%、发酵液pH为6.5的条件下，发酵72h，即得花生液体根瘤菌剂。
本实施例中，花生根瘤菌培养基占发酵罐总体积的65%。
本实施例中，花生根瘤菌为慢生型花生根瘤菌。
本实施例的花生根瘤菌培养基，由于采用海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、赖氨酸、组氨酸和尿素组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，使得能够精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，因此，该花生根瘤菌培养基的碳源丰富，并且该花生根瘤菌培养基能够在室温下稳定存活。另外，本实施例的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高的优点。发酵完成后，灌装前加入PVP90，进一步提高花生根瘤菌产品的稳定性。
实施例3。
花生根瘤菌培养基，是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，海藻糖浓度为3克/升、甘露醇浓度为3克/升、蔗糖浓度为3克/升、柠檬酸浓度为3克/升、酵母粉浓度为4.5克/升、赖氨酸浓度为0.25克/升、组氨酸浓度为0.2克/升、尿素浓度为3克/升、KH2PO4浓度为0.5克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.3克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.2克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.11克/升、NaCl浓度为0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.03克/升、生物素浓度为0.002克/升，所述的水溶液pH为7.5；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为30克/升。
一种采用上述的花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，它包括以下步骤：
步骤一、按照海藻糖浓度为3克/升、甘露醇浓度为3克/升、蔗糖浓度为3克/升、柠檬酸浓度为3克/升、酵母粉浓度为4.5克/升、赖氨酸浓度为0.25克/升、组氨酸浓度为0.2克/升、尿素浓度为3克/升、KH2PO4浓度为0.5克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.3克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.2克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.11克/升、NaCl浓度为0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.03克/升、生物素浓度为0.002克/升的配方量称取上述物质，并将所称取的上述物质依次加入到水中混合均匀，然后调节pH至7.5，制得花生根瘤菌培养基；
步骤二、往发酵罐中添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，然后将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，于125℃下高压灭菌15，待花生根瘤菌培养基的温度降至35℃时，将花生根瘤菌按体积百分含量为10%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为35℃、搅拌速度为150 r/min、空气流量为0.6v/v/ m、罐压为0.2kPa、溶氧为80%、发酵液pH为7.5的条件下，发酵144h，即得花生液体根瘤菌剂。
本实施例中，花生根瘤菌培养基占发酵罐总体积的75%。
本实施例中，花生根瘤菌为慢生型花生根瘤菌。
本实施例的花生根瘤菌培养基，由于采用海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、赖氨酸、组氨酸和尿素组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，使得能够精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，因此，该花生根瘤菌培养基的碳源丰富，并且该花生根瘤菌培养基能够在室温下稳定存活。另外，本实施例的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高的优点。发酵完成后，灌装前加入PVP90，进一步提高花生根瘤菌产品的稳定性。
实施例4。
花生根瘤菌培养基，是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，海藻糖浓度为1.5克/升、甘露醇浓度为1.5克/升、蔗糖浓度为1.5克/升、柠檬酸浓度为1.5克/升、酵母粉浓度为3克/升、赖氨酸浓度为0.18克/升、组氨酸浓度为0.15克/升、尿素浓度为1.5克/升、KH2PO4浓度为0.3克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.15克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.15克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.07克/升、NaCl浓度为0.08克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.015克/升、生物素浓度为0.001克/升，所述的水溶液pH为6.9。
一种采用上述的花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，它包括以下步骤：
步骤一、按照海藻糖浓度为1.5克/升、甘露醇浓度为1.5克/升、蔗糖浓度为1.5克/升、柠檬酸浓度为1.5克/升、酵母粉浓度为3克/升、赖氨酸浓度为0.18克/升、组氨酸浓度为0.15克/升、尿素浓度为1.5克/升、KH2PO4浓度为0.3克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.15克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.15克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.07克/升、NaCl浓度为0.08克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.015克/升、生物素浓度为0.001克/升的配方量称取上述物质，并将所称取的上述物质依次加入到水中混合均匀，然后调节pH至6.9，制得花生根瘤菌培养基；
步骤二、往发酵罐中添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，然后将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，于120℃下高压灭菌22min，待花生根瘤菌培养基的温度降至28℃时，将花生根瘤菌按体积百分含量为6%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为28℃、搅拌速度为80 r/min、空气流量为0.4v/v/ m、罐压为0.15kPa、溶氧为65%、发酵液pH为6.9的条件下，发酵90h，即得花生液体根瘤菌剂。
本实施例中，花生根瘤菌培养基占发酵罐总体积的68%。
本实施例中，花生根瘤菌为慢生型花生根瘤菌。
本实施例的花生根瘤菌培养基，由于采用海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、赖氨酸、组氨酸和尿素组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，使得能够精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，因此，该花生根瘤菌培养基的碳源丰富，并且该花生根瘤菌培养基能够在室温下稳定存活。另外，本实施例的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高的优点。发酵完成后，灌装前加入PVP90，进一步提高花生根瘤菌产品的稳定性。
实施例5。
花生根瘤菌培养基，是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，海藻糖浓度为2.5克/升、甘露醇浓度为2.5克/升、蔗糖浓度为2.5克/升、柠檬酸浓度为2.5克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、赖氨酸浓度为0.22克/升、组氨酸浓度为0.18克/升、尿素浓度为2.5克/升、KH2PO4浓度为0.4克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.25克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.17克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.09克/升、NaCl浓度为0.13克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升、生物素浓度为0.001克/升，水溶液pH为7.2。
一种采用上述的花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，它包括以下步骤：
步骤一、按照海藻糖浓度为2.5克/升、甘露醇浓度为2.5克/升、蔗糖浓度为2.5克/升、柠檬酸浓度为2.5克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、赖氨酸浓度为0.22克/升、组氨酸浓度为0.18克/升、尿素浓度为2.5克/升、KH2PO4浓度为0.4克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.25克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.17克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.09克/升、NaCl浓度为0.13克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升、生物素浓度为0.001克/升的配方量称取上述物质，并将所称取的上述物质依次加入到水中混合均匀，然后调节pH至7.2，制得花生根瘤菌培养基；
步骤二、往发酵罐中添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，然后将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，于123℃下高压灭菌18min，待花生根瘤菌培养基的温度降至32℃时，将花生根瘤菌按体积百分含量为9%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为33℃、搅拌速度为130 r/min、空气流量为0.5v/v/ m、罐压为0.1kPa、溶氧为75%、发酵液pH为7.2的条件下，发酵130h，即得花生液体根瘤菌剂。
本实施例中，花生根瘤菌培养基占发酵罐总体积的72%。
本实施例中，花生根瘤菌为慢生型花生根瘤菌。
本实施例的花生根瘤菌培养基，由于采用海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、赖氨酸、组氨酸和尿素组成混合碳源，来替代常规使用的单一碳源，使得能够精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，因此，该花生根瘤菌培养基的碳源丰富，并且该花生根瘤菌培养基能够在室温下稳定存活。另外，本实施例的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法制得的花生液体根瘤菌剂具有营养平衡、菌体活性高的优点。发酵完成后，灌装前加入PVP90，进一步提高花生根瘤菌产品的稳定性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.花生根瘤菌培养基，其特征在于：是海藻糖、甘露醇、蔗糖、柠檬酸、酵母粉、赖氨酸、组氨酸、尿素、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•2H2O、FeSO4•7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液；其中，海藻糖浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、蔗糖浓度为1~3克/升、柠檬酸浓度为1~3克/升、酵母粉浓度为2.5~4.5克/升、赖氨酸浓度为0.13~0.25克/升、组氨酸浓度为0.1~0.2克/升、尿素浓度为1~3克/升、KH2PO4浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.05~0.11克/升、NaCl浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.01~0.03克/升、生物素浓度为0.0005~0.002克/升，所述的水溶液pH为6.8~7.5；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为1~30克/升。
2.根据权利要求1所述的花生根瘤菌培养基，其特征在于：海藻糖浓度为1.5~2.5克/升、甘露醇浓度为1.5~2.5克/升、蔗糖浓度为1.5~2.5克/升、柠檬酸浓度为1.5~2.5克/升、酵母粉浓度为3.0~4.0克/升、赖氨酸浓度为0.17~0.21克/升、组氨酸浓度为0.13~0.17克/升、尿素浓度为1.5~2.5克/升、KH2PO4浓度为0.3~0.4克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.15~0.25克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.12~0.16克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.07~0.09克/升、NaCl浓度为0.08~0.12克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.015~0.025克/升、生物素浓度为0.0007~0.0011克/升；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为5~25克/升。
3.根据权利要求1所述的花生根瘤菌培养基，其特征在于：海藻糖浓度为2克/升、甘露醇浓度为2克/升、蔗糖浓度为2克/升、柠檬酸浓度为2克/升、酵母粉浓度为3.5克/升、赖氨酸浓度为0.19克/升、组氨酸浓度为0.15克/升、尿素浓度为2克/升、KH2PO4浓度为0.35克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.12克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.14克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.08克/升、NaCl浓度为0.1克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.02克/升、生物素浓度为0.0009克/升；并在上述组份灌装前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP90的浓度为15克/升。
4.一种采用权利要求1至3任意一项所述的花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、按照海藻糖浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、蔗糖浓度为1~3克/升、柠檬酸浓度为1~3克/升、酵母粉浓度为2.5~4.5克/升、赖氨酸浓度为0.13~0.25克/升、组氨酸浓度为0.1~0.2克/升、尿素浓度为1~3克/升、KH2PO4浓度为0.2~0.5克/升、MgSO4•7H2O浓度为0.1~0.3克/升、CaCl2•2H2O浓度为0.1~0.2克/升、FeSO4•7H2O浓度为0.05~0.11克/升、NaCl浓度为0.05~0.15克/升、Na2MoO4·2H2O浓度为0.01~0.03克/升和生物素浓度为0.0005~0.002克/升的配方量称取上述物质，并将所称取的上述物质依次加入到水中混合均匀，然后调节pH至6.8~7.5，制得花生根瘤菌培养基；
步骤二、往发酵罐中添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，然后将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，于一定温度下高压灭菌一定时间，待花生根瘤菌培养基的温度降至一定温度时，将花生根瘤菌按体积百分含量为5%~10%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为25~35℃、搅拌速度为50~150 r/min、空气流量为0.3~0.6v/v/ m、罐压为0.05~0.2kPa、溶氧为60%~80%、发酵液pH为6.5~7.5的条件下，发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂。
5.根据权利要求4所述的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述高压灭菌的温度为118~125℃，所述高压灭菌的时间为15~25min。
6.根据权利要求4所述的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：所述步骤二中，待花生根瘤菌培养基的温度降至25~35℃时，将花生根瘤菌培养基按体积百分含量为5%~10%的接种量接种至灭菌的花生根瘤菌培养基中。
7.根据权利要求4所述的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述花生根瘤菌培养基占所述发酵罐总体积的65%~75%。
8.根据权利要求4所述的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：所述步骤二中，在温度为29~31℃、搅拌速度为70~120 r/min、空气流量为0.4~0.6v/v/ m、罐压为0.08~0.18kPa、溶氧为65~75%、发酵液pH为6.8~7.2的条件下，发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂。
9.根据权利要求4所述的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：所述步骤二中，在温度为30℃、搅拌速度为95r/min、空气流量为0.5v/v/m、罐压为0.11kPa、溶氧为70%、发酵液pH为7.1的条件下，发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂；
所述步骤二中，在将步骤一得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐前添加聚乙烯吡咯烷酮PVP90，浓度为1~30克/升，聚乙烯吡咯烷酮PVP90在加入根瘤菌液之前需要灭菌，将聚乙烯吡咯烷酮PVP90按150克/升溶解在纯净水中，在另外一个发酵罐中灭菌，121°C灭菌20分钟，冷却到30°C以下，按根瘤菌菌液11%的量加入PVP90，使根瘤菌液的PVP90的最终含量达到15克/升。
10.根据权利要求4所述的一种采用花生根瘤菌培养基制备花生液体根瘤菌剂的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述花生根瘤菌为慢生型花生根瘤菌。
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