CN101818119A - 大豆根瘤菌营养膜保护剂及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种大豆根瘤菌营养膜剂保护剂及其生产方法。选取的原材料为：聚乙烯吡咯烷酮PVP K30、聚乙烯吡咯烷酮PVP S630、甲基纤维素钠、蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠，并在一定的反应条件下反应而成；大豆根瘤菌营养膜保护剂与液体大豆根瘤菌剂和大豆种子按比例混拌，大豆种子包衣存放两天后，每粒大豆种子上能够保证有10万个活的大豆根瘤菌数。本发明需要的原材料来源广泛，且生产工艺简单，成本低。本发明对大豆根瘤菌能够起到营养、成膜和保护作用，使液体大豆根瘤菌剂在常温下可以保藏壹年，活菌数不低于20亿/ml，固氮活性不降低。
Description
技术领域：
本发明涉及农业微生物和生物化工技术领域，具体为一种大豆根瘤菌营养膜保护剂及其生产方法。
背景技术：
我国的大豆根瘤菌研究可以追溯到上世纪30年代，我国著名土壤微生物学专家张宪武教授1937年发表第一篇大豆根瘤菌研究与应用文章，至今已有80多年历史。中华人民共和国成立后，1950年张宪武、许光辉、丁健等人从我国东北黑龙江、吉林和辽宁等地，共采集样品849个，分离大豆根瘤菌种500多个，并进行人工接种，选择优良菌种，1953年在东北150万公顷的大豆栽培上推广大豆根瘤菌接种剂技术，平均增产大豆12.6％以上。
1954年王书锦教授在福建省进行了大豆根瘤菌研究与应用，在4万公顷秋大豆栽培上获得平均增产10.6％以上的良好效果。1955年板野新夫、吴尧夫等人在吉林公主岭也进行了大豆根瘤菌研究与应用。
1962年和1976年，丁健和邓伟民等人到古巴和阿尔巴尼亚，建立微生物试验室，并应用大豆根瘤菌做协助试验，结果表明可使大豆增产10.8％以上，最高可以达到52.0％。
1982年以来，大豆根瘤菌基础研究与应用研究异常活跃。王书锦、薛德林、张红英、王伟等人在黑龙江分离得到多株快生型大豆根瘤菌，在辽宁、吉林和黑龙江进行了大面积应用，取得平均增产15.6％以上的良好效果。与此同时，北京农大陈文新教授也在黑龙江、新疆分离得到多株快生型大豆根瘤菌，并已成功进行了大面积应用。
大豆根瘤菌的应用，按照大豆根瘤菌剂型，可以分成3个阶段，第一阶段是50年代到80年代，大豆根瘤菌为草炭吸附型，保质期为半年，活菌数衰减很快，应用繁琐、麻烦。第二阶段是82年以后，出现了液态大豆根瘤菌剂，应用方便，但保质期太短，很容易腐败，不能大面积应用，不能实现商品化生产和应用。第三阶段是2000年开始，随着科学技术的发展，生物化工领域中的膜技术、包埋技术渗透到微生物肥料、大豆根瘤菌的应用领域，在应用中起到了关键性作用。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种大豆根瘤菌营养膜保护剂的生产方法。本发明生产的大豆根瘤菌营养膜保护剂，所需要的原材料来源广泛，生产工艺简单，成本低，产品在田间应用效果好。本发明的大豆根瘤菌营养膜保护剂使液体大豆根瘤菌剂在常温下可以保藏壹年，活菌数不低于20亿/ml，固氮活性不降低。
本发明的目的是这样实现的：首先将甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮PVPK30和聚乙烯吡咯烷酮PVP S630分别用纯净水缓慢搅拌溶解，再将三者混合在一起，再加入蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠，在一定的反应条件下使之慢慢溶解并反应；所述的按重量份数为每100份大豆根瘤菌营养膜保护剂的中所包含：聚乙烯吡咯烷酮PVPK30为1-10份、聚乙烯吡咯烷酮PVPS630为1-10份、甲基纤维素钠为0.2-2份、蛋白胨为520份、牛血清白蛋白为0.01-0.2份，钼酸钠为0.1-0.5份，其余为纯净水；所述的反应条件为：溶液PH为6.8～7.2，通气比为1∶0.6～0.8，温度为25～30℃和时间为50～60小时，反应容器为发酵罐。
最佳反应条件为：溶液PH值6.8、通气比为1∶0.6、温度为30℃，时间为60小时。
所述大豆根瘤菌营养膜保护剂与液体大豆根瘤菌剂与大豆种子按照毫升数∶毫升数∶克数＝1∶4∶1500的比例混拌，大豆种子包衣存放两天后，每粒大豆种子上能够保证有10万个活的大豆根瘤菌数，固氮活性不降低，所述的大豆根瘤菌剂为哈尔滨工业大学华龙科技发展有限公司生产。
本发明对大豆根瘤菌能够起到营养、成膜和保护作用。本发明需要的原材料来源广泛，且生产工艺简单，成本低。生产的大豆根瘤菌剂产品，田间应用效果好，对生态环境友好，属绿色创新型微生物生物制剂的换代产品，易于推广应用。
本发明具有如下优点：
1.操作简单，成本低，易于推广。本发明吸取有关微生物生物制剂的生产方法和微生物生物制剂应用膜技术、包埋技术的优点，以甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮PVP K30、聚乙烯吡咯烷酮PVP S630为成膜材料，再加入蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠等大豆根瘤菌菌体营养和促进生物固氮的必要营养元素，在一定的条件下化学方应，生产出高质量的大豆根瘤菌营养膜保护剂，并生产出具有大豆根瘤菌数含量高，固氮活性高，保质期长的大豆根瘤菌剂产品。
2.产品营养全，存活期长，质量高。本发明微生物生物制剂保护剂生产中，充分考虑到生长所需要的营养因子和生物固氮所需特定因子，在基质中适量的加入蛋白胨、牛血清白蛋白％和钼酸钠等营养元素，保证了大豆根瘤菌的存活和生长条件。大豆根瘤菌为革兰氏阴性细菌，不产生芽胞，在干燥条件下存活能力很弱。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是人工合成的多聚化合物。可以在大豆根瘤菌细胞周围形成一层保护膜，保护细胞不易失去生理水分，可以减少氧化过程对细胞的损伤，除PVP之外，还加入了甲基纤维素钠等成膜的元素。由于营养元素和成膜化合物的加入，可以保证拌种后的大豆种子存放两天后，每粒大豆种子上能够保证有10万个活的大豆根瘤菌数，固氮活性不降低。液体大豆根瘤菌剂在常温下可以保藏壹年，活菌数不低于20亿/ml，固氮活性不降低，
3.应用方法简便，产品应用效果好。本发明采用已知的慢生型大豆根瘤菌和快生型大豆根瘤菌等高结瘤率和高固氮率的微生物菌种，采用全自动微生物发酵罐两级液态发酵生产，产品保证值为活菌数100亿/ml，无杂菌。与本发明生产的大豆根瘤菌营养膜保护剂结合使用，起到了非常好的应用效果。能够使作物结瘤率提高，促进作物生长，增强作物抗逆性、提高作物产量、改善作物品质；同时，又能培肥地力，保护生态环境，是一种符合人类健康要求的无公害绿色微生物有机肥料；经大量田间试验结果表明，可使大豆增产13.1％～19.8％。
具体实施方式：
实施例1：
首先将甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮PVPK30和聚乙烯吡咯烷酮PVP S630分别用纯净水缓慢搅拌溶解，再将三者混合在一起，再加入蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠，在一定的反应条件下使之慢慢溶解并反应；所述的按重量份数为每100份大豆根瘤菌营养膜保护剂的中所包含：聚乙烯吡咯烷酮PVPK30为1份、聚乙烯吡咯烷酮PVPS630为1份、甲基纤维素钠为0.2份、蛋白胨为5份、牛血清白蛋白为0.01份，钼酸钠为0.1份，其余为纯净水；所述的反应条件为：溶液PH为6.8，通气比为1∶0.6，温度为25℃和时间为50小时，反应容器为发酵罐。该液体颜色为红色，无毒，具有清香味。
实施例2
首先将甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮PVPK30和聚乙烯吡咯烷酮PVP S630分别用纯净水缓慢搅拌溶解，再将三者混合在一起，再加入蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠，在一定的反应条件下使之慢慢溶解并反应；所述的按重量份数为每100份大豆根瘤菌营养膜保护剂的中所包含：聚乙烯吡咯烷酮PVPK30为5份、聚乙烯吡咯烷酮PVPS630为5份、甲基纤维素钠为l份、蛋白胨为10份、牛血清白蛋白为0.1份，钼酸钠为0.3份，其余为纯净水；所述的反应条件为：溶液PH为7.0，通气比为1∶0.7，温度为27℃和时间为55小时，反应容器为发酵罐。该液体颜色为红色，无毒，具有清香味。
实施例3
首先将甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮PVPK30和聚乙烯吡咯烷酮PVP S630分别用纯净水缓慢搅拌溶解，再将三者混合在一起，再加入蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠，在一定的反应条件下使之慢慢溶解并反应；所述的按重量份数为每100份大豆根瘤菌营养膜保护剂的中所包含：聚乙烯吡咯烷酮PVPK30为10份、聚乙烯吡咯烷酮PVPS630为10份、甲基纤维素钠为2份、蛋白胨为20份、牛血清白蛋白为0.2份，钼酸钠为0.5份，其余为纯净水；所述的反应条件为：溶液PH为7.2，通气比为1∶0.8，温度为30℃和时间为60小时，反应容器为发酵罐。该液体颜色为红色，无毒，具有清香味。
实施例4
首先将甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮PVPK30和聚乙烯吡咯烷酮PVP S630分别用纯净水缓慢搅拌溶解，再将三者混合在一起，再加入蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠，在一定的反应条件下使之慢慢溶解并反应；所述的按重量份数为每100份大豆根瘤菌营养膜保护剂的中所包含：聚乙烯吡咯烷酮PVPK30为8份、聚乙烯吡咯烷酮PVPS630为8份、甲基纤维素钠为1.5份、蛋白胨为15份、牛血清白蛋白为0.15份，钼酸钠为0.3份，其余为纯净水；所述的反应条件为：溶液PH为6.8，通气比为1∶0.6，温度为30℃和时间为60小时，反应容器为发酵罐。该液体颜色为红色，无毒，具有清香味。
实施例5
液体大豆根瘤菌在种子表面的存活时间试验
实验设计：
试验处理1：液体大豆根瘤菌剂；
试验处理2：液体大豆根瘤菌剂+大豆根瘤菌营养膜保护剂；
取4毫升液体大豆根瘤菌剂与1500克大豆种子混合拌匀，另取4毫升液体大豆根瘤菌剂+1毫升大豆根瘤菌营养膜保护剂与1500克大豆种子混合拌匀，接种后的种子放在塑料袋内，塑料袋口自然敞开，让水份蒸发；将种子置于15℃恒温箱中闭光保存，定期取样，检测种子上的活菌数。方法是数100粒种子放到100毫升生理盐水中(100毫升生理盐水盛于一个200毫升的塑料瓶中)振动15分钟，将根瘤菌从种子上洗脱下来，然后按10倍稀释法来稀释菌液，从不同的稀释菌液中分别取0.1毫升涂布在YEM平板(甘露醇10克/升，K2Hpo40.55克/升，硫酸镁0.1克/升，氯化钠0.1克/升，酵母粉0.4克/升，氧化钙0.1克/升，水1000毫升，琼脂18克/升，PH7.0)。液体大豆根瘤菌在种子表面的存活时间试验结果请见表1：
表1液体大豆根瘤菌在种子表面的存活时间试验表
从表1可以看出：未加保护剂的大豆种子，大豆根瘤菌可以保存一天，从第二天开始衰减的很快，到第七天衰减成5000多个；而加保护剂的大豆种子，基本不衰减，到第七天才衰减成1.13×105个。所述的大豆根瘤菌剂为哈尔滨工业大学华龙科技发展有限公司生产。
实施例6
大豆根瘤菌营养膜保护剂田间结瘤和增产效果试验
液体大豆根瘤菌剂+大豆根瘤菌营养膜保护剂田间结瘤和增产效果请见下表2：
表2液体大豆根瘤菌剂+大豆根瘤菌营养膜保护剂田间结瘤和增产效果
| 不同时期 | 液体大豆根瘤菌剂 | 液体大豆根瘤菌剂+大豆根瘤菌营养膜保护剂 | 增加率(％) |
| 播种后两个月根瘤数 | 24.1根瘤/株 | 30.3根瘤/株 | 25.7 |
| 收获时大豆的产量 | 191千克/亩 | 216千克/亩 | 13.1 |
从表2可以看出：未加保护剂的大豆，大豆根瘤菌的结瘤是24.1根瘤/株，收获时大豆的产量是191千克/亩；加保护剂的大豆，大豆根瘤菌的结瘤是30.3根瘤/株，收获时大豆的产量是216千克/亩。结瘤增加率是25.7％，产量增加率是13.1％。
例8、大豆根瘤菌制剂三种剂型对大豆产量的影响
施用草炭吸附大豆根瘤菌制剂、大豆根瘤菌液、液体大豆根瘤菌制剂保护剂产品对大豆产量的影响(黑龙江省友谊农场)三种剂型的大豆根瘤菌制剂对大豆增产效果试验见表3：
表3.草炭吸附大豆根瘤菌制剂、大豆根瘤菌液、液体大豆根瘤菌制剂保护剂产品对大豆产量的影响
*三次重复平均数；
从表3可以看出：以不使用根瘤菌的为对照，试验的结果顺序为液体大豆根瘤菌制剂保护剂产品＞草炭吸附的大豆根瘤菌制剂≌大豆根瘤菌液；增产率的顺序为大豆根瘤菌制剂保护剂产品增产119.1％＞草炭吸附的大豆根瘤菌制剂增产率112.6％≌大豆根瘤菌液增产率112.8％。
实施例4
保护剂快生型大豆根瘤菌和草炭型快生型大豆根瘤菌田间增产试验保护剂快生型大豆根瘤菌和草炭型快生型大豆根瘤菌田间增产试验，结果请见表4、
表4保护剂快生型大豆根瘤菌和草炭型快生型大豆根瘤菌田间增产试验
| 项目 | 株高(cm) | 株荚(个/株) | 百粒重(g) | 株粒数(个/株) | 生物量(g干重/株) | 固氮活性(nmolC2H4/g.鲜重.h) | 种子产量(kg/亩) | 增产率(％) |
| 不接种 | 47.2 | 23.8 | 10.3 | 51.0 | 26.5 | 0.63 | 9.2 | 100.0 |
| 保护剂菌 | 53.0 | 67.2 | 18.3 | 107.8 | 61.3 | 0.902 | 20.4 | 112.1 |
| 草炭菌 | 56.0 | 74.6 | 13.7 | 113.8 | 53.0 | 1.102 | 18.7 | 110.3 |
*对照为常规施肥
从表4可以看出：以不使用根瘤菌的为对照，试验的结果顺序为保护剂快生型大豆根瘤菌产品＞草炭型快生型大豆根瘤菌；增产率的顺序为保护剂快生型大豆根瘤菌产品增产率12.1％＞草炭型快生型大豆根瘤菌增产率10.3％。
实施例7
保护剂慢生型大豆根瘤菌和草炭型慢生型大豆根瘤菌田间增产试验
保护剂慢生型大豆根瘤菌和草炭型慢生型大豆根瘤菌田间增产试验结果请见表5：
表5保护剂慢生型大豆根瘤菌和草炭型慢生型大豆根瘤菌田间增产试验
| 项目 | 株高(cm) | 主茎节数(个/株) | 株荚数(个/株) | 株粒重(个/株) | 百粒重(g) | 无效荚数(个/株) | 产量(kg/亩) | 增产率(％) |
| 不接种(ck) | 80.6 | 11.7 | 15.3 | 4.5 | 16.6 | 0.8 | 123.4 | 100.0 |
| 草炭菌 | 84.4 | 13.6 | 17.9 | 4.9 | 16.3 | 1.0 | 358.1 | 108.6 |
| 保护剂菌 | 86.3 | 13.8 | 18.8 | 6.2 | 17.7 | 0.9 | 394.7 | 119.7 |
*对照为常规施肥
从表5可以看出：以不使用根瘤菌的为对照，试验的结果顺序为保护剂慢生型大豆根瘤菌产品＞草炭型慢生型大豆根瘤菌；增产率的顺序为保护剂慢生型大豆根瘤菌产品增产率19.7％＞草炭型慢生型大豆根瘤菌增产率8.6％。
从上述试验结果可以看出，大豆根瘤菌剂产品对大豆的农艺性状和产量均具有影响，结果表明：可使大豆增产10.3％-19.7％，通过方差分析，差异极显著。并且使用方法简便，改良土壤效果明显，并能改善作物品质。
本发明已将此产品广泛用于黑龙江、吉林和辽宁等地区，取得了良好的应用效果。
Claims (4)
1.一种大豆根瘤菌营养膜保护剂的生产方法，其特征在于：首先将甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮PVPK30和聚乙烯吡咯烷酮PVP S630分别用纯净水缓慢搅拌溶解，再将三者混合在一起，再加入蛋白胨、牛血清白蛋白和钼酸钠，在一定的反应条件下使之慢慢溶解并反应；所述的按重量份数为每100份大豆根瘤菌营养膜保护剂的中所包含：聚乙烯吡咯烷酮PVPK30为1-10份、聚乙烯吡咯烷酮PVPS630为1-10份、甲基纤维素钠为0.2-2份、蛋白胨为5-20份、牛血清白蛋白为0.01-0.2份，钼酸钠为0.1-0.5份，余量为纯净水；所述的反应条件为：溶液PH为6.8～7.2，通气比为1∶0.6～0.8，温度为25～30℃和时间为50～60小时，反应容器为发酵罐。
2.根据权利要求1所述的一种大豆根瘤菌营养膜保护剂的生产方法，其特征在于反应条件为：溶液PH值6.8，通气比为1∶0.6，温度为30℃和时间为60小时。
3.根据权利要求1所述的一种大豆根瘤菌营养膜保护剂的生产方法所生产的一种大豆根瘤菌营养膜保护剂。
4.据权利要求1所述的一种大豆根瘤菌营养膜保护剂的生产方法所生产的一种大豆根瘤菌营养膜保护剂，其特征在于所述的大豆根瘤菌营养膜保护剂与液体大豆根瘤菌剂和大豆种子使用比例为：按大豆根瘤菌营养膜保护剂∶液体大豆根瘤菌剂∶大豆种子，按照毫升数∶毫升数∶克数＝1∶4∶1500的比例混拌；所述的大豆根瘤菌剂为哈尔滨工业大学华龙科技发展有限公司生产。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100901 |