CN101842334A - 新型生物肥料、获得所述肥料的方法及所述肥料作为植物生长刺激剂的应用 - Google Patents

新型生物肥料、获得所述肥料的方法及所述肥料作为植物生长刺激剂的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101842334A
CN101842334A CN200780101303A CN200780101303A CN101842334A CN 101842334 A CN101842334 A CN 101842334A CN 200780101303 A CN200780101303 A CN 200780101303A CN 200780101303 A CN200780101303 A CN 200780101303A CN 101842334 A CN101842334 A CN 101842334A
Authority
CN
China
Prior art keywords
feritlizer
bio
bacterial strain
indole
fertilizer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200780101303A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101842334B (zh
Inventor
M·J·比利亚韦德费尔南德斯
A·I·费尔南德斯马丁内斯
J·A·卡萨诺瓦罗加
J·马洛洛佩斯-罗曼
J·A·尼古拉斯马丁内斯
I·布兰卡比科
A·加西亚戈梅
P·马丁内斯奥尔蒂斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Probelte SA
Original Assignee
Probelte SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Probelte SA filed Critical Probelte SA
Publication of CN101842334A publication Critical patent/CN101842334A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101842334B publication Critical patent/CN101842334B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Abstract

本发明涉及新的生物肥料、用于获得所述生物肥料的方法以及所述生物肥料作为植物生长刺激剂的应用，所述肥料包含分散泛菌C3菌株的纯培养物、巴西固氮螺菌M3菌株的纯培养物和吲哚-3-乙酸，它们全部固定于单个固体介质中，起缓释体系的作用。所述方法包括以下主要步骤：微生物的培养；细胞、养分和其他物质在所述介质中的固定；以及单个流化床干燥步骤，所述干燥步骤使得可以使用更低的温度并获得更低的水分含量，因此使得所述肥料具有更高的稳定性。一旦与植物接触，所述肥料的作用立即开始。

Description

新型生物肥料、获得所述肥料的方法及所述肥料作为植物生长刺激剂的应用
技术领域
本发明涉及由颗粒状制剂组成的用于生物施肥的产品，其包含固氮螺菌属(Azospirillum)和泛菌属(Pantoea)细菌的两种菌株，具有固定大气中的氮、使土壤的磷酸盐和其它矿物质养分增溶以及产生大量植物生长刺激物质的能力。所述微生物利用吸附技术固定到固体载体，起缓释体系的作用，这进一步确保了细胞活力的高稳定性以及确保有足够的有机养分和盐来促进植物根部的定殖(colonization)。单独的微生物、细胞固定的方法以及由此得到的生物肥料作为植物生长刺激剂的应用也是本发明的目的。
背景技术
使用肥料对于保持农作物高产是必不可少的。重要量的氮、磷和钾、以及其它矿物质元素通过化学施肥的方式被加入到土壤中，然而，这些元素的可用性非常低，因为众所周知其一部分在土壤中被固定而形成不能被植物同化的不溶性化合物，而另一部分通过淋洗过程被洗出(wash out)，这除了导致经济损失外还导致可观的环境污染问题。
就磷而言，特别地，所加入的可溶性磷酸盐的相当大部分由于酸性土壤中的铁和铝以及石灰性土壤中的钙而变得不能溶解(Chabot等人，1993)，逐渐地转变为较难同化的形式。由于各种保留机理，通过施肥而施用的大多数磷不能被农作物利用并且以不能溶解的形式保留在土壤中(Stevenson，1986)。由于此现象以及肥料的循环应用，土壤中磷的浓度显著增加，因此如果能够经济地利用这些储备就可以在许多土壤中生长长期作物(Kucey等人，1989)。
微生物在土壤中养分的循环中的重要性及其在植物营养中的作用是众所周知的。它们积极参与有机物质的分解与矿化，且参与土壤中养分的固定与释放，这对于保持植物生产力是至关重要的。土壤微生物与植物根部之间发生的相互作用满足两者的重要的营养需求。根部直接受在所述根部中生长的微生物群落的组成和密度的影响，这被称为“根圈效应”，“根圈效应”可以被估计但已知它特别依赖于植物及其生理成熟度(Atlas，R.M.和Bartha，R.，1993)。多年以来，用微生物接种植物的实践已为大家熟知(美国专利570,813)。
在此现象中具有相当大的重要性的一组微生物是参与使磷增溶的微生物，所述磷来自于在其它情况下植物难以获得的来源(Kucey等人，1989)。
实际上，已在所有测试土壤中分离出使磷酸盐增溶的微生物，尽管其数量及比例随土壤类型、气候以及其它因素例如土壤的历史演化而变化。许多微生物能够同化土壤中的不溶性磷，以可溶性磷酸盐的形式释放一部分不溶性磷，而可溶性磷酸盐又可以被植物利用，由此有助于植物营养(Chabot等人，1993)。普遍认为土壤中磷酸盐的增溶作用是因为由糖产生了有机酸和螯合含氧酸(Leyval和Barthelin 1989，Deubel和Gransee 1996，Yadav和Dadarwal，1997)。
肠杆菌属(Enterobacter)和泛菌属已被用于农业作为磷酸盐增溶剂以及用于植物病害的防护。在这些属中，分散泛菌(Pantoea dispersa)是已用于这些目的的物种。
在实践中起着非常重要的作用的另一方面是根圈的微生物的应用，其为大气中的氮的固定剂。多年以来，该实践也为人公知(美国专利1,212,196)。许多微生物已用于此种功能，包括诸如根瘤菌属(Rhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)和固氮螺菌属(西班牙专利ES2093559；美国专利5,951,978)的细菌、以及酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)(美国专利6,596,273)和曲霉属(Aspergillus)(美国专利4,670,037)的真菌等。
氮是含量丰富的元素，几乎占地球大气的80％，并且它是非常缺乏的营养部分。这种自相矛盾是很容易解释的：大气中的氮是惰性的且大多数生物体不能利用它，只有当它被“固定”或与某种元素如氢或氧结合时才能被引入生物合成中。细菌每年能够固定1.5x108公吨，其中相当大的一部分通过Haber-Bosch过程(Brill，W.F.，1977；Atlas和Bartha，1993)合成。
20世纪70年代在巴西进行的一些实验确定了由不同微生物固定的N2对植物的重要贡献，固氮螺菌属是主要的微生物之一(
Figure GPA00001115522300021
和Day，1976；Neyra和
Figure GPA00001115522300022
1977等)。
已知不同植物物种对根圈具有不同的效应，还已知从一类植物物种中分离出的菌株对根圈的作用与从其它作物中分离出的菌株完全不同。然而，在使用巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)进行的工作中，Basham和Levanony(1988)总结出所述物种能够通过被吸附到根部来定殖不同物种的植物。
现今，在生物肥料的制备中应用该属是很常见的(美国专利5,366,532和5,951,978以及西班牙专利ES2093559)。
用微生物接种植物的当前趋势的目的是使用混合的培养物(也称聚生体(consortia))，其改善了以下现象：尤其是例如磷被根部吸收的效率、氮的生物固定、由生成植物生长调节物质的生成导致的植物生长刺激、以及含铁细胞的增加，以及对由病原微生物引起的病害的保护。已显示出此实践在生物施肥中是最有效的。
生物刺激剂的物理形式也是所制备产品的实际结果的一个决定性因素，且可以改变，条件是它与农业实践相适应，易于并入常规操作中。微生物必须在产品中保持能够生存，处于潜伏状态或是具有代谢活性。此因素具有两个决定性方面，产品的耐久性以及当被施用至田地中时产品定殖将要被刺激或被保护的作物的根部的能力。在处理不具有形成抵抗结构(resistant structure)的能力的细胞时可能会出现一些问题，因为该培养物随着时间的推移逐渐地丧失生存力，此外它们在土壤中的存活能力非常低。为此，对于产品来说其能够在不利条件下长期保持细胞生存力且尽可能地在被施用至田地中时确保定殖根部的能力是必要的。对于此目的要考虑的最重要的标准之一是获得能持续释放相当大数量的可生存细胞的制剂。为此，相对于游离细胞，细胞固定技术提供了一系列优势，使得它们对于其在实践中的应用方面非常有吸引力，并且对于农业和环境生物技术而言是相当特别的。固定化细胞的应用能够增强微生物的作用而不产生污染问题，产生非常有活性的及新颖的产品。在实践中广泛使用的技术是吸附。有许多载体用于此目的。特别是在农业中，通常使用粘土、蛭石、珍珠岩、海泡石、高岭土、硅藻土、天然沸石等。
沸石是铝硅酸盐(aluminosilicate)，其网络由AlO4 -和SiO4 -四面体形成。此框架具有负电荷，其被在沸石的通道和空穴中占据特定位点的可交换的阳离子补偿。此盐具有两种非常重要的性质：吸附能力和离子交换能力，这对于其作为固定化载体的可能应用是非常有利的。这些产品的性质对于获得用于生物施肥的干燥产品可能是非常有吸引力的，如果包含不能形成抵抗结构的微生物则更是如此。为此，在生产过程期间以及特别是在干燥产品的步骤中细胞死亡非常少或没有细胞死亡将是必要的。实现此目标将使得能够获得非常有效的产品，条件是实现生产过程。
ES 2234417描述了生物肥料及其制备方法，所述生物肥料由颗粒状制剂组成，所述颗粒状制剂包含保藏于西班牙典型培养物保藏中心(SpanishType Culture Collection，CECT)的CECT保藏号5801的分散泛菌物种的C3菌株以及保藏于西班牙典型培养物保藏中心(CECT)的CECT保藏号5802的巴西固氮螺菌物种的M3菌株，两者均固定于固体载体中。
所述生物肥料能够固定大气中的氮，以及使磷酸盐和其它矿物质养分增溶，由此具有良好的施肥活性。此活性是由于以下事实，例如，C3菌株能够产生大量的有机酸(主要是葡糖酸)，其可用于使土壤中的不溶性磷酸盐增溶，而例如M3菌株能够固定氮并产生吲哚-3-乙酸，其是植物生长中涉及的非常重要的因素。
这些菌株被固定于固体载体例如沸石中，以得到以良好的稳定性以及令人满意的细胞生存力为特征的终产品。固体载体额外地提供有盐以促进植物根部的定殖。
然而，当根据ES 2234417的肥料通过土壤与植物接触时，其需要一段时间来发生作用以使得菌株能够启动其活性，它们必须定殖于植物根部并且与所述根部建立关系，所述关系使得它们可以进行转变为有用产品的作用。因此，当所述肥料通过土壤与植物接触时不能立即实现施肥活性，而是在一定时间之后可以观察到施肥活性，这取决于土壤的特性、气候条件和许多其它因素。此方面可在所处理的植物中导致生物施肥作用的延迟以及生长上的一定延迟(至少是在最初)时。事实上，某些气候条件例如雨、冰雹等可能部分地或完全地影响土壤的肥料，因此使其活性失效。
此外，根据ES 2234417，制备生物肥料的方法包括在固体载体中吸附菌株以及养分和盐，由此得到湿产品，其需要被干燥以获得高的细胞稳定性。事实上，终产品中的高水分含量可导致菌株的快速降解以及较低的生存力。
干燥步骤在60-80℃之间的温度下进行，对于保持菌株的生存力而言该温度是相对高的。由此得到的水分含量在3-6％之间。
根据ES 2234417，各菌株以及养分被吸附于不同的固体载体中，由此得到至少两种不同系列的固体载体，将它们以预定量混合，得到生物肥料。因此，根据此方法，由于分别地干燥养分和菌株，因此必须进行至少两种不同的干燥步骤，且细胞从未达到高于80℃的温度。
发明内容
本发明的一个目的是提供生物肥料，其发挥施肥和/或刺激作用来使肥料一通过土壤与植物接触植物就立即生长。
本发明的另一个目的是提供生物肥料，其发挥施肥和/或刺激活性来改善生长。
同样地，本发明的另一个目的是提供保持其活性的生物肥料，即：其在储存条件下长时间(至少两年)保持稳定。
最后，本发明的另一个目的是提供制备生物肥料的方法，与具有若干工业优势的现有技术水平的方法相比，其包括较少的步骤。
发明详述
使用以下肥料获得了将在下面更好地进行解释的这些优势和其它优势：
a.保藏于西班牙典型培养物保藏中心(CECT)的CECT保藏号5801的分散泛菌物种C3菌株的纯培养物，
b.保藏于CECT的CECT保藏号5802的巴西固氮螺菌物种M3菌株的纯培养物，
这两种纯培养物都固定于固体载体中，
c.吲哚-3-乙酸(IAA)。
根据本发明的新型生物肥料包含巴西固氮螺菌细胞M3菌株，其为大气中的氮的固定剂，且其具有较高的产生吲哚-3-乙酸(IAA)类型的植物生长调节物质的能力；以及分散泛菌C3菌株，其在产生有机酸(主要是葡糖酸)而使土壤中的磷酸盐及其它养分增溶方面，以及产生例如含铁细胞和植物生长调节物质的能力方面是高效的。所述微生物已被保藏于西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，且为巴西固氮螺菌M3指定了登记号CECT-5802，为分散泛菌C3指定了登记号CECT-5801。所述生物肥料由由固体载体形成的产品组成，细菌已被固定在其中且其进一步包含确保细菌存活所必需的养分，当植物被接种时，起缓释体系的作用。
通过将在半固体NFb培养基中进行分离与通过其刺激植物生长以及产生吲哚-3-乙酸和其它植物激素的能力来进行选择两者相结合的方法得到微生物巴西固氮螺菌M3CECT 5802。刺激植物生长的能力依据Bashan等人1986，Fernández 1995和Bashan 1998描述的方法，通过实验室和温室生物测定来验证。通过这些生物测定发现在所测定的超过50种固氮细菌分离物中M3菌株是产生最大生长刺激效应的菌株。吲哚-3-乙酸(IAA)的生成通过比色法(Pilet和Chollet 1970)以及HPLC法(Olivella等人2001)来验证，且还检测了细胞分裂素类型的其它植物激素的存在。在含有200mgxL-1色氨酸的番茄培养基中制备IAA的过程中，获得100-180mgxmL-1的浓度以及此氨基酸的高达95％的转化百分比。使用将在含pH 8的1N Tris_HCl缓冲液(为了琼脂的清除率)的琼脂培养基中进行分离(Gyaneshwar等人1999)与通过确定在搅动的液体培养基中所增溶的PO4 3-来进行选择(Nautiyal 1999)相结合的方法得到微生物分散泛菌C3CECT 5801，在两种情况下均使用不溶的Ca3PO4作为唯一的磷源。表征了所产生的有机酸并且验证了其主要产生葡糖酸。还通过其刺激植物生长以及产生生长素的能力来进行所述选择。
根据本发明，所述新型生物肥料除C3菌株和M3菌株外还包含吲哚-3-乙酸(IAA)。
此第三种组分显示了相对于已知生物肥料的重大进步。事实上，从一开始IAA就与两种菌株C3和M3一起存在为所得产品提供了当肥料通过土壤与植物接触时立即产生活性的能力，这是因为IAA能够发挥其作为植物生长刺激剂的作用，而菌株C3和M3能够在将其在土壤中接种之后以及于必要底物转变之后开始产生IAA。由于IAA的存在，使用根据本发明的新型肥料具有快速的优势，所述肥料一通过土壤与植物接触IAA就立即起植物生长刺激剂的作用，由此使得菌株C3和M3可以定殖植物的根部并与植物根部建立关系，这使得它们可以进行其生长刺激作用。
此外且出人意料地，已证实相同的C3菌株产生极大量的吲哚-3-乙酸(IAA)。
例如，在含有200mgxL-1色氨酸的番茄培养基中制备IAA时，获得80-120mgxmL-1的浓度以及此氨基酸的高达60％的转化百分比。
这是非常重要的方面，因为由C3菌株产生吲哚-3-乙酸(IAA)显示了在所得生物肥料的总活性方面的改善。
事实上，在根据本发明的新型肥料产品中，菌株C3和M3都能够产生吲哚-3-乙酸(IAA)，由此使产品具有与以相似量发挥作用的已知生物肥料相比具有实质性改善的作为植物肥料和植物生长刺激剂的活性。
因此，与相同量的现有技术水平的肥料相比较，根据本发明的新型生物肥料能够产生更大量的IAA。因此，前述内容显示了极大的商业和经济优势。
根据本发明，在第一个实施方案中，IAA可以在用于制备菌株的发酵步骤的过程中有利地被制备，或在在菌株被吸附于固体载体中之前的菌株发酵过程末期直接加入。作为替代方案，IAA可以在其被吸附于固体载体中之前加入到养分中。
根据本发明的第二个实施方案，可以通过在用于制备菌株的发酵步骤的过程中将色氨酸添加至培养基来诱导IAA的形成，使得菌株可以自己产生IAA并且得到完全天然的产品。根据此实例，所得培养液(culture broth)包括菌株(C3或M3)以及直接由所述菌株产生的IAA。培养液(包括在发酵过程中产生的IAA)可被直接吸附于固体载体中。
本发明提供了制备生物肥料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养微生物C3和M3。
b)固定于固体基材中。
c)干燥。
根据所述方法，步骤c)包括干燥所述固体基材。此步骤是所述改进的方法的主要步骤。
根据现有技术的水平，分别干燥固体基材中的微生物和养分是众所周知的；干燥温度分别为80℃和200℃。事实上，需要高温来减少固体基材(例如沸石)的含水量。尽管更低的含水量将是理想的，但可接受的含水量必须在4％和8％之间。
事实上，已知当微生物结合至基材时，干燥气流的温度越低，存活力越高，在此情况中所允许的最大干燥温度是80℃，因为更高的干燥气流的温度会导致微生物的死亡。
通过本发明所述的方法出人意料地克服了依据现有技术水平的上述限制和条件。在干燥方面的改进实质上是基于以下事实：在本发明中，干燥在流化床干燥器中进行，这使得可以显著地降低干燥空气的温度，因为这显著地增加了接触面积。
因此，根据本发明的干燥步骤的特征在于其包括在流化床干燥器中进行的吸附有微生物和/或养分以及盐的固体载体的脱水，这使得可以显著地减少在仅35℃温度下操作的产品的残留水分。
附图说明
图1显示在植物中施肥处理的结果，其使用根据本发明的生物肥料得到。
此外，图2、3和4显示在莴苣的平均重量以及土壤和叶中的硝酸盐含量方面，在所进行的不同试验中得到的结果的总结。
具体实施方式
下面以实施例的形式来说明用于获得本发明的目的的方法。
向流化床干燥器装入其操作所必需的物质，并且将其在35℃的最大气体温度下操作。由此，产品将逐渐干燥直至水分达到2-5％之间，优选为2-3％之间，更优选为2-2.5％之间，其是最终产品的水分值。
在单个步骤中固定和吸附养分并在35℃的最大温度下干燥的方法使得产品的稳定性和有效性增加，这保持了其活性，而在高至35℃的温度下储存至少两年也没有显著的损失。已证实其植物生长刺激活性持续超过两年，保持其初始的性质。在其田间应用中，在所进行的测试中，已证实其对于定殖不同作物的根部是高效的且在不同类型的土壤中是高效的，并且已证实其植物生长刺激作用和普遍的植物营养作用。
还通过田间测试的方式证实了此方法使得可以排除化学施肥并在土壤结构方面产生可观的改善。
上述改善与制备生物肥料的方法有关，所述改善相对于现有技术水平的方法具有若干优势。较低的温度和含水量使得肥料更稳定并使得肥料可以保持活性达至少两或三年。
根据本发明的制备生物肥料的新方法为上述技术和工业问题提供了解决方案。此外，根据步骤a)的所述方法在其应用中具备其他优势，这是由于用于制备所述菌株的番茄酱培养基作为碳源，并且用于施肥的动物皮胶原水解产物作为有机氮源，使用所述物质，两种菌株在发酵24-36小时内都达到高细胞计数。另外，在培养基中引入L-色氨酸使得在发酵过程中将产生大量的生长素，其随后将被转至终产品中，在终产品的应用中使其具有额外的根部渗透效应。所述培养基是非常有成本效益的，且更重要的是，在两种情况下均达到约109-1010细胞xmL-1的高细胞计数。在作者分离的其它属的细菌和真菌的菌株的培养中测试此培养基，也得到了类似的结果。
在发酵阶段的生长培养基中存在的L-色氨酸为通过微生物C3和M3制备IAA提供了直接的来源。
此外，根据本方法，步骤b)具有其他优势，其包括细胞、盐和养分在相同的固体基材中固定。
此过程是同时进行的，并且通过用发酵液和养分的溶液喷洒所述固体来进行，按照连续的方案。为了进行此阶段，使用固体混合器，所述固体混合器具有允许在液体被混合及均质时喷洒所述液体的附件。所述混合器装有沸石和磷矿石，且混合过程进行5-10分钟。随后，使混合器保持运转，按顺序加入细胞液(broths of cells)，首先加入M3，然后加入C3。使用以下原料和结束时的比例(proportions upon finishing)来进行养分的吸附过程并且使混合器保持运转以得到均质的湿固体：
盐                浓度          体积x100kg固体
(NH4)2SO4         550-650g/L    3.5-4.0L溶液
K2HPO4            500-600g/L    0.8-1.2L溶液
Zn(NO3)2.4H2O     100-150g/L    0.1-0.2L溶液
MnSO4.H2O         100-150g/L    0.1-0.2L溶液
CuSO4.5H2O        10-40g/L      0.03-0.06L溶液
FeSO4.7H2O        10-40g/L      0.03-0.06L溶液
不停止混合器，以与描述上述每种溶液时的次序相同的次序顺序地喷洒上述每种溶液。充分混合15-30分钟以得到均质的湿固体。
此新的改善的步骤减少了处理时间，并使得可以得到包含本发明组分的固体基材。这个优势是非常重要的，因为可以使固体载体进行单个干燥步骤，由此避免了对具有不同组分的不同固体载体进行至少三个不同的干燥步骤的需要。
用于得到根据本发明的产品的所述方法的主要优势是新的干燥步骤。所述新的干燥步骤可以在现有技术的固体载体中进行，也可以在根据新的方面得到的固体载体中进行，所述新的方面即同时且在方法的单个步骤中在固体基材中固定菌株C3和M3以及养分和任何其它组分的可能性。
因此，根据本发明，所述生物肥料可以根据本文所述的任何方法制备，且所述新方法可以用于制备上述类型的任何产品。
实施例
以下实施例用来阐明原理和方法学，所有生物肥料都通过所述原理和方法学得到。这些实施例用来阐明本发明的原理和方法学，但它们并不限制本发明的范围。
实施例1：巴西固氮螺菌M3菌株和分散泛菌C3菌株的繁殖
取保藏的菌株M3分离物菌落(blister)，将其接种于刚果红培养基板上(Rodríguez Cáceres，1982)并在30℃下温育72小时以便检验其纯度。从此板上制备用于发酵罐的接种物，用接种环取一部分培养物，在3个2000mL的锥形瓶中分别接种750mL不含L-色氨酸的番茄培养基且在搅拌下在30℃下温育14-16小时。这之后，将处于指数生长期的锥形瓶的内含物接种于包含18L不含L-色氨酸的番茄培养基的Braun Biotech
Figure GPA00001115522300101
C 30L发酵罐中。将其培养8-10小时，当其达到高细胞浓度且仍处于指数生长期时，将其接种于包含200L番茄培养基的Braun Biotech
Figure GPA00001115522300102
D 300L发酵罐中。在搅拌速率为200rpm、通气为50Lxmin-1(0.25vvm)且温度为30℃的条件下进行发酵，持续24-36小时。使pH自由变化且在结束时的pH值为6.5。达到9.4x109细胞xmL-1的浓度且IAA的终浓度为120mgxL-1。指数生长期中的比生长速率(μ)为0.28h-1。
如上所述，菌株C3遵循相同的发酵方案。培养物的纯度在MacConkey培养基检验(OXOID 1981)且接种物在轨道式搅拌器(orbital agitator)中温育12小时。在搅拌速率为300rpm、通气为100Lxmin-1(0.5vvm)且温度为30℃的条件下，在
Figure GPA00001115522300111
D发酵罐中进行培养，持续24-36小时。同样使pH自由变化且在结束时的pH值为6.7。达到1.12x1010细胞xmL-1的浓度且IAA的终浓度为50mgxL-1。此菌株在指数生长期的比生长速率为μ＝0.52h-1。
番茄培养基：
组分            g
番茄酱          36.00
K2HPO4          3.30
KH2PO4          2.75
NH4CL           0.84
胶原水解产物    5.00
酵母提取物      0.75
色氨酸          0.2
H2O(qsf)        1L
pH＝7.0
在121℃下灭菌30分钟
实施例2：细胞固定和养分的装载
使用带有喷洒器的犁式混合器(plow mixer)进行此过程并且使用以下原料：
97.5Kg沸石
2.5Kg磷矿石
3.6L M3培养液
3.6L C3培养液
向混合器中装入沸石和磷矿石，混合过程进行5-10分钟。然后，使混合器保持运转，按顺序喷洒细胞的培养液，首先是M3然后是C3。使用以下原料和结束时的比例来进行养分的吸附过程并且使混合器保持运转以获得均质的湿固体：
(NH4)2SO4         590g/L       3.83L溶液
K2HPO4            550g/L       1.05L溶液
Zn(NO3)2.4H2O     122.5g/L     0.15L溶液
MnSO4.H2O         120g/L       0.15L溶液
CuSO4.5H2O        24g/L        0.05L溶液
FeSO4.7H2O        24g/L        0.05L溶液
不停止混合器，以与描述上述每种溶液时的次序相同的次序顺序地喷洒上述每种溶液，在每种养分之间流过少量水以清洁管道。在此阶段总共加入7.2L。将其充分混合15-30分钟以得到均质的湿固体。
含磷矿石的沸石被总共14.4L的液体润湿，所述液体完全被吸附而没有任何剩余液体。
实施例3：干燥
向流化床干燥器加入其操作所必需的物质，且在35℃的最大空气温度下操作。产物将因此被逐渐地干燥直至最终水分达到2-3％之间，所述值是最终产品的水分值。
应定期地检验此产品的细胞生存力，在刚果红培养基中检验巴西固氮螺菌M3(Rodríguez Cáceres，1982)，在MacConkey培养基中检验分散泛菌C3(OXOID 1981)，发现在不大于35℃的温度下储存超过两年后其保持超过90％的活性。很显然，如图1中可见，养分的固定和吸附的组合过程(其容许载体的更高饱和度)以及35℃的干燥温度(其比现有技术的干燥温度低得多，且在产品的储存过程中对细胞的存活力非常有利)使得可以显著增加产品的有效性和使用寿命。
具体而言，此图显示与没有接收任何处理的对照相比，用储存超过两年的所述生物肥料处理的莴苣保持了更高的自然生长标准(natural growthstandard)。图中的灰色条表示植物的绿色部分的鲜重(FWG)，而黑色条表明由在罐中且在基质泥炭上的温室生物测定得到的莴苣的根部的鲜重(FWR)。该条形图显示通过此方法得到的肥料保持更高的稳定性和活性超过两年。可以看出，在两年半后产品仍保持超过90％的其有效性。
实施例4：农业优势的评价
为了显示所述产品比化学肥料的活性更高，研究了若干试验条件。例如，在田间条件下测试了不同的培养物，所得到的结果非常令人满意。具体而言，在田间条件下测试了莴苣作物，以确定土壤、品种和灌溉系统间的可变性(variability)。
在所有这些测试中，化学施肥完全被替代，在作物收获方面以及在叶和土壤中的硝酸盐含量方面均得到极好的结果。在所进行的一个测试中，莴苣的大小分布的结果示于表1中。可以看出，为了作物收获使用所述产物获得了商业上感兴趣的更好的大小分布(更合适的大小)，这是因为与用化学施肥处理的传统培养相比，使用所述肥料获得了更大的C-9和C-10的比例。
表1-
Figure GPA00001115522300131
测试中的商业大小分布。
Figure GPA00001115522300132
图2显示了所述处理在植物生长方面的作用，以用g表示的平均重量来测量。图中灰色条表示根据本发明的生物肥料，而黑色条表明所使用的对照。观察到在特定的试验条件下，用所述肥料处理的莴苣的重量大于用化学肥料处理的莴苣的重量或与之相当。事实上，观察到尽管未使用化学施肥，但所得到的结果与使用培养物所得到的结果相似且甚至更高。
图3和4显示了土壤中(图3)和叶中(图4)的硝酸盐浓度和环境污染物的减少。显而易见，与化学肥料相比，使用生物肥料显著地减少了土壤和叶两者中存在的硝酸盐和/或污染物。
由图3中可进一步推断出通过使用此生物施肥产品，大大降低了由硝酸盐、磷酸盐及其它化学肥料导致的环境污染。由于没有添加任何类型的化学施肥，几乎消除了这些盐从土壤中的洗出效应。此外，叶中(图4)的硝酸盐含量显著减少，使得所述产品更有益健康。

Claims (26)

1.生物肥料及植物生长刺激剂，其包括：
a.保藏于西班牙典型培养物保藏中心(CECT)的CECT保藏号为5801的分散泛菌物种C3菌株的纯培养物，
b.保藏于CECT的CECT保藏号为5802的巴西固氮螺菌物种M3菌株的纯培养物，
c.吲哚-3-乙酸(IAA)或吲哚-3-乙酸的前体(promoter)。
2.如权利要求1所述的生物肥料，其特征在于所述命名为C3的菌株能够在番茄培养基中产生浓度为约80-120mg x L-1的吲哚-3-乙酸。
3.如权利要求1所述的生物肥料，其特征在于所述C3菌株、M3菌株和所述吲哚-3-乙酸固定于固体载体上。
4.如权利要求3所述的生物肥料，其特征在于所述固体载体由天然沸石形成。
5.如权利要求3所述的生物肥料，其特征在于所述固体载体选自由粘土、蛭石、珍珠岩、海泡石、高岭土、硅藻土、天然沸石组成的组中。
6.如权利要求1所述的生物肥料，其特征在于其包括浓度为约50-120mg/kg产品的吲哚-3-乙酸。
7.如权利要求4所述的生物肥料，其特征在于所述天然沸石已装有盐并具有以下组成：总氮(NH4 +)：0.3-0.5％、钾(K2O)：0.10-0.25％、磷(P2O5)：0.50-0.75％、锌(Zn2+)：85-110ppm、铁(Fe2+)：600-800ppm、锰(Mn2+)：250-300ppm以及铜(Cu2+)：10-20ppm。
8.如权利要求1-7所述的生物肥料，其特征在于其起缓释体系的作用来释放细胞、养分和其它物质。
9.如前述权利要求之一所述的生物肥料，其特征在于其水分含量在2-5％之间。
10.如前述权利要求之一所述的生物肥料，其特征在于其水分含量在2-3％之间。
11.如前述权利要求之一所述的生物肥料，其特征在于其水分含量在2-2.5％之间。
12.如前述权利要求之一所述的生物肥料，其特征在于所述吲哚-3-乙酸的前体是L-色氨酸。
13.用于获得如权利要求1-12所述的生物肥料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
通过利用浸入在包含碳源和有机氮源且包含色氨酸的培养基中进行发酵的方法来从C3菌株和M3菌株的培养物获得所述菌株。
14.用于获得如权利要求13所述的生物肥料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
细胞固定和养分的装载，其同时地进行，并且通过按照顺序的方案使用发酵液和养分的溶液喷洒固体，连续地混合以得到均质的湿固体而进行。
15.如权利要求13所述的获得生物肥料的方法，其特征在于所述碳源是浓缩番茄酱，其体积为所述培养物的总体积的3-5％，所述氮源是动物皮胶原水解产物，其体积为所述培养物的总体积的0.2-1％，且其中细胞浓度达到109-1010细胞/mL且吲哚-3-乙酸浓度达到不低于50mg x L-1。
16.如权利要求13所述的获得生物肥料的方法，其特征在于所述吲哚-3-乙酸在发酵步骤期间加入和/或在发酵步骤后加入。
17.制备和生产生物肥料的方法，所述生物肥料包含巴西固氮螺菌M3菌株(CECT-5802)和分散泛菌C3菌株(CECT-5801)的菌株，所述方法包括培养所述菌株、将其固定于固体基材上以及干燥所述基材的步骤，其特征在于所述干燥步骤在低于35℃的温度下在流化床干燥器中进行，使用连续干燥和空气流，得到水分含量在2-5％之间的所述生物肥料。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于所述水分含量在2-3％之间。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于所述水分含量在2-2.5％之间。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于培养所述菌株的所述步骤包括在含有加入到其中的L-色氨酸的生长培养基中发酵所述菌株。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于所述固定步骤通过将菌株和养分吸附在相同的固体基材中来进行。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于所述固体基材是沸石。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于所述固定步骤通过将菌株、盐和养分吸附到不同固体基材来进行。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于所述固体基材是沸石。
25.根据权利要求17得到的生物肥料。
26.根据权利要求20得到的生物肥料。
CN2007801013030A 2007-08-27 2007-08-27 新型生物肥料、获得所述肥料的方法及所述肥料作为植物生长刺激剂的应用 Expired - Fee Related CN101842334B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/ES2007/000497 WO2009027544A1 (es) 2007-08-27 2007-08-27 Nuevo fertilizante biológico, procedimiento de obtención y su uso como estimulador del crecimiento vegetal.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101842334A true CN101842334A (zh) 2010-09-22
CN101842334B CN101842334B (zh) 2013-11-20

Family

ID=40386715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007801013030A Expired - Fee Related CN101842334B (zh) 2007-08-27 2007-08-27 新型生物肥料、获得所述肥料的方法及所述肥料作为植物生长刺激剂的应用

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8242053B2 (zh)
EP (1) EP2194032B1 (zh)
CN (1) CN101842334B (zh)
AU (1) AU2007358190B2 (zh)
BR (1) BRPI0722102A2 (zh)
CY (1) CY1117255T1 (zh)
ES (1) ES2551678T3 (zh)
PL (1) PL2194032T3 (zh)
PT (1) PT2194032E (zh)
WO (1) WO2009027544A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103396967A (zh) * 2013-08-09 2013-11-20 牛赡光 一株分散泛菌及其应用
CN112341266A (zh) * 2020-10-26 2021-02-09 中阿沸石承德环保科技有限公司 一种沸石生物有机肥及其制造方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5614647B2 (ja) * 2009-01-08 2014-10-29 国立大学法人東北大学 イネ科植物の雄性不稔を回復させる方法および雄性不稔回復剤
ES2378040B1 (es) * 2010-03-31 2013-02-18 Probelte, S.A Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas n11, sr11 y alo1, contenidas en el mismo.
CN102021129B (zh) * 2010-10-19 2012-07-18 中国农业大学 一种球状节杆菌cna9及其应用
CN101967461B (zh) * 2010-10-22 2012-06-27 领先生物农业股份有限公司 一种固氮螺菌的发酵方法与由该方法得到的发酵液及其用途
WO2013059214A1 (en) * 2011-10-17 2013-04-25 Auburn University Method of reducing nitrous oxide emissions from a plant growth substrate
CL2013003780A1 (es) 2013-12-30 2014-06-20 Univ Concepcion Biofertilizante y su proceso de elaboración.
WO2016122301A1 (es) * 2015-01-29 2016-08-04 Miranda Valencia José Luis Fertilizante sólido granulado formulado con arcillas minerales, agentes quelantes siderófolos, nutrientes secundarios y micronutrientes
IT201800002826A1 (it) * 2018-02-19 2019-08-19 Bal Co S P A Procedimento per la preparazione di una composizione stimolante per superfici vegetali e terreni
ES2789973B2 (es) * 2019-04-26 2022-02-07 Probelte S A U Biofertilizante liquido que comprende cepas de azospirillum brasilense y pantoea dispersa y metodo de obtencion del mismo
CN114164140B (zh) * 2021-10-28 2023-12-12 中国林业科学研究院华北林业实验中心 一株高效溶磷菌mqr6及其发酵产物与应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US570813A (en) 1896-11-03 Friedrich jstobbe and lorenz hiltner
US1212196A (en) 1916-10-28 1917-01-16 Henry King Hannah Fertilizer composition and process of making same.
US4670037A (en) 1985-08-12 1987-06-02 Kistner Sr Harold E Fertilizer utilizing a chitin-producing fungus and method for its use
FR2611698B1 (fr) 1987-02-27 1990-11-30 Charbonnages Ste Chimique Engrais contenant des micro-organismes et procedes de fabrication de ces engrais
ES2093559B1 (es) 1995-05-04 1997-07-01 Consejo Superior Investigacion Fertilizante bacteriano y procedimiento de obtencion.
US5951978A (en) 1998-12-10 1999-09-14 Tatko Biotech, Inc. Microorganisms for improving plant productivity
US6596273B2 (en) 2001-03-01 2003-07-22 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising swine manure
ES2234417B1 (es) 2003-10-24 2006-10-01 Probelte S.A. Nuevo fertilizante biologico y procedimiento de obtencion.
US20060178269A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-10 Medina-Vega Luis R Plant conditioning treatment for plant growth and health enhancement

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103396967A (zh) * 2013-08-09 2013-11-20 牛赡光 一株分散泛菌及其应用
CN112341266A (zh) * 2020-10-26 2021-02-09 中阿沸石承德环保科技有限公司 一种沸石生物有机肥及其制造方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007358190B2 (en) 2013-09-12
EP2194032B1 (en) 2015-08-19
CY1117255T1 (el) 2017-04-26
EP2194032A1 (en) 2010-06-09
PT2194032E (pt) 2015-11-25
PL2194032T3 (pl) 2016-04-29
US20110045976A1 (en) 2011-02-24
ES2551678T3 (es) 2015-11-23
AU2007358190A1 (en) 2009-03-05
WO2009027544A1 (es) 2009-03-05
US8242053B2 (en) 2012-08-14
BRPI0722102A2 (pt) 2014-04-08
EP2194032A4 (en) 2013-02-27
CN101842334B (zh) 2013-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101842334B (zh) 新型生物肥料、获得所述肥料的方法及所述肥料作为植物生长刺激剂的应用
EP1248754B1 (en) Biological addition to organic-mineral fertilizers
CN107162816A (zh) 一种秸秆半腐熟盐碱地改良肥料
CN104230589A (zh) 一种土壤改良型生物肥料及其制备方法
CN103553828A (zh) 一种长保质期的液态复合生物菌肥及其制备方法与应用
CN101671205B (zh) 一种促进油菜生长的复合微生物制剂及其制备方法
CN105295928A (zh) 一种适用于退化草场的土壤改良剂及制备方法
CN101948780B (zh) 防治连作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有机肥料
CN110437000A (zh) 一种微生物肥料及其制备方法和应用
CN109280628B (zh) 一种肠杆菌菌种及其在促进毛竹生长中的应用
CN107129327A (zh) 微生物肥料及其制备方法
CN104263679A (zh) 一种高效解磷菌及其应用
CN1276361A (zh) 一种长效有机复合肥及其制备方法
CN109400401A (zh) 一种适合多种作物生长的新型高效复合微生物菌肥的制备方法及应用
CN111393206A (zh) 一种含复合菌有机无机全元生物有机肥及其应用
CN110437005A (zh) 一种弱酸性抗盐碱生物液体肥及其制备方法
CN110615722B (zh) 一种生物炭基多元肥及其制备方法
CN1052711C (zh) 一种生物有机复合肥及其制备方法
CN112239380A (zh) 一种提高作物抗逆性的氨基酸生物制剂
CN1196341A (zh) 全价复合肥料系列产品及成套生产技术
CN109438079A (zh) 一种可溶性生物有机肥料及其生产方法
CN106831109A (zh) 一种富硒有机生物复合肥料及其制备方法
CN106554226A (zh) 一种葡萄种植用复合微生物肥料及其生产方法
CN1583676A (zh) 一种亚热带林木种苗微生物有机肥的生产方法
CN108949635A (zh) 胶冻样芽孢杆菌、微生物菌肥、其制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20131120