BRPI0722102A2

BRPI0722102A2 - Novo fertilizante biológico, método para obtenção do mesmo e utilização deste como estimulador do crescimento vegetal

Info

Publication number: BRPI0722102A2
Application number: BRPI0722102-9A2A
Authority: BR
Inventors: Fernandez Mario Jorge Villaverde; Martinez Ana Isabel Fernandez; Roca Juan Antonio Casanova; Jorge Malo Lopez-Roman; Jose Antonio Nicolas Martinez; Pico Isidro Blanca; Gomez Antonio Garcia; Pedro Martinez Ortiz
Original assignee: Probelte S A
Priority date: 2007-08-27
Filing date: 2007-08-27
Publication date: 2014-04-08
Also published as: CY1117255T1; PT2194032E; CN101842334A; EP2194032A4; AU2007358190B2; PL2194032T3; EP2194032A1; EP2194032B1; ES2551678T3; WO2009027544A1; AU2007358190A1; US20110045976A1; CN101842334B; US8242053B2

Description

"NOVO FERTILIZANTE BIOLOGICO, METODO PARA OBTENÇÃO DO MESMO E UTILIZAÇÃO DESTE COMO ESTIMULADOR DO CRESCIMENTO VEGETAL"

Campo da invenção

Refere-se a presente invenção a um produto para a fertilização

biológica composto por uma formulação granulada que está compreendida por duas cepas de bactérias dos gêneros Azospirillum e Pantoea, com capacidade para fixar nitrogênio atmosférico, solubilizar fosfatos além de outros nutrientes minerais do solo e produzir quantidades elevadas de substâncias estimuladoras do crescimento 10 vegetal. Os citados microrganismos foram imobilizados por meio da técnica de adsorção em um suporte sólido, que atua como um sistema de liberação lento que também assegura uma elevada estabilidade na viabilidade celular, além de nutrientes orgânicos e sais em quantidade suficiente para facilitar a colonização das raízes das plantas. Os microrganismos isolados, o método de imobilização celular e 15 o uso do fertilizante biológico obtido desta forma como um estimulador do crescimento vegetal também se constituem em objeto da presente invenção.

Estado da técnica

O uso de fertilizantes é essencial para a manutenção de altos rendimentos em colheitas. Quantidades importantes de nitrogênio, fósforo e 20 potássio, além de outros elementos minerais, são acrescentados ao solo por meio de fertilização química, entretanto, a disponibilidade destes elementos é muito baixa uma vez que é bem conhecido o fato de que uma fração é imobilizada no solo, formando compostos insolúveis que não são assimilados pelas plantas e outra fração é lavada por meio de um processo de lixiviação, que gera um importante 25 problema de contaminação ambiental, além de perdas econômicas.

No caso do fósforo, especialmente uma parte importante dos fosfatos solúveis acrescentados, é insolubilizado pelo ferro e o alumínio em solos ácidos e pelo cálcio em solos calcários (Chabot e outros, 1993), convertendo-se progressivamente em formas menos assimiláveis. Como resultado dos diversos mecanismos de retenção, a maior parte do fósforo aplicado por meio de fertilização não pode ser utilizado pelas colheitas e é retida no solo na forma insolúvel (Stevenson, 1986). Devido a este fenômeno e a aplicação cíclica de fertilizantes, a concentração de fósforo no solo aumentou consideravelmente de modo que colheitas a longo prazo pudessem ser estabelecidas em muitos solos para que estas reservas pudessem ser exploradas economicamente (Kucey e outros, 1989).

A importância de microrganismos no ciclo de nutrientes no solo e o seu papel na nutrição vegetal é bem conhecida. A sua participação ativa na decomposição e mineralização da material orgânica, além de na fixação de liberação de nutrientes do solo é crucial para a manutenção da produtividade das 10 plantas. As interações que se estabelecem entre os microrganismos do solo e as raízes das plantas satisfazem importantes requerimentos nutricionais para ambos. As raízes estão diretamente influenciadas pela composição e densidade da comunidade microbiana que nelas se desenvolve, sendo este efeito conhecido como “efeito rizosfera”, que pode ser avaliado, porém, sabe-se que depende 15 especificamente da planta e da sua maturidade fisiológica (Atlas, R.M. e Bartha, R., 1993). A prática da inoculação de plantas com microrganismos já é bem conhecida há muitos anos (patente norte-americana US570,813).

Um grupo de microrganismos que possui uma importância considerável neste fenômeno é aquele que participa na solubilização do fósforo a partir de fontes que, de outra maneira, estariam inacessíveis para as plantas (Kucey e outros, 1989).

Os microrganismos solubilizadores de fosfato foram isolados em virtualmente todos os solos testados, embora o número e proporção dos mesmos varie de acordo com o tipo de solo, o clima e outros fatores tais como a evolução 25 histórica do solo. Muitos microrganismos são capazes de assimilar o fósforo insolúvel do solo, liberando parte do mesmo na forma de fosfatos solúveis que podem, por sua vez, ser utilizados pelas plantas, contribuindo desta forma para a nutrição vegetal (Chabot e outros, 1993). E, em geral, aceito que a solubilização de fosfatos no solo se deve à produção de ácidos orgânicos e oxo ácidos quelantes, a 30 partir dos açúcares (Leyval e Barthelin 1989, Deubel e Gransee 1996, Yadav e Dadarwal, 1997).

Os gêneros Enterobacter e Pantoea foram utilizados na agricultura como solubilizantes de fosfato e para a proteção contra doenças de plantas. Entre outros gêneros, Pantoea dispersa é uma espécie que foi utilizada para estes propósitos.

Outro aspecto que, na prática, desempenha um papel muito importante é o uso de microrganismos da rizosfera fixadores de nitrogênio atmosférico. Esta prática também é conhecida há muitos anos (patente norte- americana US 1,212,196). Uma série de microrganismos foi utilizada para este 10 função, incluindo bactérias de gêneros como Rhizobium, Azotobacter e Azospirillum (patente espanhola ES2093559; patente norte-americana US5,951,978), e fungos dos gêneros Saccharomyees, Hansenula (patente norte- americana US6,596,273) e Aspergillus (patente norte-americana US4,670,037), entre outros.

O nitrogênio é um elemento abundante, compondo quase que 80% da

atmosfera terrestre e uma parte nutritiva muito escassa. O paradoxo é facilmente solucionado: o nitrogênio atmosférico é inerte e a maior parte dos organismos não consegue utilizá-lo, sendo incorporado somente nas sínteses biológicas depois de ter sido "fixado" ou combinado com determinados elementos tais como o

o

hidrogênio ou o oxigênio. As bactérias são capazes de fixar 1,5 x 10 toneladas métricas por ano, uma parte considerável da qual é sintetizada por meio do processo de Haber-Bosch (Brill, W.F., 1977; Atlas e Bartha, 1993).

Diversos experimentos conduzidos no Brasil nos anos 70 determinaram a contribuição significativa de N2 fixado paras plantas por diferentes microrganismos, o Azospirillum estando entre os principais deles (Dõbereiner e Day, 1976; Neyra e Dõbereiner, 1977, inter alia).

Sabe-se que diferentes espécies de plantas produzem diferentes efeitos sobre a rizosfera, e sabe-se também que as cepas isoladas em um tipo de espécie vegetal possuem um efeito completamente diferente sobre a rizosfera a partir da qual foi isolada em relação a outros cultivos. Contudo, no seu trabalho com Azospirillum brasilense, Basham e Levanony (1988) concluíram que tal espécie é capaz de colonizar plantas de diferentes espécies sendo absorvidas nas raízes.

O uso deste gênero na produção de fertilizantes biológicos é muito comum hoje em dia (patentes norte-americanas US5,366,532 e US5,951,978 e patente espanhola ES2093559).

Tendências atuais na inoculação de plantas com microrganismos se orientam no sentido de utilizar cultivos mistos (também chamados de consórcios) que potencializam fenômenos como o aumento da eficiência da absorção do fósforo 10 pelas raízes, a fixação biológica do nitrogênio, a estimulação do crescimento vegetal pela produção de substâncias reguladoras do crescimento vegetal, além de sideróforos e a proteção contra doenças provocadas por microrganismos patógenos, entre outros. Esta prática foi demonstrada como sendo a mais eficaz na biofertilização.

A forma física de um bioestimulador é também um fator determinante

no resultado do produto preparado e pode variar, contanto que seja compatível com as práticas agrícolas, sendo prontamente incorporado nas operações de rotina. Os microrganismos devem permanecer viáveis no produto, tanto no estado latente como metabolicamente ativos. Este fator possui dois aspectos determinantes, a durabilidade do produto e a capacidade do mesmo para colonizar as raízes dos cultivos que devem ser estimuladas ou protegidas, uma vez aplicado no campo. Podem surgir alguns problemas quando se trata de células que não possuem a capacidade de formar estruturas de resistência uma vez que os cultivos perdem gradualmente a viabilidade com o tempo e, além disso, a sua capacidade de sobrevivência no solo é muito baixa. Por este motivo, é essencial que o produto seja capaz de preservar a viabilidade celular em condições adversas durante longos períodos de tempo e assegurar, na medida do possível, a capacidade de colonização das raízes uma vez aplicado no campo. Um dos critérios mais importantes que devem ser levados em consideração para este propósito é alcançar preparados que liberem consistentemente um número considerável de células viáveis. Para este propósito, as técnicas de imobilização celular oferecem uma série de vantagens em relação às células livres, tomando-as muito atraentes para a sua aplicação na prática e muito especialmente para a biotecnologia agrícola e ambiental. O uso de células imobilizadas pode potencializar os efeitos de microrganismos sem criar problemas 5 de contaminação, produzindo produtos muito ativos e inovadores. Uma técnica amplamente utilizada na prática é a adsorção. Há uma série de suportes utilizados para este propósito. Na agricultura em especial, o uso de argila, vermiculita, perlita, sepiolita, caulim, terra diatomácea, zeolita natural e similares é comum.

As zeolitas são aluminossilicatos, cujas redes estão formadas por

tetraedros de AlO4 e SiO4. Esta estrutura possui uma carga negativa que é compensada com cátions intercambiáveis que ocupam locais específicos nos canais e cavidades da zeolita. Este sal possui duas propriedades muito importantes: a capacidade de adsorção e troca iônica, que são muito vantajosas para o seu possível uso como um suporte de imobilização. As propriedades destes produtos poderiam 15 ser muito atraentes para a obtenção de um produto seco para biofertilização, mais ainda se envolver microrganismos que não são capazes de formar estruturas de resistência. Para este propósito, seria essencial conseguir que a morte celular fosse muito baixa ou nula durante o processo de produção e, especialmente, na etapa de secagem do produto. Alcançar este objetivo permitiria obter produtos muito 20 eficazes contanto que um processo de produção seja alcançado.

A patente ES2234417 descreve um fertilizante biológico composto por uma formulação granular que contém a cepa C3 da espécie Pantoea dispersa depositada na Coleção Espanhola de Cultivos Tipo (CECT) com o número CECT- 5801 e a cepa M3 da espécie Azospirillum brasilense depositada na Coleção 25 Espanhola de Cultivos Tipo (CECT) com o número CECT-5802, ambas imobilizadas em um suporte sólido e um processo para a sua preparação.

O citado fertilizante biológico é capaz de fixar o nitrogênio atmosférico, além de solubilizar os fosfatos e outros nutrientes minerais, apresentando, portanto, uma boa atividade de fertilização. Esta atividade se deve ao fato de que, por exemplo, a cepa C3 ser capaz de produzir grandes quantidades de ácidos orgânicos, principalmente ácido glucônico, que é útil para solubilizar o fosfato insolúvel do solo, enquanto, por exemplo, a cepa M3 é capaz de fixar o nitrogênio e produzir o ácido indol-3-acético, que é um fator muito importante envolvido no crescimento das plantas.

Estas cepas são imobilizadas em um suporte sólido, por exemplo,

zeolita, para obter um produto final caracterizado por uma boa estabilidade além de uma viabilidade celular satisfatória. O suporte sólido é adicionalmente fornecido com sais para facilitar a colonização das raízes das plantas.

Entretanto, quando o fertilizante, de acordo com a patente ES2234417, entra em contato com a planta através do solo, necessita de algum tempo para realizar a sua ação uma vez que, para que as cepas sejam capazes de iniciar a sua atividade, devem colonizar as raízes das plantas e estabelecer com estas uma relação que lhes permita realizar a sua ação de conversão em um produto útil. Consequentemente, a atividade de fertilização não pode ser realizada imediatamente quando o fertilizante entra em contato com a planta através do solo, porém pode ser observada depois de um certo tempo, que depende das características do solo, das condições climáticas e de diversos outros fatores. Este aspecto pode causar um atraso na ação de biofertilização e um certo atraso no crescimento, pelo menos inicialmente, nas plantas tratadas. De fato, determinadas condições climáticas como chuva, granizo, etc., podem afetar parcial ou completamente o fertilizante do solo, inabilitando, portanto, a sua atividade.

Além do mais, de acordo com a patente ES2234417, o processo para a preparação de um fertilizante biológico inclui a adsorção das cepas além dos nutrientes e sais no suporte sólido, obtendo assim um produto úmido que precisa 25 ser secado a fim de obter uma alta estabilidade celular. De fato, um alto nível de umidade no produto final pode provocar uma rápida degradação das cepas e reduzir a viabilidade.

A etapa de secagem é realizada a uma temperatura compreendida entre 60 - 80°C, que é relativamente alta para preservar a viabilidade das cepas. O nível de umidade obtido, portanto, está compreendido entre 3-6%. De acordo com a patente ES2234417, cada cepa, além dos nutrientes, é absorvida em um suporte sólido diferente, obtendo assim pelo menos duas séries diferentes de suportes sólidos, que são misturadas em quantidades pre- determinadas, obtendo o fertilizante biológico. De acordo com este processo, é, 5 portanto, necessário realizar pelo menos duas etapas diferentes de secagem uma vez que os nutrientes e as cepas são secados separadamente e as células nunca alcançam temperaturas maiores do que 80°C.

Resumo da invenção

Um objeto da presente invenção é proporcionar um fertilizante biológico que exerça uma ação de fertilização e/ou estimulação do crescimento vegetal imediato assim que o fertilizante entra em contato com a planta através do solo.

Outro objeto da presente invenção é proporcionar um fertilizante biológico que exerça uma ação de fertilização e/ou estimulação do crescimento melhorada.

De modo semelhante, outro objeto da presente invenção é proporcionar um fertilizante biológico cuja atividade é sustentada, isto é, é mantida estável em condições de armazenamento, por um longo período de tempo, no mínimo dois anos.

Finalmente, outro objeto da presente invenção é proporcionar um

processo para a preparação de um fertilizante biológico compreendido por um número reduzido de etapas em comparação com o processo de acordo com o estado da técnica e que apresente diversas vantagens industriais.

Descrição da invenção Estas e outras vantagens que serão melhores compreendidas abaixo

são obtidas com um fertilizante que está compreendido por:

a) uma cultura pura da cepa C3 da espécie Pantoea dispersa depositada na Coleção Espanhola de Cultivos Tipo (CECT) com o número CECT 5801,

b) uma cultura pura da cepa M3 da espécie Azospirillum brasilense depositada na CECT com o número CECT 5802, ambas imobilizadas em um suporte sólido,

c) ácido indol-3-acético (AIA).

O novo fertilizante biológico, de acordo com a presente invenção, contém células de Azospirillum brasilense, cepa M3, fixadora de nitrogênio atmosférico e que possui uma elevada capacidade para produzir substâncias reguladoras do crescimento vegetal do tipo ácido indol-3-acético (AIA), e Pantoea dispersa, cepa C3, que é altamente eficiente na produção de ácidos orgânicos, principalmente ácido glucônico, para a solubilização de fosfatos e outros nutrientes do solo, além da capacidade de produzir, por exemplo, sideróforos e substâncias reguladoras do crescimento vegetal. Os citados microrganismos foram depositados na Coleção Espanhola de Cultivos Tipo (CECT) que lhes designou os números de depósito CECT-5802 para Azospirillum brasilense M3 e CECT-5801 para Pantoea dispersa C3. O citado fertilizante biológico é composto por um produto formado por um suporte sólido, no qual as bactérias foram imobilizadas e contêm, além disso, os nutrientes necessários para assegurar a sua sobrevivência, uma vez inoculadas nas plantas, atuando como um sistema de liberação lento.

O microrganismo Azospirillum brasilense M3 CECT 5802 foi obtido por meio de um método que combina o isolamento em meio NFb semi-sólido e a seleção através da sua capacidade para estimular o crescimento vegetal e produzir ácido indol-3-acético e outros hormônios vegetais. A capacidade para estimular o crescimento vegetal foi comprovada por meio de bioensaios de laboratório e de estufa, de acordo com os métodos descritos por Bashan e outros 1986, Femández 1995 e Bashan 1998. Foi comprovado, por meio destes bioensaios, que a cepa M3 foi a que produzir o maior efeito estimulador do crescimento dentre os mais de 50 isolados de bactérias fixadoras de nitrogênio que passaram pelo ensaio. A produção de ácido indol-3-acético (AIA) foi verificada por métodos colorimétricos (Pi Iet e Chollet 1970) e HPLC (Olivella e outros 2001), assim como se detectou a presença de outros hormônios vegetais do tipo citocininas. Na produção de AIA em meio tomate com 200 mg x L"1 de triptofano, concentrações de 100-180 mg x mL'1 e uma porcentagem de transformação de até 95% deste aminoácido são alcançadas. O microrganismo Pantoea dispersa C3 CECT 5801 foi obtido utilizando o método que combina isolamento em meio Agar com tampão Tris_HCl I N pH 8, por zonas de clareamento do agar (Gyaneshwar e outros 1999) e seleção, por meio de 5 determinação de PO4 ' solubilizado em meios líquidos agitados (Nautiyal 1999), usando em ambos os casos Ca3PO4 insolúvel como a única fonte de fósforo. Os ácidos orgânicos produzidos foram caracterizados e foi verificado que produz principalmente ácido glucônico. A seleção também foi feita através da capacidade do mesmo para estimular 0 crescimento vegetal e produzir auxinas.

De acordo com a presente invenção, o novo fertilizante biológico está

compreendido, além disso, pelas cepas C3 e M3, ácido indol-3-acético (AIA).

Este terceiro componente representa um progresso significativo em relação aos fertilizantes biológicos conhecidos. De fato, a presença de AIA desde o início junto com as duas cepas C3 e M3 confere ao produto resultante a 15 possibilidade de ficar ativo imediatamente assim que o fertilizante entra em contato com a planta através do solo, uma vez que o AIA é capaz de exercer a sua ação como estimulador do crescimento vegetal, enquanto as cepas C3 e M3 são capazes de iniciar a produção de AIA após a sua inoculação no solo e depois da conversão dos substratos necessários. Como o novo fertilizante, de acordo com a presente 20 invenção, há uma vantagem imediata devido à presença de AIA, que age como estimulador do crescimento vegetal assim que o fertilizante entra em contato com a planta através do solo, permitindo, assim, que as cepas C3 e M3 colonizem as raízes das plantas e estabeleçam com estas uma relação que as permita realizar a sua ação estimuladora do crescimento.

De modo adicional e surpreendente, foi verificado que a mesma cepa

C3 produz ácido indol-3-acético (AIA) em uma quantidade muito significativa.

Por exemplo, na produção de AIA em meio tomate com 200 mg x L'1 de triptofano, concentrações de 80-120 mg x mL'1 e uma porcentagem de transformação de até 60% deste aminoácido foram alcançadas.

Este é um aspecto muito importante, uma vez que a produção de ácido indol-3-acético (AIA) a partir da cepa C3 representa uma melhora na atividade total do fertilizante biológico resultante.

Na verdade, no novo produto fertilizante, de acordo com a presente invenção, as duas cepas C3 e M3 são capazes de produzir ácido indol-3-acético (AIA), conferindo assim ao produto uma atividade substancialmente aperfeiçoada como um fertilizante vegetal e estimulador do crescimento vegetal se comparado com fertilizantes biológicos conhecidos que atuam em quantidades semelhantes.

O novo fertilizante biológico de acordo com a presente invenção em comparação com a mesma quantidade de um fertilizante de acordo com o estado da técnica é, deste modo, capaz de produzir uma quantidade maior de AIA. O que foi previamente exposto representa, portanto, uma enorme vantagem comercial e econômica.

De acordo com a presente invenção, em um primeiro exemplo de realização o AIA pode ser produzido, do modo vantajoso, durante a etapa de 15 fermentação para preparação das cepas, ou diretamente adicionado no final do processo de fermentação da cepa antes da adsorção das mesmas no suporte sólido. Como uma alternativa, o AIA pode ser adicionado aos nutrientes antes da adsorção destes no suporte sólido.

De acordo com um segundo exemplo de realização da presente 20 invenção, a formação de AIA pode ser induzida através da adição de triptofano ao meio de cultura durante a etapa de fermentação para a preparação das cepas, permitindo a produção de AIA por elas mesmas e obtendo um produto completamente natural. De acordo com este exemplo, o caldo de cultura resultante inclui as cepas (C3 ou M3) e AIA que foi produzido diretamente pelas cepas. O 25 caldo pode ser adsorvido diretamente no suporte sólido incluindo o AIA produzido durante a fermentação.

A presente invenção proporciona um processo para a produção de fertilizantes biológicos, estando o citado processo compreendido pelas etapas a seguir:

a) Culturação de microrganismos C3 e M3. b) Imobilização em matrizes sólidas.

c) Secagem.

De acordo com o processo, a etapa c) consiste na secagem da matriz sólida. Esta é a etapa principal do método aperfeiçoado.

De acordo com o estado da técnica, a secagem separada de

microrganismos e nutrientes é bem conhecida; as temperaturas de secagem são 80°C e 200°C, respectivamente. De fato, uma temperatura alta é exigida para reduzir o grau de umidade da matriz sólida, por exemplo, zeolita. O grau de umidade aceitável deve estar compreendido entre 4 e 8%, embora um grau mais baixo poderia ser desejável.

Na verdade, sabe-se que quando um microrganismo é unido a uma matriz, quanto mais baixa a temperatura da corrente de ar de secagem, maior é a sobrevivência, sendo que a temperatura máxima de secagem permitida no caso presente é 80°C, já que temperaturas mais altas da corrente de secagem induzem à morte do microrganismo.

Os limites e condições mencionadas acima de acordo com o estado da técnica são surpreendentemente superadas pelo método descrito de acordo com a presente invenção. O aperfeiçoamento na secagem está essencialmente baseado no fato de que, na presente invenção, a secagem é realizada em um secador de leito 20 fluidizado que permite uma redução considerável na temperatura do ar de secagem pois aumenta consideravelmente a área de contato.

A etapa de secagem, de acordo com a presente invenção, é, consequentemente, caracterizada por ser compreendida pela desidratação do suporte sólido adsorvido com os microrganismos e/ou nutrientes e sais e realizada em um secador de leito fluidizado, que permite reduzir consideravelmente a umidade residual do produto operando a uma temperatura de apenas 35°C.

Breve descrição dos desenhos

A figura 1 mostra os resultados de tratamentos de fertilização em plantas, obtidos com o fertilizante biológico de acordo com a presente invenção.

Além disso, as figuras 2, 3 e 4 mostram um resumo dos resultados obtidos nos diferentes testes conduzidos quanto ao peso médio das alfaces e o conteúdo de nitrato nos solos e folhas.

Descrição detalhada de um exemplo de realização

Uma descrição do método para obtenção do objeto da presente invenção é explicada abaixo como um exemplo.

O secador de leito fluidizado é alimentado com a massa necessária para a sua operação e se trabalha a uma temperatura ambiente máxima de 35°C. O produto será, então, gradualmente secado até alcançar a umidade que estará entre 2- 5%, preferivelmente 2-3%, mais preferivelmente 2-2,5%, que é o valor de umidade do produto finalizado.

O processo de imobilização e adsorção dos nutrientes em uma única etapa e a secagem a temperaturas máximas de 35°C permitiu o aumento da estabilidade e eficácia do produto, que preserva a sua atividade, sem perdas significativas em armazenamento, por no mínimo dois anos a temperaturas de até 15 trinta e cinco graus Celsius. A sua atividade estimuladora do crescimento vegetal foi comprovada durante mais de dois anos, conservando as suas propriedades iniciais. Na sua aplicação no campo, provou ser altamente eficaz para a colonização de raízes de diferentes cultivos e em diferentes tipos de solo, além de ter comprovado o efeito estimulador do crescimento e o efeito da nutrição geral das 20 plantas nos testes conduzidos.

Também foi verificado por meio de testes de campo que este método permite a eliminação da fertilização química e produz uma melhora considerável na estrutura do solo.

A melhora descrita acima relacionada ao método para a produção do fertilizante biológico possui diversas vantagens em relação ao processo de acordo com o estado anterior da técnica. Temperaturas e graus de umidade mais baixos tomam o fertilizante mais estável e permitem que ele permaneça ativo por no mínimo dois ou três anos.

O novo método de produção do fertilizante biológico de acordo com a presente invenção proporciona uma solução para os problemas técnicos e industriais descritos acima. Além do mais, o citado método de acordo com a etapa a) possui outra vantagem no seu uso como um meio de cultura para a produção das mencionadas cepas de pasta de tomate como uma fonte de carbono e hidrolisado de colágeno de pele de origem animal para o uso em fertilização como uma fonte de 5 nitrogênio orgânico com o que elevadas contagens celulares são alcançadas em 24- 36 horas de fermentação para as duas cepas. Além disso, a introdução de L- triptofano no meio de cultura provoca a produção de elevadas quantidades de auxinas durante a fermentação que passam logo para o produto final, conferindo um efeito adicional de enraizamento desde a sua aplicação. O meio de cultura 10 possui uma relação custo-benefício muito boa e, o mais importante, elevadas contagens celulares da ordem de IO9-IO10 células x mL'1 são alcançadas nos dois casos. Este meio também foi testado com resultados semelhantes na cultura de cepas de outros gêneros de bactérias e fungos isolados pelos autores.

A presença de L-triptofano no meio de crescimento da fase de fermentação proporciona uma fonte imediata para a produção de AIA por microrganismos C3 e M3.

Além do mais, de acordo com o presente método, a etapa b) possui outra vantagem que consiste na imobilização de células, sais e nutrientes na mesma matriz sólida.

Este processo é realizado simultaneamente e por atomização do

sólido com os caldos de fermentação e as soluções de nutrientes, seguindo um esquema seqüencial. Para realizar esta fase, um misturador de sólidos é utilizado e este possui um acessório que permite pulverizar líquidos a medida que estes são misturados e homogeneizados. O misturador é carregado com zeolita e pedra de 25 fósforo e o processo de mistura é realizado durante 5-10 minutos. Em seguida, e mantendo o misturador em movimento, os caldos de células são adicionados em ordem seqüencial, primeiro M3 e depois C3. Para finalizar e mantendo o misturador em movimento com o propósito de se obter um sólido úmido homogêneo, realiza- se o processo de adsorção dos nutrientes utilizando-se as matérias primas e 30 proporções a seguir: Sal Concentração Volume x IOOkg de sólidos (NH4)2SO4 550-650 g/L 3,5-4,0 L de solução K2HPO4 500-600 g/L 0,8-1,2 L de solução Zn(NO3)2.4H20 100-150 g/L 0,1-0,2 L de solução MnSO4. H2O 100-150 g/L 0,1-0,2 L de solução CuS04.5 H2O 10-40 g/L 0,03-0,06 L de solução FeSO4JH2O 10-40 g/L 0,03-0,06 L de solução Sem interromper o misturador, cada uma das soluções descritas acima é pulverizada seqüencialmente e na mesma ordem na qual estão descritas. Mistura- se bem por 15-30 minutos para obter um sólido úmido homogêneo.

Esta nova etapa aperfeiçoada reduz o tempo do processo e permite 5 obter uma matriz sólida que contém os componentes da invenção. Esta vantagem é muito importante, uma vez que o suporte sólido pode ser submetido a uma única etapa de secagem, evitando, assim, a necessidade de realizar pelo menos três etapas diferentes de secagem para os diferentes suportes sólidos com diferentes componentes.

A vantagem principal do método para a obtenção do produto de

acordo com a presente invenção é a nova etapa de secagem. A citada nova etapa de secagem poderia ser realizada em suportes sólidos de acordo com o estado anterior da técnica, e também em suportes sólidos obtidos de acordo com um novo aspecto, isto é, a possibilidade de imobilizar as duas cepas C3 e M3 além dos nutrientes e 15 qualquer outro componente na matriz sólida ao mesmo tempo e em uma única etapa do processo.

Consequentemente, de acordo com a presente invenção, o fertilizante biológico pode ser produzido de acordo com qualquer processo descrito aqui, e o novo processo poder ser utilizado para produzir qualquer produto do tipo descrito acima.

Seção experimental

Os exemplos a seguir servem para ilustrar os princípios e metodologias através das quais os fertilizantes biológicos são obtidos. Estes exemplos servem para ilustrar os princípios e metodologias da presente invenção, porém não limitam o escopo da mesma.

Exemplo 1: Propagação de cepas Azospirillum brasilense M3 e Pantoea dispersa C3

Toma-se uma ampola do isolado da cepa M3 conservado, semeia-se em placas de meio Vermelho do Congo (Rodríguez Cáceres, 1982) e incuba-se a 3 O0C durante 72 horas para verificar a sua pureza. Um inóculo é preparado a partir desta placa para o fermentador tomando-se uma porção da cultura com um laço, se 10 inoculam 3 frascos Erlenmeyer de 2000-mL, com 750 mL de meio tomate sem L- triptofano cada um e se incuba em agitação a 3O0C durante 14-16 horas. Após este tempo, o conteúdo do frasco, que se encontra em fase exponencial, é inoculado em um fermentador Braun Biotech BIOSTAT® C de 30 L com 18 L de meio tomate sem L-triptofano. Cultiva-se por 8-10 horas e quando tiver alcançado uma elevada 15 concentração celular e ainda estiver na fase exponencial, se inocula o mesmo em um fermentador Braun Biotech BIOSTAT® D de 300 L com 200 L de meio tomate. A fermentação é realizada durante 24-36 horas a uma velocidade de agitação de 200 rpm, e a uma aeração de 50 L x min'1 (0,25 wm) e a uma temperatura de 30°C. O pH é deixado variar livremente e ao final apresentou um valor de 6,5. Uma 20 concentração de 9,4 x IO9 células x mL'1 foi alcançada e a concentração final de AIA foi de 120 mg x L'1. A velocidade específica de crescimento na fase exponencial (μ) foi de 0,28 h'1.

Como ilustrado acima, a cepa C3 seguiu o mesmo esquema de fermentação. A pureza da cultura foi verificada em meio MacConkey (OXOID 25 1981) e o inóculo foi incubado em um agitador orbital durante 12 horas. A cultura foi realizada no fermentador BIOSTAT® D durante 24-36 horas a uma velocidade de agitação de 300 rpm, e uma aeração de 100 L x min'1^^ vvm) e a uma temperatura de 30°C. O pH também é deixado variar livremente e ao final apresentou um valor de 6,7. Uma concentração de 1,12 x IO10 células x mL'1 foi 30 alcançada e a concentração final de AIA foi de 50 mg x L"1. A velocidade específica de crescimento na fase exponencial para esta cepa foi de μ = 0,52 h'1. Meio tomate:

Componente G Pasta de tomate 36,00 K2HPO4 3,30 KH2PO4 2,75 NH4CL 0,84 Hidrolisado de colágeno 5,00 Extrato de leveduras 0,75 Triptofano 0,2 H20(qSf) I L pH = 7,0 Esterilização a 1210C por 30 minutos Exemplo 2: Imobilização celular e carga de nutrientes Um misturador de arado que contém um pulverizador é utilizado para realizar este processo e as matérias primas a seguir são utilizadas: 97,5 Kg de zeolita; 2,5 Kg de pedra de fósforo; 3,6 L de caldo de M3; e 3,6 L de caldo de C3.

O misturador é carregado com zeolita e pedra de fósforo e o processo de mistura é realizado durante 5-10 min. Em seguida, e mantendo-se o misturador em movimento, os caldos de células são pulverizados em ordem seqüencial, primeiro M3 e depois C3. Para finalizar e mantendo o misturador em movimento

com o propósito de ser obter um sólido úmido homogêneo, realiza-se o processo de adsorção dos nutrientes utilizando-se as matérias primas e proporções a seguir:

(NH4)2SO4 59 g/L 3,83 L de solução K2HPO4 550 g/L 1,05 L de solução Zn(NO3)2.4H20 122,5 g/L 0,15 L de solução MnSO4. H2O 120 g/L 0,15 L de solução CuS04.5 H2O 24 g/L 0,05 L de solução FeS04.7H20 24 g/L 0,05 L de solução Sem interromper o misturador, cada uma das soluções descritas a cima é pulverizada seqüencialmente e na mesma ordem na qual estão descritas, passando uma pequena quantidade de água entre cada nutriente para limpar os condutos. Um total de 7,2 L foi adicionado nesta fase. Mistura-se bem durante 15- 30 minutos para se obter um sólido úmido homogêneo.

A zeolita e a pedra de fósforo foi umedecida com 14,4 L de líquido total, que foi completamente absorvido sem deixar líquido em excesso.

Exemplo 3: Secagem

O secador de leito fluidizado é alimentado com a massa necessária para o seu funcionamento e se trabalha a uma temperatura ambiente máxima de 35°C. O produto será, então, gradualmente secado até alcançar uma umidade final que estará entre 2-3% que é o valor de umidade do produto final.

A viabilidade celular deste produto será comprovada periodicamente em meio Vermelho do Congo (Rodríguez Cáceres, 1982) para Azospirillum 15 brasilense M3 e em meio MacConkey (OXOID 1981) para Pantoea dispersa C3, comprovando-se que mais de 90% da sua atividade é preservada durante mais de dois anos de armazenamento a temperaturas não maiores do que 3 5 0C. E evidente que o processo combinado de imobilização e adsorção de nutrientes, que permite uma maior saturação do suporte, e a temperatura de secagem de 35°C, que é muito 20 mais baixa em relação à temperatura de secagem de acordo com o estado anterior da técnica, e que atua muito favoravelmente na sobrevivência celular no processo de armazenamento do produto, permitiu um aumento considerável da eficácia e vida útil do produto, como pode ser observado na figura 1.

Em particular, esta figura mostra que a alface tratada com o fertilizante biológico com mais de dois anos de armazenamento mantém um padrão de crescimento natural mais alto comparado com o controle, que não recebeu qualquer tratamento. A barra cinza no gráfico representa o peso fresco da parte verde das plantas (PFF) e a barra preta indica o peso fresco da raiz (PFR) de alface resultado de um bioensaio em estufa em vasos e em turfa como um substrato. 0 gráfico de barras mostra que o fertilizante obtido por meio deste método mantém uma maior estabilidade e atividade durante mais de dois anos. Como pode ser observado, depois de 2 anos e meio o produto ainda preservava mais de 90% da sua

eficácia.

Exemplo 4: Avaliação de vantagens agrícolas

Para demonstrar que o produto é mais ativo se comparado com os fertilizantes químicos, diversas condições experimentais foram investigadas. For exemplo, diferentes culturas foram testadas em condições de campo e os resultados 10 foram muito satisfatórios. O cultivo de alface, em especial, foi testado em condições de campo para encontrar a variabilidade entre solos, variedades e sistemas de irrigação.

Em todos estes testes, a fertilização química foi completamente substituída, obtendo-se excelentes resultados no momento da colheita e no 15 conteúdo de nitrato tanto nas folhas quanto nos solos. Os resultados da distribuição de calibre das alfaces em um dos testes conduzidos são mostrados na Tabela 1. Como pode ser observado, uma melhor distribuição de calibre (tamanhos mais adequados) de interesse comercial foi alcançada com o uso do produto para o propósito da colheita, pois uma proporção muito maior de C-9 e C-IO foi alcançada 20 com o fertilizante do que no cultivo tradicional tratado com fertilização química.

Tabela 1.- Distribuição de calibres comerciais no ensaio de Águilas.

% DE DISTRIBUIÇÃO DE CALIBRE CALIBRES Fertilizante CULTURA UTILIZADA C-9 16% 28% C-10 57% 68% C-12 27% 4% A figura 2 mostra os efeitos do tratamento no crescimento da planta, medido como peso médio em gramas. A barra cinza no gráfico representa o fertilizante biológico da presente invenção, e a barra preta indica o controle utilizado. Pode ser observado que, em condições experimentais específicas, o peso da alface tratada com o fertilizante é superior ou comparável ao da alface tratada com o fertilizante químico. De fato, pode-se observar que, apesar de não utilizar fertilização química, os resultados obtidos são semelhantes e até mesmo superiores do que aqueles da cultura utilizada.

As figuras 3 e 4 mostram uma redução da concentração de nitratos e contaminantes ambientais no solo (figura 3) e nas folhas (figura 4). E evidente que

o uso do fertilizante biológico reduz significativamente a presença de nitratos e/ou contaminantes tanto no solo quanto nas folhas comparado com os fertilizantes químicos.

Na figura 3, pode ser concluído ainda que a contaminação ambiental causada por nitratos, fosfatos e outros fertilizantes químicos é drasticamente reduzida por meio da utilização deste produto biofertilizante. Já que nenhum tipo de fertilização química é acrescentada, o efeito de lavado destes sais dos solos é virtualmente eliminado. O conteúdo de nitrato nas folhas (figura 4) foi reduzido de maneira ainda mais considerável, tomando o produto muito mais saudável.

Claims

1. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO E ESTIMULADOR DO CRESCIMENTO VEGETAL", compreendido por: a - uma cultura pura da cepa C3 da espécie Pantoea dispersa depositada na Coleção Espanhola de Cultivos Tipo (CECT) com o número CECT 5801, b - uma cultura pura da cepa M3 da espécie Azospirillum brasilense depositada na Coleção Espanhola de Cultivos Tipo com o número CECT 5802, c - ácido indol-3-acético (AIA), ou um promotor de ácido indol-3-acético.

2. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela citada cepa referida como C3 ser capaz de produzir em meio tomate ácido indol-3-acético em concentrações da ordem de 80-120 mg x L"1.

3. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas citada cepas C3, M3 e o citado ácido indol-3-acético serem imobilizados em um suporte sólido.

4. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo citado suporte sólido ser formado por zeolita natural.

5. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo citado suporte sólido ser selecionado de um grupo compreendido por argila, vermiculita, perlita, sepiolita, caulim, terra diatomácea, zeolita natural.

6. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por estar compreendido por uma concentração de ácido indol-3-acético da ordem de 50-120 mg x kg'1 de produto.

7. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela zeolita natural ter sido carregada com sais e possuir a seguinte composição: nitrogênio total (NH4+): 0,3-0,5%, potássio (K2O): 0,10-0,25%, fósforo (P2O5): 0,50-0,75%, zinco (Zn2+): 85-110 ppm, ferro (Fe2+): 600-800 ppm, manganês (Mn2+): 250-300 ppm e cobre (Cu2+): 10-20 ppm.

8. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizado por comportar-se como um sistema de liberação lento para a liberação de células, nutrientes e outras substâncias.

9. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,6,7 e 8, caracterizado por possui um grau de umidade compreendido entre 2-5%.

10. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8 e 9, caracterizado por possuir um grau de umidade compreendido entre 2-3%.

11. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 e 10, caracterizado por possuir um grau de umidade compreendido entre 2-2,5%.

12. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 , 10 e 11, caracterizado pelo citado promotor de ácido indol-3-acético ser um L-triptofano.

13."MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, caracterizado por ser compreendido pela etapa a seguir: obtenção de cepas através da cultura de cepas C3 e M3 por meio de um processo de fermentação imerso em um meio de cultura compreendido por uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio orgânico e que contém triptofano.

14. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser compreendido pela etapa de: imobilização celular e carga de nutrientes que é realizada simultaneamente e por pulverização do sólido com os caldos de fermentação e as soluções de nutrientes, seguindo um esquema seqüencial, misturando continuadamente para obter um sólido úmido homogêneo.

15. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela citada fonte de carbono ser uma pasta de tomate concentrado a 3-5% por volume em relação ao volume total da cultura, a citada fonte de nitrogênio ser um hidrolisado de colágeno de pele de origem animal a 0,2-1% por volume em relação ao volume total da cultura na qual são alcançadas as concentrações celulares de IO9-IO10 células/mL e uma concentração de ácido indol-3-acético de não menos do que 50 mg x L'1.

16. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo citado ácido indol-3-acético ser adicionado durante e/ou depois da etapa de fermentação.

17."MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", método para a preparação de produção de um fertilizante biológico, sendo o citado fertilizante biológico compreendido por cepas de Azospirillum brasilense cepa M3 (CECT-5802) e Pantoea dispersa cepa C3 (CECT-5801), compreendido pelas etapas de culturação das citadas cepas, imobilizando-as em matrizes sólidas e secando-se as citadas matrizes, caracterizado pela citada etapa de secagem ser realizada em um secador de leito fluidizado a uma temperatura não menor do que 35°C, com secagem e fluxo de ar contínuos, obtendo-se o citado fertilizante biológico com um grau de umidade entre 2-5%.

18. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo citado grau de umidade estar compreendido entre 2-3%.

19. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo citado grau de umidade estar compreendido entre 2-2,5%.

20. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela citada etapa de culturação das citadas cepas estar compreendida pela fermentação das citadas cepas em um meio de crescimento com adição de L-triptofano.

21. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela citada etapa de imobilização ser realizada pela adsorção de cepas e nutrientes na mesma matriz sólida.

22. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pela citada matriz sólida ser zeolita.

23. "MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela citada etapa de imobilização ser realizada pela adsorção de cepas, sais e nutrientes em diferentes matrizes sólidas.

24."MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UM FERTILIZANTE BIOLÓGICO", de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelas citadas matrizes sólidas serem zeolitas.

25. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO, obtido de acordo com a reivindicação 17.

26. "FERTILIZANTE BIOLÓGICO", obtido de acordo com a reivindicação 20.