BR112015025912B1

BR112015025912B1 - Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal, suporte de teca, e, inoculante biológico

Info

Publication number: BR112015025912B1
Application number: BR112015025912-0A
Authority: BR
Inventors: Lina Marcela Morales Palencia; Juan Sebastian P. Beltran Acosta; Lucia Ana Diaz
Original assignee: Pontificia Universidad Javeriana
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2022-04-26
Also published as: CO6660082A1; BR112015025912A2; US20160066583A1; WO2014167409A1; US10368548B2; BR112015025912A8

Abstract

PROCESSO DE IMOBILIZAÇÃO PARA OBTER UM INOCULANTE BIOLÓGICO ESTIMULADOR DO CRESCIMENTO VEGETAL, SUPORTE DE TECA, E, INOCULANTE BIOLÓGICO ESTIMULADO R DE CRESCIMENTO A presente invenção refere-se à obtenção e aplicação de um inoculante biológico para uso em material vegetal plantadas em um viveiro. Além disso, a presente invenção proporciona um processo de imobilização de estirpes bacterianas em um suporte e a aplicação em materiais vegetais. De igual modo, a invenção refere-se à utilização de bactérias da rizosfera nativas como um meio para promover o crescimento vegetal. A invenção consiste no desenvolvimento de um produto biológico baseado na aplicação de bactérias da rizosfera em um suporte de pó de serragem carbonizada de teca, que permite às plantas alcançarem melhores características em menos tempo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção está relacionada ao campo da biotecnologia agrícola e a aplicação de inoculantes biológicos para a promoção de crescimento vegetal sem afetar o meio ambiente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A indústria da madeira no ano de 2009 produziu USO 91.898.016.000 em importações em nível mundial e uns USD 89.787.048.000 em exportações, fator que indica que é um setor com alto impacto econômico no mundo. No caso da Colômbia para o ano de 2009 se obtiveram 46 milhões de dólares em exportações de madeira e o custe da importação este produto foi de 104,556 milhões de dólares, o que demonstra que há uma falência na produção de madeira para suprir a demanda interna (Trademap, 2011).

[003] O insumo principal para a obtenção de madeira são as espécies florestais corno o carvalho, pinho, eucalipto, cipreste ou nogueira. O banco mundial estima que cerca de 1,2 bilhões de empregos dependem da indústria florestal que se desenvolve principalmente na África, América Latina e Ásia. Na Colômbia, o 70% da área de bosques produtivos, está composto por espécies florestais introduzidas como a araucária, o urapán, o cipreste, diversos pinhos, eucaliptos e a teca entre outros.

[004] As plantações destas espécies florestais se localizam geralmente em terras agrícolas abandonadas e de baixa fertilidade, fato que tem gerado vários inconvenientes desde as fases iniciais de crescimento, relacionados com problemas em fertilização, baixa porcentagem de micorrização e um alto desenvolvimento de doenças (Jaramillo & Martínez- Nieto, 2009). Tudo isto tem levado ao desenvolvimento e implementação de uma variedade de produtos de grande utilidade nas fases iniciais de crescimento destas espécies.

[005] Somado ao anteriormente dito, atualmente existe um alto interesse pela realização de atividades e, utilizar produtos ambientalmente sustentáveis, como o caso dos substratos bio-enriquecidos e inoculantes biológicos, estes entendidos como produtos que contêm micro-organismos viáveis benéficos, utilizados na agricultura para a fixação de nitrogênio, a solubilização de materiais portadores de nutrientes, a promoção do crescimento vegetal, a micorrização ou transformação de matéria orgânica; o produto não deve conter micro-organismos patogênicos a humanos, plantas ou animais (Pardo 2002; Soroaet á, 2006; NTC 5842, 2011).

[006] O uso de micro-organismos para o desenvolvimento destes produtos é importante, já que são os componentes mais importantes do solo, responsáveis da dinâmica de transformação e desenvolvimento vegetal. A presença destes micro-organismos no solo o torna fértil, ou seja, aumenta a concentração de elementos nutritivos disponíveis para a planta ou de populações microbianas que liberem nutrientes que permitam um bom desenvolvimento das plantas.

[007] Dentro dos micro-organismos, as bactérias e os fungos de micorriza arbuscular foram reconhecidos pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura — FAO, como uma ferramenta importante para aumentar a produção agrícola e oferecer benefícios às plantas na proteção e na obtenção de nutrientes (Ocampo et al., 2001). Algumas características destes micro-organismos são o fato de que não requerem a colonização interna de tecidos em plantas para atuar, ou de ter a capacidade de aumentar em curto tempo sua densidade populacional na rizosfera depois de sua inoculação e o de colonizar efetivamente a superfície da raiz (Jiménez et al., 2001).

[008] No caso particular dos fungos, as vantagens mais importantes se evidenciam no aumento da capacidade de obtenção de fósforo e no melhoramento das relações hídricas e a adaptação das plantas produzidas em viveiro ao solo (Ocampo et al., 2001). As bactérias por sua parte promovem a interação entre as raízes das plantas e os fungos, a ação bioprotetora e o desenvolvimento vegetal, já que intervêm na produção de reguladores de crescimento vegetal como o ácido 3-indolacético (AIA); além do mais, facilitam a assimilação de nitrogênio e de sais inorgânicas. Outras vantagens se relacionam com um aumento no vigor, a emergência e o peso de mudas, assim como também um maior desenvolvimento nos sistemas radicais e um incremento de até 30% na produção (Jiménez eta., 2001; Bertolini etal., 2007).

[009] Com relação às espécies Pseudômonas sp. e Enterobacter sp., se identificou que se tem usado como biofertilizantes ou promotores de crescimento em Lactuca sativa (Kohler, 2009), em tomate (Gamalero, 2002; Pivato et al., 2009), em Medicago truncatula, em tabaco (Ramamoorthy et al., 2001) e em arroz (Nandakumar, 2001), entre outros.

[0010] Com relação à Enterobacter sp., se encontrou que tem sido utilizado em promoção de crescimento de canola (Saleh, 2001; Mayak, 2001; Nie et al., 2002), tomate (Holguin, 2003), em cravos (Li et al., 2005) e em cana de Açúcar (Mirza et al., 2001), entre outros.

[0011] A passagem dos nutrientes, a transferência de oxigênio e a adesão de uma população microbiana a as plantas se favorece com o uso dos suportes microbianos. O uso de suportes é importante porque no momento de introduzir micro-organismos a distintos ambientes sem um suporte podem apresentar-se baixas taxas de sobrevivência dos primeiros e uma baixa eficiência devido ao baixo número de unidades formadoras de colônias por gramo de solo. O uso do suporte permite um maior grau de sobrevivência nos processos de inoculação e além do mais não causam contaminação no ambiente onde se aplique. Estes suportes microbianos também são conhecidos como portadores microbianos.

[0012] Não obstante, se apresentam algumas limitações no uso de alguns suportes. Por exemplo quando se utiliza a turba como suporte, além do seu alto custo e baixa disponibilidade em nossos países tropicais, fala-se da baixa pureza do suporte, já que aos 90 dias de armazenamento em frio os inoculantes começam a apresentar contaminação com micro-organismos diferentes ao imobilizado (Stephens & Rask, 2000) como é o caso dos bacilos Gram positivos; com pó de serragem de bambu não se mantém a viabilidade celular e no caso do suporte alginato de sódio, mesmo que se mantenham as características de pureza, viabilidade e atividade biológica, os custos de obtenção do inoculante são altos.

[0013] Dentro dos suportes empregados com este fim, o estado da técnica divulga diferentes tipos, de acordo aos compostos por materiais porosos como o poliuretano, a celulosa, o polipropileno e a cerâmica. Estes suportes se caracterizam porque permitem a imobilização de células de animais, plantas, micro-organismos e protozoários. Os suportes de celulosa são susceptíveis à erosão, portanto, sua duração é mais curta e os suportes de cerâmica têm várias limitações por sua alta gravidade específica que lhes impede ser fluidos em agua.

[0014] Outro tipo de suportes são os compostos por geles, que incluem os compostos por poliacrilamida, glicol de polietileno e ácido algínico. Os suportes de gel podem conter grande quantidade de água, razão pela qual têm uma maior biocompatibilidade com as células de microorganismos, humanas e vegetais.

[0015] Para a promoção de crescimento vegetal e na indústria da agricultura, os suportes mais utilizados são os de argila, vermiculita, perlita, sepiolite, caolino, terra de diatomácea e zeólito natural, entre outros, como assim se apresenta na solicitação de patente W02009/027544A1.

[0016] Outras invenções relacionadas com o uso de suportes, onde se utiliza o pó de serragem, se identificaram no estado da técnica, como por exemplo, o documento de patente JP2000016889 que faz referência a um processo para a produção de abono como fertilizante de fermentação que utiliza bactérias fotossintéticas dos gêneros Rhodopseudomonas, Rhodospirillum e tothiorhodospira e das famílias Ectothiorhodospiraceae e Chloroflexaceae, com ácido acético ou um material que o contenha, e no qual se utiliza como adsorvente a mistura sobre um material poroso (30% p/p ou menos) produzido por carbonização da madeira, pó de serragem, cascas de côco, bagaço, cascos de trigo, cascas de sementes de algodão, sedimentos de café ou similares, uma zeólito, etc.

[0017] É importante destacar que este documento se limita a divulgar o requerimento de um 30% (p/p) ou menos do cultivo microbiano com respeito ao material poroso, da mesma forma como esta formulação inclui o requerimento de ácido acético ou uma fonte do mesmo em uma proporção de até oito vezes com respeito o volume do cultivo. Porém, não estabelece uma concentração dos micro-organismos particulares por gramo, fator que impossibilita a dosagem precisa dos componentes do produto.

[0018] Na patente KR960002627 se revela um promotor de compostagem que é obtido da mistura uniforme de uma parte de bactérias com pó de serragem, cascas de arroz e calcário em proporções (p/p) 4:5:1.

[0019] A patente KR920003238 divulga um agente para o melhoramento do solo que é obtido por meio das misturas do 94-97% (p/p) de matéria orgânica de resíduo com 2-5% (p/p) de pó de serragem, 0.2-0.5% de cal e 0.2-0.5% de cinzas de madeira e ajustar o pH a um valor entre 6.5 e 7.5.

[0020] A patente JP11029384 reporta um fertilizante orgânico promotor do crescimento vegetal que melhora efetivamente a qualidade do solo e permite a reutilização de resíduos industriais. Este fertilizante é obtido misturando salvado de arroz, pó de serragem de uma árvore de folhagem ou madeira, sedimentos líquidos de soja, palha cortada de plantas de arroz, resíduos de lixo ou carvão vegetal granular, com um material que compreende resíduos bacterianos de um cultivo de fungos (por exemplo Shiitake, Maitake e Shimeji) e fermentar o material resultante.

[0021] A patente JP4122788 faz referência a um ativador de solos e promotor do crescimento vegetal obtido pela fermentação aeróbica de uma fonte vegetal rica em fibras misturada com salvado de cereais, fósseis de crustáceos, entre outros e um complexo enzimático, o qual é misturado com pó de serragem ou lascas de madeira tratadas enzimaticamente.

[0022] As patentes KR960002627 e JP11029384 reportam etapas separadas como é o caso do alistamento do suporte (aquecimento e carbonização) e etapas de inoculação e incubação, respectivamente.

[0023] De acordo com a informação anterior, é evidente que ainda subsiste a necessidade de inoculantes biológicos para substratos de viveiro a fim de promover o crescimento vegetal sem que isso afete o meio ambiente e que permitam a obtenção de plantas com melhores características de vigor e sanidade em um menor tempo através de um processo que inclua etapas de alistamento do suporte, inoculação e incubação e que permitam a diminuição do uso de fertilizantes químicos.

OBJETO DA INVENÇÃO

[0024] Um objeto da invenção é um inoculante biológico estimulador de crescimento vegetal que compreende um suporte derivado do processo de transformação industrial da madeira de teca, e uma o más cepas bacterianas promotoras de crescimento vegetal, preferivelmente cepas bacterianas isoladas de raízes de teca. Este inoculante biológico pode ser combinado com excipientes adequados para formar um produto para ser aplicado ao material vegetal antes do plantio.

[0025] Outro objeto da presente invenção é proporcionar um processo de imobilização de cepas em um suporte caracterizado pelo tempo de cultivo, a realização de um cultivo secundário, a forma de armazenamento do inoculante e a aplicação sobre materiais vegetais provenientes de propagação clonal por estacas, pseudo estacas o mini estacas o proveniente de sementes- mudas.

[0026] Ainda, outro objeto da invenção é um produto caracterizado porque compreende o inoculante biológico junto com excipientes adequados para a estimulação do crescimento de plantas quando o produto é aplicado sobre sementes, mudas, estacas, pseudo-estacas o mini estacas

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] A figura 1 mostra os resultados na longitude radical de plantas de teca inoculadas com diferentes bactérias imobilizadas no suporte de pó de serragem de teca. As plantas foram semeadas em uma mistura de areia de quartzito, solo de viveiro e cascas de arroz em proporção 1:1:1. A longitude das raízes foi determinada 30 dias depois do plantio.

[0028] A figura 2 mostra o efeito do inoculante biológico empregando dois suportes (alginato e pó de serragem de teca) ou portadores sobre a longitude da raiz de plantas de teca semeadas em turba por 50 dias, empregando diferentes micro-organismos promotores do crescimento vegetal e um fito hormônio comercial.

[0029] A figura 3 mostra o efeito do inoculante biológico empregando dois suportes ou portadores sobre a longitude da raiz de plantas de teca semeadas por 25 dias, empregando diferentes micro-organismos promotores do crescimento vegetal e diferentes substratos de plantio: turba e mistura de arena, solo e cascas.

[0030] A figura 4 mostra o efeito sobre a biomassa obtida depois de 50 dias de cultivo empregando um fito hormônio comercial e diferentes micro-organismos promotores de crescimento vegetal imobilizados em pó de serragem de teca e semeados sobre turba como substrato.

[0031] A figura 5 mostra o efeito do inoculante biológico sobre o diâmetro do talo em plantas de teca semeadas em turba por 25 dias, empregando diferentes micro-organismos promotores do crescimento vegetal e dos suportes diferentes para sua imobilização: alginato de sódio e pó de serragem de teca.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] O processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador de crescimento vegetal da presente invenção inclui as seguintes etapas: 1. Conformar um suporte, a partir de pó de serragem de madeira teca de um tamanho entre 400-1000 pm, submetido a um tratamento térmico de tal modo que o pó de serragem se queime de maneira homogênea, que não gere cinza, que possua uma densidade aparente de 0.1 g/I a 0.2 g/!, preferivelmente 0.167 g/I, que sua cor esteja entre as categorias 7.5R2/4 e 10YR2/4 com presença de partículas de cor 10Y1/2 e acordo com a tabela de cores de Munsell e tenha a seguinte composição i. Carbono orgânico total entre 20% e 40% ii. Nitrogênio total entre 0.1% e 0.5% iii. Relação C/N >90 iv. Capacidade de intercâmbio catiônico >20 meq/100g v. Cálcio entre 8 e 15 meq/100 g vi. Magnésio entre 6 e 12 meq/100 g vii. Potássio entre 4 e 8 meq/100 g viii. Sódio entre 1 e 5 meq/100 g ix. Fósforo disponível entre 400 e 750 ppm 2. Cultivar uma ou mais cepas promotoras de crescimento vegetal do grupo das bactérias Gram negativas em um sistema de fermentação até o final de sua fase exponencial ou logarítmica, momento no que alcançam a máxima produção de biomassa celular e produzem metabolitos secundários de interesse agroindustrial como ácidos e compostos reguladores de crescimento vegetal, separar o sobrenadante e suspender novamente em solução salina de concentração 0.85% até uma concentração celular final de 1012 UFC/mL. 3. Misturar cada solução resultante da etapa 2 com o suporte de pó de serragem de teca obtido no ponto 1 em proporção de inóculo: suporte entre 2:5 a2:7. 4. Cultivar a mistura obtida na etapa por um período de tempo entre 24 e 72 horas a uma temperatura entre 25 °C e 42 °C e a opção de incluir excipientes, para obter o inoculante biológico.

[0033] As vantagens da presente invenção serão mais bem explicadas à continuação através da obtenção de um inoculante biológico que compreende: a. Um cultivo da cepa TgLGBR285 do gênero Stenotrophomonas depositada na coleção do departamento de Biologia da Pontifícia Universidade Javeriana com o número No BIO-PUJ-146, a coleção do departamento de Microbiologia com o número CM-PUJ-148, a qual por sua vez está registrada na Federação Mundial de Coleções de Cultivos (WFCC) com o número 857-CM-DM-PUJ; b. Ou um cultivo da cepa TgLGBR250 do gênero Enterobacter depositada na coleção do departamento de Biologia da Pontifícia Universidade Javeriana com o número No BIO-PUJ-146, a coleção do departamento de Microbiologia com o número CM-PUJ-148, a qual por sua vez está registrada na Federação Mundial de Coleções de Cultivos (WFCC) com o número 857-CM-DM-PUJ; c. Um suporte de pó de serragem de teca obtido a partir de madeira dura de teca que não requer imunização até antes de obter o pó de serragem.

[0034] A determinação dos suportes ou portadores é uma das etapas críticas na formulação do produto, devido a que estes têm que manter os micro-organismos viáveis ativos e em uma concentração maior a 106 (preferivelmente entre 106 e 109 UFC/rnL).

[0035] Dentro das características que um suporte deve apresentar para ser utilizado na formulação de bio inoculantes microbianos, estão a capacidade de retenção de água, porosidade, ausência de compostos tóxicos e de voláteis que afetem o crescimento microbiano, que sejam de fácil esterilização e manejo devido à homogeneidade de suas partículas.

[0036] Duas das categorias utilizadas como suportes na indústria dos inoculantes são o carvão só misturado com outros materiais e materiais ligninocelulolíticos incluindo bagaço, cascas e pó de serragem (D'souza e Godbole, 2002; Pandey e Maheswari, 2007). O pó de serragem contém estruturas com macro poros, como as laberintinas, que oferecem uma grande área superficial para a união com as bactérias (Podorozhko et al., 2008).

[0037] Kostov e Lynch (1998), utilizaram pó de serragem compostado como suporte para inoculantes baseados em bactérias Gram negativas fixadoras de nitrogênio dos gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium e Azospirillum com bons resultados sobre o crescimento da planta e o dos micro-organismos inoculados. Contudo o processo de compostagem é lento (demora mais de 40 dias) e o efeito sobre o crescimento pede ver-se emascarado pelos materiais que se adicionam no processo de compostagem. Por outra parte De Brito-Alvarez (1995) utilizou como suporte para bactérias a mistura de composto, pó de serragem, cascas de arroz e bagaço, mas as plantas de tomate apresentaram fito toxicidade. Em outros estudos realizados com pó de serragem como suporte, se reportou diminuição inicial das populações de bactérias Gram negativas como Bulkholderia sp. de 109 UFC/g a 107 UFC/g (Pandey e Maheshwari, 2007).

[0038] Não se encontrou reportes do uso de pó de serragem de Teca como suporte na formulação de bio inoculantes. Uma das razões está relacionada com seu efeito antimicrobiano. A durabilidade natural da madeira de Teca é alta, é resistente às degradações de fungos cromogêneos e de apodrecimento (Peraza, 2002). Esta durabilidade em seu durâmen, constituinte principal do pó de serragem, foi conferida à proporção de tectoquinona e naftoquinona, compostos aromáticos do grupo das antroquinonas (Thulasidas e Bhat, 2007), utilizadas como compostos antimicrobianos de efeito não generalizado. Ainda que para outras espécies vegetais não se reportem efeitos negativos de suas antraquinonas sobre bactérias Gram negativas como Pseudomonas sp. (Chukwujekwu et al., (2006), para os estratos de madeira de Teca existem estudos de seu efeito prejudicial sobre alguns gêneros este grupo bacteriano (Thulasidas e Bhat, 2007; Krishna & Jayakumaran, 2010).

[0039] O pó de serragem de teca sem queimar tem um conteúdo de Carbono Orgânico Oxidável Total entre 46 e 48 %, de sílice entre 1.5% e 2%, de Nitrogênio orgânico entre 0.35 e 0.38%, alto conteúdo de lignina entre 46 e 56%, de celulosa, entre 30 e 40%, de hemicelulose, entre 7 e 12 % e uma relação carbono: nitrogênio entre 125y 131. Esta última é menor do que reportado para outros pós de serragens, C:N= 300 (Pandey e Maheshwari, 2007).

[0040] O suporte derivado do processo de transformação industrial da madeira de teca para o inoculante biológico de acordo com a invenção pode ser pó de serragem proveniente da transformação industrial da madeira de teca e pode ter um tamanho de partícula entre 400 a 1000 micras.

[0041] O suporte derivado do processo de transformação industrial da madeira de teca obtido de acordo com a invenção se obtém através de combustão controlada e esterilização do material e este suporte tem as seguintes características e composição: o Carbono orgânico total entre 20% e 40% o Nitrogênio total entre 0.1% e 0.5% o Relação C/N >90 o Capacidade de intercâmbio catiônico >20 meq/100g o Cálcio entre 8 e 15 meq/100 g o Magnésio entre 6 e 12 meq/100 g o Potássio entre 4 e 8 meq/100 g o Sódio entre 1 e 5 meq/100 g o Fósforo disponível entre 400 e 750 ppm

[0042] Queremos destacar que estes valores físico-químicos apresentados pelo pó de serragem estão dentro dos rangos recomendados para diferentes suportes orgânicos e inorgânicos, e acordo com o que foi reportado por autores como Pandey e Maheshwari no 2007 (PANDEY, P e MAHESHWARI, D.K 2007. Bioformulation of Burkholderia sp. MSSP with a multispecies consortium for growth promotion of Cajanus cajan. Canadian Journal of Microbiology. 53: 213 —222).

[0043] O pó de serragem também pode obter-se por meio de um processo de combustão, por exemplo em uma mufla Neycraft JFF20000. O pó de serragem fresco com uma porcentagem de humidade entre o 50% e o 60%, se coloca sobre uma bandeja formando uma capa preferivelmente de 1,5 cm de espessura e se introduz na mufla previamente aquecida a 250°C. Depois de 60 minutos na mufla, se retira temporariamente para fazer um primeiro processo de homogeneização do material, depois se introduz novamente na mufla e se deixa por 30 minutos adicionais. Ao final deste tempo, o material se retira da mufla e se realiza um segundo processo de homogeneização para evitar que a capa superior seja calcinada.

[0044] Este pó de serragem obtido do processo de combustão, se humedece com solução salina e se esteriliza em autoclave a 121°C e 0,72 KPa (15 psi) em três ciclos cada um com uma duração entre 50 minutos e 100 minutos com um período de repouso do material entre 20 e 25 horas entre cada ciclo. O produto obtido é um suporte de pó de serragem de teca queimado e esterilizado.

[0045] A cepa bacteriana TgLGBR250 se caracteriza por ser um bacilo curto Gram negativo, sua atividade biológica mais importante é a de solubilizar fósforo, em relação à cepa de referência, Pseudomonas fluorescens ATCC BAA 477, solubilizando em maior proporção este elemento e alcançando halos de 8 mm em agar Pikovskaya e concentrações de derivados indólicos de 75.73 mg/L em caldo nutritivo suplementado com triptófano em 0.2% (p/v).

[0046] Por outro lado, a cepa bacteriana TgLGBR285 se caracteriza por ser um bacilo curto Gram negativo, produtora de derivados indólicos em concentração de 195.83 mg/L em cultivo em caldo nutritivo suplementado com 0.2% de triptófano (p/v), comparável com a cepa de referencia Azospirillum brasilense ATCC 29145 que produz 247 mg/L.

[0047] O método de isolamento das cepas TgLGBR285 e TgLGBR250 provenientes de raiz de Teca, se realizam sobre o meio de cultivo King B ®, a solubilização de fósforo se valia em meio Picovskaya (Pikovskaya, 1948) e a produção de ácido indolacético se avalia em caldo nutritivo suplementado com triptófano em 0.2% (p/v).

[0048] O processo de imobilização inicia com o cultivo proveniente de uma fermentação descontínua em Caldo nutritivo Difco das cepas bacterianas isoladas. Para o caso da cepa TgLGBR285 se cultiva durante um período de 8 a 24 horas, onde alcança uma concentração superior a 109 UFC/mL e para o caso da cepa TgLGBR250 se cultiva durante um período de 3 a 15 horas e alcança uma concentração superior a 109 UFC/mL.

[0049] Este procedimento se realiza em um sistema de fermentação descontínuo, por exemplo em um biorreator à escala com um volume efetivo de trabalho de 1 litro, a uma velocidade de agitação entre 110 rpm e 150 rpm e uma temperatura entre 28 °C e 35 °C.

[0050] Posteriormente se realiza uma centrifugação a 4500 rpm durante 15 minutos e o precipitado celular se suspende novamente em 1 I de solução salina. Repete-se o processo de centrifugação e se lava duas vezes mais. O precipitado da última centrifugação se suspende novamente em solução salina 8.5 g/L ajustando uma concentração de 1012 UFC/mL para cada uma das dos cepas.

[0051] O inóculo resultante por cada cepa se mistura com o suporte de pó de serragem de teca queimado e esterilizado. Prévio à realização da mistura, o suporte de pó de serragem se humedece com uma solução salina de concentração 8.5g/I (proporção entre 0.5:5 ml/g e 2.5:5 ml/g) e depois se mistura com o inóculo resultante de cada cepa em uma proporção entre 3 e 5 ml de inóculo por cada 5 a 7 g de suporte de pó de serragem.

[0052] Deixa-se cultivando a mistura por um período de entre 24 e 72 horas a uma temperatura entre 29 °C e 35 °C, o que se conhece como um cultivo secundário. o produto obtido ao finalizar este cultivo secundário é o inoculante biológico, que compreende um suporte de pó de serragem de teca e uma ou mais cepas bacterianas promotoras de crescimento vegetal. As bactérias que se incluem neste documento de patente são mesófilas e por isso sua temperatura de crescimento está entre os 25 °C e 42 °C com uma óptima entre 28 e 32 °C.

[0053] O inoculante biológico mantém sua viabilidade e atividade biológica até os 120 dias a uma concentração superior a 1010 UFC/mL no caso da cepa TgLGBR285 e superior a 1011 UFC/mL no caso da cepa TgLGBR250. Ambos os valores são comparáveis com os da cepa controle de Azospirillum brasilense ATCC 29145 que obteve uma concentração de 10x1011 UFC/g. Da mesma forma, sob estas condições se obtém uma pureza do 100%.

[0054] Pode-se preparar um produto pastoso com o inoculante biológico obtido, misturando 720 mL de carboximetilcelulose que tem uma concentração de 4g/L previamente esterilizada em autoclave e 180 g do inoculante biológico. Esta mistura obtida se aplica sobre o material vegetal permitindo um tempo de contato entre a mistura e o material vegetal de pelo menos 15 minutos antes do plantio sem que o material se desidrate. A concentração do inóculo no momento da aplicação da mistura sobre o material vegetal é maior ou igual a 1011 UFC/g mistura inoculante biológico+carboximetilcelulose dando cumprimento ao limite mínimo estabelecido (107UFC/g). O produto pastoso obtido tem um volume final de 900m1 cujo rendimento é: 2200 mini estacas ou 1220 estacas ou 459 mudas inoculadas. A relação entre gramas de inoculante e solução de carboximetilcelulosa é de 4:20,quer dizer, 4 gramas de inoculante por cada 20 mL de solução de carboximetilcelulosa.

[0055] O processo de imobilização das cepas para obter o inoculante biológico estimulador se pode condensar nas seguintes etapas de acordo com o indicado anteriormente: a) cultivar a cepa TgLGBR285 durante um período de 8 a 24 horas em um sistema de fermentação descontínuo uma velocidade de agitação entre 110 rpm e 150 rpm e uma temperatura entre 28°C e 35 °C; b) cultivar a cepa TgLGBR250 durante um período de 3 a 15 horas em um sistema de fermentação descontínuo uma velocidade de agitação entre 110 rpm e 150 rpm e uma temperatura entre 28°C e 35 °C; c) centrifugar por separado o produto das etapas a e b a 4.500 rpm durante 15 minutos e separar o sobrenadante; d) suspender novamente o precipitado celular de cada cepa em solução salina de concentração entre 1 a 20 g/L; e) repetir os passos c e d duas vezes; f) misturar o suporte de pó de serragem de teca com o inóculo resultante de cada cepa em uma proporção entre 2 e 3 ml de inóculo por cada 5 a 7 g de suporte de pó de serragem. g) realizar um cultivo secundário da mistura por um período entre 24 e 72 horas a uma temperatura entre 25°C e 42 °C.

[0056] Mais ainda, em uma modalidade preferida da invenção, o processo de imobilização de uma ou mais cepas bacterianas promotoras de crescimento vegetal para obter o inoculante biológico estimulador de acordo com a invenção, se encontra caracterizado porque o processo compreende as etapas de: a. cultivar cada cepa a empregar em um sistema de fermentação descontínuo por um período de 8 a 24 horas com agitação entre 110 e 150 rpm e uma temperatura entre 28°C e 35°C.; b. centrifugar o produto da etapa e separar o sobrenadante; c. suspender novamente em solução salina de concentração menor a 20 g/L o precipitado de cada cepa obtido na etapa d. repetir os pasos dos veces para cada cepa a emplear; e. misturar cada solução resultante da etapa com o suporte de pó de serragem de teca em um intervalo de proporção de inóculo: suporte entre 2:5 a 2:7 f. cultivar a mistura obtida na etapa por um período de tempo entre 24 e 72 horas a uma temperatura entre 25°C e 42°C.

[0057] Queremos indicar que a proporção citada se ajusta à capacidade de retenção de água dos suportes citados por Pandey e Maheshwari em 2007 e mantém a concentração bacteriana de 1011 UFC/g de suporte.

[0058] Em uma modalidade preferida da invenção, o suporte de pó de serragem queimado é previamente humedecido com uma solução de cloreto de sódio (NaCI) de 8.5g/L por 0.5 a 2.5 mililitros de solução por 5 gramas de suporte.

EXEMPLOS

[0059] Os seguintes exemplos servem para ilustrar o alcance da invenção:

[0060] O inoculante biológico em suas duas formulações com a cepa TgLGBR285 e a outra formulação TgLGBR250 foram comparados com o fito hormônio AIB (ácido indolbutírico) e com a cepa Azospirillum brasilense ATCC 29145, a qual é usada em uma formulação comercial conhecida.

Exemplo 1

[0061] Este ensaio se realizou para avaliar a longitude da raiz de plantas de teca, neste exemplo se compararam as cepas TgLGBR285 + suporte de pó de serragem de teca, TgLGBR250 + suporte de pó de serragem de teca e Azospirrillum brasilense + suporte de pó de serragem de teca em diferentes tipos de substrato de plantio em viveiro. Este ensaio se realizou com mini estacas de teca e a longitude das raízes foi determinada 30 dias depois do plantio, onde a cepa Azospirrillum brasilense foi empregada como controle.

[0062] Neste sentido, os resultados apresentados na figura 1 mostraram que TgLGBR285 + suporte de pó de serragem de teca e TgLGBR250 + suporte de pó de serragem de teca, foram melhores que a cepa de referência e comercial de Azospirillum brasilense + suporte de pó de serragem de teca na variável de crescimento de teca avaliada: longitude das raízes. No primeiro caso, se obteve uma longitude de 15,02 cm, no segundo uma longitude de 13,59 cm e para Azospirillum sp. uma longitude de 12,61 cm como se observa na figura 1.

[0063] Neste mesmo sentido, se avaliou o efeito do inoculante empregando dois suportes ou portadores, sobre a longitude da raiz de plantas de teca semeadas em turba por 50 dias empregando micro-organismos promotores do crescimento vegetal e um fito hormônio.

[0064] Ao avaliar a longitude de raiz das plantas de teca semeadas, os dados mostrados na figura 2 evidenciam um melhor resultado ao usar pó de serragem de teca como suporte para imobilizar os micro-organismos TgLGBR110, TgLGBR250 e TgLGBR285 obtidos de raízes de teca, diante do uso do alginato de sódio como suporte empregado no estado da técnica. No período de 50 dias a partir do plantio e empregando como variável avaliada a longitude de raiz das plantas, se observa- que os resultados obtidos com a cepa de referência e o fertilizante químico são equivalentes com o suporte de pó de serragem de teca e o alginato, o qual é consistente com o observado no exemplo 5 e evidencia que o inoculante biológico da invenção permitiria obter resultados superiores sem empregar fertilizantes químicos e superiores aos obtidos com a cepa de referência empregada no estado da técnica.

[0065] Na figura 3 se mostra o efeito do inoculante empregando dois suportes ou portadores sobre a longitude da raiz de plantas de teca semeadas por 25 dias mediante o uso dos dois substratos diferentes. É assim como se avaliou o efeito do uso do inoculante biológico na longitude da raiz. Para esta avaliação foram obtidos os inoculantes biológicos empregando as cepas TgLGBR285, TgLGBR250 e Azospirillum brasilense (Cepa de controle) e o procedimento de imobilização descrito na presente invenção empregando ambos os suportes: o suporte de pó de serragem de teca e o alginato de sódio.

[0066] Os resultados depositados na figura 3 evidenciam um crescimento das plantas superior o equivalente nos dois substratos de plantio avaliados, empregando o inoculante biológico com o suporte de pó de serragem de teca de acordo com a invenção e com alginato de sódio como suporte usado de maneira convencional. A longitude da raiz é superior ao empregar o inoculante biológico com suporte de pó de serragem de teca diante do que emprega alginato, inoculados com a cepa TgLGBR285 nos dois substratos avaliados. Ao semear em turba empregando o inoculante biológico com pó de serragem de teca como suporte, os resultados geralmente são superiores.

Exemplo 2

[0067] Realizou-se um ensaio com mini estacas de mini jardim clonal para medir a biomassa de raízes das plantas de teca produzidas em solo de viveiro. Neste ensaio, a comparação foi feita com as cepas TgLGBR285 + suporte de pó de serragem de teca, TgLGBR250 + suporte de pó de serragem de teca, A. Brasilense + pó de serragem de teca e o fito hormônio AIB 4000ppm + pó de serragem de teca durante um período de 50 dias. Todas as plantas foram semeadas em turba. Identificou-se um melhor resultado para a biomassa das raízes de plantas inoculadas com a bactéria TgLGBR250 (0,43g) por em cima do controle positivo das plantas às quais se aplicou o fito hormônio comercial (0,39g). Os resultados podem-se observar na figura 4.

[0068] Por outra parte, o diâmetro das plantas é substancialmente maior ao empregar o fito hormônio e as três cepas avaliadas imobilizadas no suporte de pó de serragem de teca comparado com os resultados das imobilizadas em alginato, que evidencia que o suporte de pó de serragem de teca melhora o efeito destas cepas, particularmente a cepa TgLGBR285, obtendo um diâmetro similar ao obtido com o fito hormônio pero sem os efeitos de empregar um produto químico. Ratificando o anteriormente dito, se observa na figura 5 que para a cepa de controle se obtêm resultados comparáveis entre o suporte de pó de serragem de teca e o alginato, o que evidencia que o suporte de pó de serragem de teca de acordo com a invenção, é favorável e conveniente diante dos suportes convencionalmente conhecidos no estado da arte.

Exemplo 3

[0069] Foram realizados ensaios para comprovar a propriedade do suporte de pó de serragem de teca de acordo com a invenção diante de um dos suportes ou portadores reportados amplamente para a formulação de bactérias promotoras de crescimento vegetal: alginato de sódio.

[0070] Neste exemplo se avaliaram a viabilidade e a estabilidade da atividade biológica até o dia 120 depois da imobilização de diferentes bactérias isoladas a partir de teca. Os suportes inoculados foram mantidos a 19±2°C. A atividade biológica avaliada corresponde à atividade da enzima nitrogenada presente nestas bactérias fixadoras de nitrogênio.

[0071] Os resultados são apresentados na Tabela 1 a seguir. Em todos os casos foram realizados cultivos secundários. Tabela 1

[0072] Neste sentido, se pode observar que as bactérias imobilizadas em pó de serragem de teca e armazenadas por até 120 dias a temperatura ambiente (19±2°C) mantêm sua viabilidade e atividade biológica em rangos similares às imobilizadas em alginato de sódio, portador normalmente utilizado na formulação de inoculantes biológicos. A viabilidade alcançou valores maiores aos estabelecidos para inoculantes biológicos segundo a Norma Técnica Colombiana NTC 5842 (107UFC/g).

Exemplo 4

[0073] No exemplo 4, se realizaram ensaios para avaliar a viabilidade de bactérias isoladas de teca e a cepa de referência Azospirillum brasilense ATCC 29145 imobilizadas em pó de serragem queimado de teca e em alginato de sódio, armazenadas a 4°C durante 120 dias. Os resultados são apresentados na tabela 2 a seguir. Tabela 2

[0074] Como se pode observar da tabela anterior, o pó de serragem queimado de teca mantém a viabilidade de diferentes isolamentos de teca em valores superiores aos da norma técnica mencionada, e também mantém a viabilidade de bactérias isoladas de outras espécies vegetais, como é o caso da cepa A. brasilense.

Exemplo 5

[0075] No seguinte exemplo se apresentam os resultados de viabilidade de bactérias isoladas de Guadua angustifolia-guadua, imobilizadas em pó de serragem queimado de teca e em alginato de sódio. A avaliação se realizou depois de armazená-las 30 e 45 dias, respectivamente, a 19±2°C. Na Tabela 3 se evidencia que de novo o pó de serragem queimado de teca mantém a viabilidade das bactérias imobilizadas nele. Tabela 3

[0076] Finalmente se avaliou a viabilidade de uma bactéria isolada de teca (TgLGBR250) e uma isolada de bambu (GaYaR3308) em outro suporte orgânico, casca

[0077] queimada de arroz. Para as duas cepas se mantêm a viabilidade ao imobilizá-las em pó de serragem queimado de teca, mas não quando se imobilizam na casca. Os suportes inoculados se mantiveram a 19±2°C durante 2 dias. Os resultados este exemplo são apresentados na Tabela 4. Tabela 4

Claims

1. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal, caracterizado por incluir as etapas de: a. Formar um meio de suporte a partir de serragem de madeira teca em um tamanho entre 400-1000 μm sujeita a tratamento térmico de modo que a serragem queime uniformemente, não gere cinzas, tenha uma densidade aparente de 0,1 g/l a 0,2 g/l, que sua cor esteja entre as categorias 7,5R2/4 e 10YR2/4 com presença de partículas coloridas 10Y1/2 de acordo com a carta de cores de Munsell e que tenha a seguinte composição i. Carbono orgânico total de 20% a 40% ii. Nitrogênio total entre 0,1% e 0,5% iii. Relação C/N >90 iv. Capacidade de permuta catiónica >20 meg/100g v. Cálcio entre 8 e 15 meq/100 g vi. Magnésio entre 6 e 12 meq/100 g vii. Potássio entre 4 e 8 meq/100 g viii. Sódio entre 1 e 5 meq/100 g ix. Fósforo disponível entre 400 e 750 ppm; b. Cultivar uma ou mais estirpes promotoras de crescimento vegetal do grupo de bactérias Gram-negativas em um sistema de fermentação, até ao final da fase exponencial ou logarítmica, quando atingem a produção máxima de biomassa celular e produzem metabólitos secundários que aumentam a solubilização de nutrientes nos substratos para semeadura de plantas e aumento de crescimento vegetal, em que os metabólitos secundários são ácidos e componentes que regulam crescimento vegetal, remover o sobrenadante e ressuspender o mesmo em concentração salina 0,85% a uma concentração celular final de 1012 CFU/mL; c. Misturar cada solução resultante da etapa (b) com o suporte de serragem de teca obtido na etapa (a) na proporção de inóculo: suporte entre 2:5 a 2:7; e d. Cultivar a mistura obtida na etapa (c) por um período de tempo entre 24 e 72 horas a uma temperatura entre 25°C e 42°C e opcionalmente incluir excipientes, para obter o inoculante biológico.

2. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que as estirpes são bactérias Gram-negativas que pertencem aos gêneros Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter ou Sphingomonas.

3. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a estirpe bacteriana é uma estirpe rizosfera selecionada do grupo que consiste pelo menos de uma estirpe TgLGBR285 Stenotrophomonas sp. e estirpe TgLGBR250 Enterobacter sp.

4. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a temperatura para cultivar a mistura está entre 25 e 42°C.

5. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que as bactérias solubilizam fósforo.

6. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o suporte de pó de serragem de teca tratado possui um pH entre 6.8 e 7.8.

7. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o suporte de pó de serragem de teca tratado tem uma capacidade de intercâmbio catiônico entre 20 e 30 meq/100 g.

8. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o suporte de pó de serragem de teca tratado tem uma contagem total de heterótrofos, de actinomicetos e de fungos inferior a 10 UFC/g.

9. Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a serragem tem uma densidade aparente de 0,167 g/l.

10. Suporte de teca, caracterizado pelo fato de que é obtido pelo processo como definido na reivindicação 1.

11. Suporte de teca de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de que o suporte de pó de serragem de teca tem um pH entre 6.8 e 7.8.

12. Suporte de teca de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de que o suporte de pó de serragem de teca tem uma capacidade de intercâmbio catiônico entre 20 e 30 meq/100 g.

13. Suporte de teca de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de que o suporte de pó de serragem de teca tratado tem uma contagem total de heterótrofos, de actinomicetos e de fungos inferior a 10 UFC/g.

14. Inoculante biológico compreendendo suporte de pó de serragem de teca que estimula crescimento caracterizado por ser obtido pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

15. Inoculante biológico de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de que é usado para diminuir o tempo de uma planta num viveiro.

16. Inoculante biológico de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de que a estirpe biológica é selecionada do grupo que consiste de pelo menos uma estirpe de TgLGBR285 Stenotrophomonas sp e estirpe TgLGBR250 Enterobacter sp.