CN113122531A - 一种解决连作障碍的高效微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物菌剂，具体涉及一种解决连作障碍的高效微生物菌剂。本发明的解决连作障碍的高效微生物菌剂是由发酵菌液和载体组成，其中载体是采用特定方法制备的功能化碳酸钙微球。本发明公开的解决连作障碍的高效微生物菌剂，制备工艺简单可行，且所用原料价格便宜、绿色无毒且可降解，使用本发明制备的微生物菌剂，不仅可以解决连作障碍，还可以促进作物生长发育，增加土壤中有益物质含量，起到改良土壤的作用。

Description

一种解决连作障碍的高效微生物菌剂
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种解决连作障碍的高效微生物菌剂。
背景技术
连作障碍，又称重茬病、再植病害、忌地现象，是指在同一作物或相关作物在同一块地进行种植后，在后续种植中，即使采取正常的管理措施，仍会产生作物生长状况不良、产品质量下降、生育状况恶化等现象。在作物栽培中，作物的连作障碍非常普遍，园艺植物、经济植物、药用植物、包括瓜果类、蔬菜以及花卉等都存在严重的连作障碍问题。
作物连作障碍的形成及其加重是作物及与作物相关的土壤、微生物等诸多因素相互作用结果的外在表现，是一个错综复杂的整体问题。不同作物发生连作障碍的原因差异很大，但主要原因包括土壤理化性质恶化(养分流失、土壤酸化、酶活性降低及土壤盐渍化等)、微生物群落结构的改变以及化感自毒作用等因素。目前，克服连作障碍的主要方式是化学防治，虽然有一定的效果，但是会对土壤环境造成污染，长远来看，更是对作物安全稳定生产产生不利影响。
微生物菌剂是以多孔物质作为吸附剂，吸附菌体发酵液后加工制成的活菌制剂，施加到土壤中不仅可以为农作物提供生长所需养分，还可以起到转化或者降解作物种植土壤中所含有毒及有害物质的毒性和浓度，从而起到生物修复种植土壤的作用，解决作物种植产生的连作障碍问题。
申请号为201610631659.6的发明专利公开了一种可以消减作物连作障碍的复合菌剂组合物，其中包括直接将微生物菌剂和增效物质喷洒在蚯蚓粪土上制成固体肥料，通过喷洒虽然能在蚯蚓粪土上吸附微生物菌剂，但是吸附量极低，而且在后续干燥、运输等过程中，容易造成微生物菌剂和增效物质脱落，导致出现该复合菌剂组合物利用率低、使用效果不明显等一系列问题。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种解决连作障碍的高效微生物菌剂。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，由发酵菌液和载体组成。
一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，由发酵菌液和载体按质量比1:(1-3)组成。
所述解决连作障碍的高效微生物菌剂的制备方法如下：将发酵菌液和载体按照质量比1:(1-3)混合并以600-1000rpm搅拌20-40min，然后在40-45℃下干燥4-6h，即得所述解决连作障碍的高效微生物菌剂。
所述发酵菌液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取菌种接种于液体种子培养基中，于26℃、150-180rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到108cfu/mL，得到种子液；所述液体种子培养基如下：20-26重量份葡萄糖、15-20重量份硫酸铵、10-14重量份牛肉浸粉、6-9重量份酵母粉、2-4重量份氯化钾、18-25重量份硫酸亚铁、80-90重量份水，pH＝3-3.5，120-125℃灭菌15-25min；
(2)将步骤(1)得到的种子液按8-12％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于26℃、150-180rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到1010cfu/mL，得到发酵菌液；所述发酵培养基如下：45-55重量份糖蜜、14-18重量份麸皮、30-35重量份氯化铵、10-14重量份玉米浆、21-24重量份牛肉浸粉、15-20重量份酵母粉、5-10重量份氯化钠、7-10重量份硫酸镁、10-15重量份磷酸氢二钾、48-57重量份硫酸亚铁、260-285重量份水，pH＝3-3.5，120-125℃灭菌15-25min。
所述菌种为氧化硫硫杆菌。
氧化硫硫杆菌，革兰氏阴性菌，可通过分泌植酸酶、核酸酶、脱氢酶和磷酸酶等物质向胞外释放有机酸(如酒石酸、乙酸、草酸)以酸化难溶性磷，生成利于植物吸收的有效磷。
所述载体为硅藻土、沸石、麦饭石、碳酸钙、碳酸钙微球、功能化碳酸钙微球中的一种。
优选的，所述载体为碳酸钙微球或功能化碳酸钙微球。
所述碳酸钙微球的制备方法如下：将1-3重量份羟乙基纤维素加到90-110重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌15-25min，然后继续加入90-110重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌3-8min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球。
最优选的，所述载体为功能化碳酸钙微球。
碳酸钙，是一种无机功能增效物质，不仅具有价格低廉、环境友好、稳定性高等特性，而且其具有丰富的多孔结构作为载体时有利于提高负载效率。
明胶和壳聚糖是一类天然来源的大分子，具有良好的吸水性、生物相容性以及可持续性，并且可以通过分子间氢键和静电相互作用在碳酸钙微球表面自组装形成框架结构。
所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将1-3重量份羟乙基纤维素加到90-110重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌15-25min，然后继续加入90-110重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌3-8min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5-6，得到混合液a；将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、功能化碳酸钙微球：将S1得到的全部碳酸钙微球加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌10-20min，结束后以8000rpm离心5-15min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌10-20min，然后加入8-15重量份交联剂，继续搅拌15-30min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
黄腐酸，是一种优良的土壤改良剂，可以提高作物的抗旱性，促进养分吸收，稳定土壤的pH值以及减少肥料损失，为作物生长提供多种益处；磷酸镁铵，富含N、P、Mg，具有良好的生物相容性，可用作缓释肥料，与土壤中的重金属反应，形成高度不溶的含金属的羟基磷灰石。本发明制备的功能化碳酸钙微球对黄腐酸和磷酸镁铵的负载量高，具有良好的缓释性能，并且具有优异的生物降解性能。
优选的，所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将1-3重量份羟乙基纤维素加到90-110重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌15-25min，然后继续加入90-110重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌3-8min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5-6，得到混合液a；将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、将S1得到的全部碳酸钙微球加入40-60重量份混合液c中，置于功率150-250W、频率为30-50kHz的超声波中处理5-15min，得到浑浊液；所述混合液c由2-5mg/mL黄腐酸水溶液和0.1-0.5mg/mL磷酸镁铵水溶液按照质量比1:1组成；
S4、功能化碳酸钙微球：将S3得到的全部浑浊液加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌10-20min，结束后以8000rpm离心5-15min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌10-20min，然后加入8-15重量份交联剂，继续搅拌15-30min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
在本发明中，首先使用羟乙基纤维素作为调节剂，通过Ca2+与CO3 2-反应制备尺寸均一的碳酸钙微球，并通过羟乙基纤维素在微球表面修饰大量的羧基，然后利用碳酸钙表面的微孔提供的毛细管力将小分子的黄腐酸和磷酸镁铵吸收，接着明胶和壳聚糖通过静电吸附和分子间相互作用在碳酸钙微球表面完成自组装过程，并用交联剂与聚电解质交联，以除去过量的聚电解质，最终形成具有生物可降解和持续释放特性的微球结构。
所述交联剂为戊二醛和/或丙二酸。
优选的，所述交联剂为1wt％戊二醛水溶液和1wt％丙二酸水溶液按照质量比为1:(1-2)组成的混合物。
本发明使用戊二醛和丙二酸复配作为交联剂，是由于戊二醛中的醛基和丙二酸中的羧基均可以与明胶和壳聚糖上的氨基进行反应，除去溶液中过量的聚电解质，同时丙二酸还可以使微球表面的结构更为粗糙且内部产生更多不规则的中空结构，从而增加微球的比表面积，提高发酵菌液的吸附量。
本发明利用功能化碳酸钙微球作为固定微生物载体，功能化碳酸钙微球是一种表面粗糙且内部充满微孔结构且具有优良吸附性能和生物可降解的无机-有机功能增效物质，是搭载微生物的友好载体，一方面是由于其表面的明胶和壳聚糖上带有大量正电荷，可以通过静电作用吸附带负电荷的微生物，另一方面是由于其内部具有大量的孔结构，促使一部分微生物可以通过毛细管效应进入微球内部，随着微球的降解，内部的微生物可以缓慢释放，以达到微生物菌剂持续作用的目的。
本发明的有益效果：本发明提供了一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，弥补了现有技术中微生物菌剂由于采用蚯蚓粪土、沸石等载体吸附而带来的微生物负载量低、菌剂不能持续发挥作用等问题，本发明可以满足各种追肥模式和追肥条件，不仅微生物可以保持活性持续发挥作用，而且载体上包含的有效物质也会随着载体的降解进入土壤内部，对土壤发挥作用，增加土壤中有机质和有效磷等有益物质的含量，进而提高作物的抗逆能力，达到消除连作障碍的目的。本发明制备的解决连作障碍的高效微生物菌剂，不仅可以促进连作障碍的作物生长、发育，还可以改良连作障碍产生的土壤，提高作物抗逆能力，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
本申请中部分原料的介绍：
葡萄糖，购于苏州华欣旭化工科技有限公司，货号：HXX-001。
酵母粉，购于常州迪沙医药科技有限公司，货号：2000PPM，有效物质含量：70％。
牛肉浸粉，购于北京鸿润宝顺科技有限公司，货号：HRBS-Y014A，规格：BR。
麸皮，购于上海骧旭农产品贸易有限公司。
糖蜜，购于济南龙杰化工有限公司，有效物质含量：85％。
玉米浆，采用市售玉米浆干粉，购于济南青玉元新材料有限公司。
氧化硫硫杆菌，拉丁文名：Acidithiobacillus thiooxidans，菌株编号：ATCC19377，购于生物风国际物流中心。
碳酸钙，CAS号：471-34-1，购于西安沐森生物工程有限公司，有效物质含量：99％。
黄腐酸，CAS号：479-66-3，购于上海吉至生化科技有限公司。
磷酸镁铵，CAS号：13478-16-5，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
壳聚糖，CAS号：9012-76-4，分子量：10万，货号：M89296-13107，购于玛雅试剂有限公司。
明胶，CAS号：900-70-8，分子量：5万，购于河南锦义生物科技有限公司。
实施例1
一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，由发酵菌液和碳酸钙组成。
所述解决连作障碍的高效微生物菌剂的制备方法如下：将发酵菌液和碳酸钙按照质量比1:2混合并以800rpm搅拌30min，然后在42℃下干燥5h，即得所述解决连作障碍的高效微生物菌剂。
所述发酵菌液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取菌种接种于液体种子培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到108cfu/mL，得到种子液；所述液体种子培养基如下：24重量份葡萄糖、18重量份硫酸铵、12重量份牛肉浸粉、8重量份酵母粉、3重量份氯化钾、20重量份硫酸亚铁、85重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min；
所述菌种为氧化硫硫杆菌；
(2)将步骤(1)得到的种子液按10％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到1010cfu/mL，得到发酵菌液；所述发酵培养基如下：50重量份糖蜜、16重量份麸皮、32重量份氯化铵、12重量份玉米浆、23重量份牛肉浸粉、18重量份酵母粉、8重量份氯化钠、9重量份硫酸镁、12重量份磷酸氢二钾、50重量份硫酸亚铁、270重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min。
实施例2
一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，由发酵菌液和碳酸钙微球组成。
所述解决连作障碍的高效微生物菌剂的制备方法如下：将发酵菌液和碳酸钙微球按照质量比1:2混合并以800rpm搅拌30min，然后在42℃下干燥5h，即得所述解决连作障碍的高效微生物菌剂。
所述发酵菌液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取菌种接种于液体种子培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到108cfu/mL，得到种子液；所述液体种子培养基如下：24重量份葡萄糖、18重量份硫酸铵、12重量份牛肉浸粉、8重量份酵母粉、3重量份氯化钾、20重量份硫酸亚铁、85重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min；
所述菌种为氧化硫硫杆菌；
(2)将步骤(1)得到的种子液按10％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到1010cfu/mL，得到发酵菌液；所述发酵培养基如下：50重量份糖蜜、16重量份麸皮、32重量份氯化铵、12重量份玉米浆、23重量份牛肉浸粉、18重量份酵母粉、8重量份氯化钠、9重量份硫酸镁、12重量份磷酸氢二钾、50重量份硫酸亚铁、270重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min。
所述碳酸钙微球的制备方法如下：将2重量份羟乙基纤维素加到100重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌20min，然后继续加入100重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌5min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球。
实施例3
一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，由发酵菌液和功能化碳酸钙微球组成。
所述解决连作障碍的高效微生物菌剂的制备方法如下：将发酵菌液和功能化碳酸钙微球按照质量比1:2混合并以800rpm搅拌30min，然后在42℃下干燥5h，即得所述解决连作障碍的高效微生物菌剂。
所述发酵菌液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取菌种接种于液体种子培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到108cfu/mL，得到种子液；所述液体种子培养基如下：24重量份葡萄糖、18重量份硫酸铵、12重量份牛肉浸粉、8重量份酵母粉、3重量份氯化钾、20重量份硫酸亚铁、85重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min；
所述菌种为氧化硫硫杆菌；
(2)将步骤(1)得到的种子液按10％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到1010cfu/mL，得到发酵菌液；所述发酵培养基如下：50重量份糖蜜、16重量份麸皮、32重量份氯化铵、12重量份玉米浆、23重量份牛肉浸粉、18重量份酵母粉、8重量份氯化钠、9重量份硫酸镁、12重量份磷酸氢二钾、50重量份硫酸亚铁、270重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min。
所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将2重量份羟乙基纤维素加到100重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌20min，然后继续加入100重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌5min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5.5，得到混合液a；将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、功能化碳酸钙微球：将S1得到的全部碳酸钙微球加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌15min，结束后以8000rpm离心10min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌15min，然后加入10重量份1wt％戊二醛水溶液，继续搅拌20min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
实施例4
一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，由发酵菌液和功能化碳酸钙微球组成。
所述解决连作障碍的高效微生物菌剂的制备方法如下：将发酵菌液和功能化碳酸钙微球按照质量比1:2混合并以800rpm搅拌30min，然后在42℃下干燥5h，即得所述解决连作障碍的高效微生物菌剂。
所述发酵菌液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取菌种接种于液体种子培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到108cfu/mL，得到种子液；所述液体种子培养基如下：24重量份葡萄糖、18重量份硫酸铵、12重量份牛肉浸粉、8重量份酵母粉、3重量份氯化钾、20重量份硫酸亚铁、85重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min；
所述菌种为氧化硫硫杆菌；
(2)将步骤(1)得到的种子液按10％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于26℃、160rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到1010cfu/mL，得到发酵菌液；所述发酵培养基如下：50重量份糖蜜、16重量份麸皮、32重量份氯化铵、12重量份玉米浆、23重量份牛肉浸粉、18重量份酵母粉、8重量份氯化钠、9重量份硫酸镁、12重量份磷酸氢二钾、50重量份硫酸亚铁、270重量份水，pH＝3.2，121℃灭菌20min。
所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将2重量份羟乙基纤维素加到100重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌20min，然后继续加入100重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌5min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5.5，得到混合液a；将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、将S1得到的全部碳酸钙微球加入50重量份混合液c中，置于功率200W、频率为40kHz的超声波中处理10min，得到浑浊液；所述混合液c由4mg/mL黄腐酸水溶液和0.5mg/mL磷酸镁铵水溶液按照质量比1:1组成；
S4、功能化碳酸钙微球：将S3得到的全部浑浊液加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌15min，结束后以8000rpm离心10min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌15min，然后加入10重量份1wt％戊二醛水溶液，继续搅拌20min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
实施例5
与实施例4基本相同，区别在于：
所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将2重量份羟乙基纤维素加到100重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌20min，然后继续加入100重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌5min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5.5，得到混合液a；将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、将S1得到的全部碳酸钙微球加入50重量份混合液c中，置于功率200W、频率为40kHz的超声波中处理10min，得到浑浊液；所述混合液c由4mg/mL黄腐酸水溶液和0.5mg/mL磷酸镁铵水溶液按照质量比1:1组成；
S4、功能化碳酸钙微球：将S3得到的全部浑浊液加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌15min，结束后以8000rpm离心10min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌15min，然后加入10重量份1wt％丙二酸水溶液，继续搅拌20min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
实施例6
与实施例4基本相同，区别在于：
所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将2重量份羟乙基纤维素加到100重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌20min，然后继续加入100重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌5min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5.5，得到混合液a；将50重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与50重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、将S1得到的全部碳酸钙微球加入50重量份混合液c中，置于功率200W、频率为40kHz的超声波中处理10min，得到浑浊液；所述混合液c由4mg/mL黄腐酸水溶液和0.5mg/mL磷酸镁铵水溶液按照质量比1:1组成；
S4、功能化碳酸钙微球：将S3得到的全部浑浊液加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌15min，结束后以8000rpm离心10min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌15min，然后加入5重量份1wt％戊二醛水溶液和5重量份1wt％丙二酸水溶液，继续搅拌20min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
测试例1
甜瓜苗期生长情况测试：
(1)装土、施基肥：取连续种植6年甜瓜的冷棚耕层土壤自然风干，过0.2mm网筛后得到试验土样。取相同重量的试验土样分别作为试验组1-6和对照组，每组平行三份。其中试验组1-6中加入实施例1-6制备的解决连作障碍的高效微生物菌剂混合均匀，微生物菌剂的加入量为5％(W/W)；然后分别装入规格相同的塑料花盆中，记为L1、L2、L3、L4、L5、L6，对照组未加入微生物菌剂，标记为CK；
(2)播种、培育：将甜瓜种子(品种为博洋9号)在45℃温水中浸泡2h，每盆播种10粒，温室培养条件设置为温度26℃，湿度55％，自然光照强度为60％，每天光照时间为12h，待长出2片子叶时，统计出苗率，然后进行间苗，每盆留5株长势一致的幼苗；
(3)20天后对甜瓜苗期生长情况进行测定，结果见表1。
表1：甜瓜出苗率及苗期生长情况
出苗率(％) 株高(cm) 茎粗(mm) 株鲜重(g)
CK 46.7 14.80 2.34 29.74
L1 66.7 16.91 2.52 33.58
L2 76.7 20.64 2.76 37.26
L3 83.3 25.13 3.15 40.69
L4 90.0 30.57 3.57 43.81
L5 93.3 30.72 3.59 43.85
L6 96.7 32.45 3.76 46.13
以上结果可知，施加微生物菌剂的甜瓜出苗率和苗期生长状况明显优于空白组，可见本发明制备的微生物菌剂能促进作物发芽、株高、茎粗、株鲜重等生长指标的有效增加；进一步比较L1-L4可见，与L1的碳酸钙相比，L2-L4使用碳酸钙微球作为发酵菌液的载体，对甜瓜苗期生长的促进作用更为明显，可能是由于碳酸钙微球的比表面积更大，增加了发酵菌液的吸附量；与L3直接将明胶和壳聚糖自组装在碳酸钙表面相比，L4中微生物菌剂的载体功能化碳酸钙微球采用先将小分子有机质通过毛细管力吸附到碳酸钙微球内部，然后再通过静电吸附和分子间相互作用将明胶和壳聚糖自组装在碳酸钙微球表面，在功能化碳酸钙微球内部增加了一部分小分子有机质等土壤改良剂，在发酵菌液发挥作用的同时，载体内部的小分子物质随着载体的降解，逐渐释放到土壤中，改善土壤结构以及为作物提供生长物质，因此，有效提高了甜瓜幼苗的株高、茎粗、株鲜重等生长指标。
测试例2
土壤理化性质测定：
(1)装土、施基肥：取连续种植6年甜瓜的冷棚耕层土壤自然风干，过0.2mm网筛后得到试验土样。取相同重量的试验土样分别作为试验组1-6和对照组，每组平行三份。其中试验组1-6中加入实施例1-6制备的解决连作障碍的高效微生物菌剂混合均匀，微生物菌剂的加入量为5％(W/W)；然后分别装入规格相同的塑料花盆中，记为L1、L2、L3、L4、L5、L6，对照组未加入微生物菌剂，标记为CK；
(2)播种、培育：将甜瓜种子(品种为博洋9号)在45℃温水中浸泡2h，每盆播种10粒，温室培养条件设置为温度26℃，湿度55％，自然光照强度为60％，每天光照时间为12h，待长出2片子叶时，进行间苗，每盆留5株长势一致的幼苗；
(3)20天后对盆栽土壤性质进行测定，采集每组甜瓜种植盆中的土壤进行自然风干并过0.25mm孔径筛，得到待测风干土样。
1.土壤中有机质含量：参考DB12/T 961-2020《土壤中有机质含量的测定直接加热法》进行测定。
具体方法：精确称取0.2500g各组实施例中的待测风干土样，放入玻璃消煮管中，加入10.00mL 0.4mol/L重铬酸钾-硫酸溶液，盖上管塞，将消煮管放入多孔炉中，保持管内温度在175℃，加热至管内溶液沸腾并保持5min，然后将消煮管取出，冷却30min，用水将消解液及土壤残渣无损转移至250mL三角瓶中，用水冲洗试管及管塞，洗液合并入三角瓶中，三角瓶内溶液总体积控制在50mL～60mL。加3滴邻菲啰啉指示剂，用0.1mol/L硫酸亚铁标准溶液进行滴定，溶液由橙黄变蓝绿，最后变棕红，即达终点。
2.有效磷含量：根据HJ 704-2014《土壤有效磷的测定碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法》对各组实施例中土壤的有效磷进行测量，测试结果见表2。
表2：土壤理化性质测试结果
Figure BDA0003043167520000131
Figure BDA0003043167520000141
本发明采用氧化硫硫杆菌作为发酵菌液的菌种，该菌种可通过分泌植酸酶、核酸酶、脱氢酶和磷酸酶等物质向胞外释放有机酸(如酒石酸、乙酸、草酸)以酸化连作土壤中的难溶性磷，转化为利于植物吸收的有效磷；因此与空白组相比，采用本发明制备的微生物菌剂有效提高了连作土壤中的有机质和有效磷含量。比较L3和L4-6相比，L3中的有效磷含量明显低于L4-6，这可能是由于L4-6中微生物菌剂的载体在制备过程中吸收了一部分小分子有机质-磷酸镁铵，含有的磷随着载体的降解逐渐释放到土壤中，进而提高了土壤中的有效磷含量。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，由发酵菌液和载体组成。
2.如权利要求1所述解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，所述发酵菌液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取菌种接种于液体种子培养基中，于26℃、150-180rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到108cfu/mL，得到种子液；所述液体种子培养基如下：20-26重量份葡萄糖、15-20重量份硫酸铵、10-14重量份牛肉浸粉、6-9重量份酵母粉、2-4重量份氯化钾、18-25重量份硫酸亚铁、80-90重量份水，pH＝3-3.5，120-125℃灭菌15-25min；
(2)将步骤(1)得到的种子液按8-12％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于26℃、150-180rpm条件下恒温培养，至菌体浓度达到1010cfu/mL，得到发酵菌液；所述发酵培养基如下：45-55重量份糖蜜、14-18重量份麸皮、30-35重量份氯化铵、10-14重量份玉米浆、21-24重量份牛肉浸粉、15-20重量份酵母粉、5-10重量份氯化钠、7-10重量份硫酸镁、10-15重量份磷酸氢二钾、48-57重量份硫酸亚铁、260-285重量份水，pH＝3-3.5，120-125℃灭菌15-25min。
3.如权利要求1所述解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，所述载体为硅藻土、沸石、麦饭石、碳酸钙、碳酸钙微球、功能化碳酸钙微球中任意一种。
4.如权利要求3所述解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，所述载体为碳酸钙微球或功能化碳酸钙微球。
5.如权利要求4所述解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，所述碳酸钙微球的制备方法如下：将1-3重量份羟乙基纤维素加到90-110重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌15-25min，然后继续加入90-110重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌3-8min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球。
6.如权利要求4所述解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将1-3重量份羟乙基纤维素加到90-110重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌15-25min，然后继续加入90-110重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌3-8min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5-6，得到混合液a；将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、功能化碳酸钙微球：将S1得到的全部碳酸钙微球加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌10-20min，结束后以8000rpm离心5-15min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌10-20min，然后加入8-15重量份交联剂，继续搅拌15-30min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
7.如权利要求4所述解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，所述功能化碳酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、碳酸钙微球的制备：将1-3重量份羟乙基纤维素加到90-110重量份0.1mol/L氯化钙水溶液中，在室温下以1200rpm的转速搅拌15-25min，然后继续加入90-110重量份0.1mol/L碳酸钠水溶液，在室温下以1000rpm的转速搅拌3-8min，结束后离心、洗涤、干燥，得到碳酸钙微球；
S2、将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL壳聚糖水溶液混合，并将pH调节至5-6，得到混合液a；将40-60重量份0.5mol/L氯化钾水溶液与40-60重量份2mg/mL明胶水溶液混合，得到混合液b；
S3、将S1得到的全部碳酸钙微球加入40-60重量份混合液c中，置于功率150-250W、频率为30-50kHz的超声波中处理5-15min，得到浑浊液；所述混合液c由2-5mg/mL黄腐酸水溶液和0.1-0.5mg/mL磷酸镁铵水溶液按照质量比1:1组成；
S4、功能化碳酸钙微球：将S3得到的全部浑浊液加入到S2得到的全部混合液a中，在温度35℃下以500rpm搅拌10-20min，结束后以8000rpm离心5-15min，取沉淀加入S2得到的全部混合液b中，并在35℃下以500rpm搅拌10-20min，然后加入8-15重量份交联剂，继续搅拌15-30min，结束后离心、洗涤、干燥，得到功能化碳酸钙微球。
8.如权利要求6或7所述解决连作障碍的高效微生物菌剂，其特征在于，所述交联剂为戊二醛和/或丙二酸。
9.如权利要求1-8任一项所述解决连作障碍的高效微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将发酵菌液和载体按照质量比1:(1-3)混合并以600-1000rpm搅拌20-40min，然后在40-45℃下干燥4-6h，粉碎，过80目筛，即得所述解决连作障碍的高效微生物菌剂。
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