CN109095623A - 一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体及其制备方法 - Google Patents

一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，采用以下方法制备：配置Na2CO3溶液和CaCl2溶液；分别加入聚丙烯酸溶液；在混合溶液A中加入十二烷基硫酸钠溶液，制得混合溶液C，然后将混合溶液B倒入混合溶液C中进行反应生成沉淀；将沉淀过滤并洗涤后真空干燥；将壳聚糖溶液溶解于醋酸溶液中，加入碳酸钙纳米颗粒、食用油、司班‑80后搅拌，再加入京尼平持续搅拌；或者加入戊二醛溶液，搅拌后继续加入硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐继续反应；将沉淀离心分离后并清洗、脱水并晾干后，制得微黄色粉末，即为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体。上述微载体可提高硝化菌的培养密度，提高硝化菌扩大培养的经济性。

Description

一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体及其制备 方法
技术领域
本发明属环境微生物领域，具体涉及制备一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的固定化微载体的制备方法。
背景技术
硝化细菌是一类好氧细菌，能在有氧的水中或砂层中生长，并在氮循环水质净化过程中扮演着重要角色。它们包括形态互异类型的一种杆菌、球菌或螺旋菌。属于自营性细菌的一类，包括两种完全不同代谢群：亚硝酸菌属及硝酸菌属。分别将氨氧化成亚硝酸及将亚硝酸氧化成硝酸。这两类菌能分别从以上氧化过程中获得生长所需要的能量，但其能量利用率不高，故生长较缓慢，其平均代时在20小时以上。污水中的氨或铵盐必需在以上两类细菌的共同作用下才能转变为硝酸盐。硝化细菌通常贴壁生长，通常在观赏鱼养殖及污水处理中使用移动床生物流化床填料及生化毯等提供较大的附着表面积以利于硝化细菌的附着及生长。与传统载体相比，微载体通常具有更大的比表面积及更好的底物扩散效果，早年在动物细胞悬浮培养方面获得了广泛的应用。
发明内容
本发明解决了上述现有技术中的不足，提供了一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，包括酸化致孔的包埋了碳酸钙纳米颗粒的交联壳聚糖微球，上述微载体可提高硝化菌的培养密度，提高硝化菌扩大培养的经济性。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，采用以下方法制备：
(1)、分别配置Na2CO3溶液和CaCl2溶液；
(2)、在Na2CO3溶液中加入聚丙烯酸(PAA)溶液并搅拌，得到混合溶液A，在CaCl2溶液中加入聚丙烯酸溶液并搅拌，得到混合溶液B；
(3)、在混合溶液A中加入十二烷基硫酸钠溶液，制得混合溶液C，混合溶液C中十二烷基硫酸钠的浓度为5～30mM，然后在搅拌条件下将混合溶液B倒入混合溶液C中进行反应，反应体系中CO3 2-离子与Ca2+离子的摩尔比为1：2～2:1，在30～90℃、维持搅拌的条件下进行反应至反应结束，反应结束后生成沉淀；
(4)、将反应产物过滤并洗涤后真空干燥，制得碳酸钙纳米颗粒；
(5)、将壳聚糖溶液溶解于醋酸溶液中，继续加入上步骤中的碳酸钙纳米颗粒、2-5倍体积食用油、司班-80后搅拌，所加入的壳聚糖、碳酸钙纳米颗粒及司班-80的质量比为1～5：0.5～5：0.5～5；
再加入京尼平至其终浓度为5～50mM，持续搅拌；或者加入戊二醛溶液，搅拌后继续加入硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐继续反应，所述碳酸钙纳米颗粒、戊二醛溶液、硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐之间的质量比为0.5～5：0.2～2：0.5～5；
将沉淀离心分离后并清洗，用丙酮脱水并晾干后，制得微黄色粉末，即为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体；
(6)、将上步骤中包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体混悬于水中，逐滴加入至海藻酸钠溶液中，搅拌，离心分离沉淀后清洗，再将沉淀放入质量浓度1～10％盐酸溶液中浸泡处理，处理完毕后离心分离并清洗，离心分离沉淀，最后用丙酮脱水并在室温下晾干，得表面电荷改性的壳聚糖微载体，即为提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体。
步骤(1)中Na2CO3溶液、CaCl2溶液的浓度均为0.1mol/L，且两者的体积相同。
步骤(2)中聚丙烯酸溶液的浓度为0.3～3g/L，所加入的聚丙烯酸溶液与Na2CO3溶液的体积比以及与CaCl2溶液的体积比均为1:8。
步骤(3)中搅拌速度为200r/min，反应时间为1h。
步骤(4)中将反应产物过滤后用去离子水和无水乙醇各洗涤2次后，放入80℃的真空干燥箱中干燥24h。
步骤(5)中壳聚糖-醋酸溶液中醋酸的体积浓度为1％；壳聚糖的浓度为10～50g/L。
步骤(5)中加入京尼平后持续搅拌24小时；或者加入戊二醛溶液后持续搅拌2小时，再加入硼氢化盐/乙酰基硼氢化盐后继续反应2小时。
步骤(5)中硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐具体为硼氢化钠、硼氢化钾、硼氢化锂或乙酰基硼氢化钠。
步骤(6)中将沉淀放入盐酸溶液中浸泡处理15分钟。
本发明利用壳聚糖进行交联及表面电荷改性，制备硝化细菌贴壁生长的微载体。为了提高微载体比表面积，壳聚糖交联时加入预先制备的20～50nm碳酸钙纳米颗粒，交联好的壳聚糖微载体通过酸处理将包埋的碳酸钙纳米颗粒溶解，大大增加了微载体的比表面积。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)壳聚糖交联方式设计恰当，交联反应中未形成西弗碱，结构较为稳定。直接戊二醛一步交联法形成的西弗碱随着微生物生长或因素导致的pH降低会发生降解，从而导致微载体的崩解。本发明中采用京尼平交联，避免了西弗碱的形成；采用的戊二醛交联还原法，西弗碱还原后形成亚胺基团,化学结构较为稳定，从而保证了微载体的稳定性。(2)壳聚糖交联时添加20～50nm碳酸钙纳米颗粒并在微载体形成后盐酸溶解碳酸钙对微载体进行致孔。微载体表面结构丰富，比表面积与一步法微载体制备相比有较大的提升。(3)壳聚糖为表面带有正电荷的聚合物，具有一定的抗菌活性，直接用做微载体可能会影响微生物的生长，本发明通过将O/W体系中形成的交联壳聚糖微球滴加入带负电聚合物海藻酸钠溶液中，在微载体表面通过静电吸附形成一层带负电的壳，消除了壳聚糖对微生物生长的影响。
附图说明
图1为本发明实施例中不同交联壳聚糖微载体负载硝化细菌后对氨氮硝化比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1
本实施例中所制备的微载体具体制备方法如下：配制0.1mol/L的Na2CO3溶液、0.1mol/L的CaCl2溶液各200mL，分别加入0.5g/L的PAA溶液25mL至Na2CO3溶液和CaCl2溶液中，低速搅拌0.5h。将SDS溶液只加入到装有Na2CO3和PAA的混合溶液的烧瓶中，SDS终浓度为10mM。调转速为200r/min，将CaCl2和PAA混合溶液快速倒入此三口烧瓶中，在50℃、转速为200r/min的条件下，保持反应1h。所得的CaCO3产物经过滤，用去离子水和无水乙醇各洗涤2次后，放入80℃的真空干燥箱中干燥24h，得CaCO3纳米颗粒。
2％(W/V)的壳聚糖溶解于1％(V/V)的醋酸溶液共计100mL，加入CaCO3纳米颗粒2g，加入5倍体积食用油，加入2mL司班-80激烈搅拌。加入京尼平至其在水相中终浓度为20mM，持续搅拌24小时，离心分离沉淀，并用丙酮、热水、冷水清洗数次，以除去残留在微球表面的油相及杂质。最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得到微黄色粉末，为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体。
上述黄色粉末混悬于100mL水，逐滴加入1L 1％(W/V)海藻酸钠溶液中，并激烈搅拌。离心分离沉淀，去离子水清洗数次，10％盐酸处理15分钟，离心，去离子水清洗数次，离心分离沉淀，最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得表面电荷改性的壳聚糖微载体。
下面对本实施例中所制得的表面电荷改性的壳聚糖微载体的性能进行验证，首先取亚硝化螺菌属(Nitrosospira multiformis ATCC 25196)及活跃硝化杆菌(Nitrobacteragilis ATCC 14123)混合培养物于改良的203号硝化菌培养基中混合培养。
改良的203号硝化菌培养基配方为：
去离子水将上述培养基定容至1000mL，121℃灭菌21分钟。
将上述菌种培养1个月，至生物量不再显著增长，10％接种至250mL摇瓶，实验组加入微载体每瓶1g，对照组不加微载体。200rpm，30℃培养一个月后取1mL菌液，离心，去离子水洗两次，换入新鲜培养基，混悬30℃孵育2小时，测量氨氮变化量。结果显示使用微载体与未使用微载体相比其2小时硝化速率提高5倍以上。
实施例2
本实施例中所制备的微载体具体制备方法如下：配制0.2mol/L的Na2CO3溶液100mL，0.1mol/L的CaCl2溶液200mL，分别加入1.5g/L的PAA溶液15mL至Na2CO3溶液和CaCl2溶液中，低速搅拌0.5h。将SDS溶液只加入到装有Na2CO3和PAA的混合溶液的烧瓶中，SDS终浓度为20mM。调转速为200r/min，将CaCl2和PAA混合溶液快速倒入此三口烧瓶中，在70℃、转速为200r/min的条件下，保持反应1h。所得的CaCO3产物经过滤，用去离子水和无水乙醇各洗涤2次后，放入80℃的真空干燥箱中干燥24h，得CaCO3纳米颗粒。
3％(W/V)的壳聚糖溶解于1％(V/V)的醋酸溶液共计100mL，加入CaCO3纳米颗粒3g，加入4倍体积食用油，加入3mL司班-80激烈搅拌。加入京尼平至其在水相中终浓度为30mM，持续搅拌24小时，离心分离沉淀，并用丙酮、热水、冷水清洗数次，以除去残留在微球表面的油相及杂质。最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得到微黄色粉末，为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体。
上述黄色粉末混悬于100mL水，逐滴加入至1升1.3％(W/V)海藻酸钠溶液中，并激烈搅拌。离心分离沉淀，去离子水清洗数次，9％盐酸处理17分钟，离心，去离子水清洗数次，离心分离沉淀，最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得表面电荷改性的壳聚糖微载体。
下面对本实施例中所制得的表面电荷改性的壳聚糖微载体的性能进行验证，首先取亚硝化螺菌属(Nitrosospira multiformis ATCC 25196)及活跃硝化杆菌(Nitrobacteragilis ATCC 14123)混合培养物于改良的203号硝化菌培养基中混合培养。
改良的203号硝化菌培养基配方同实施例1。
去离子水将上述培养基定容至1000mL，121℃灭菌21分钟。
将上述菌种培养1个月，至生物量不再显著增长，10％接种至250mL摇瓶，实验组加入微载体每瓶1g，对照组不加微载体。200rpm，30℃培养一个月后取1mL菌液，离心，去离子水洗两次，换入新鲜培养基，混悬30℃孵育2小时，测量氨氮变化量。结果显示如图1京尼平交联组。
实施例3
本实施例中所制备的微载体具体制备方法如下：配制0.1mol/L的Na2CO3溶液、0.1mol/L的CaCl2溶液各200mL，分别加入0.5g/L的PAA溶液25mL至Na2CO3溶液和CaCl2溶液中，低速搅拌0.5h。将SDS溶液只加入到装有Na2CO3和PAA的混合溶液的烧瓶中，SDS终浓度为10mM。调转速为200r/min，将CaCl2和PAA混合溶液快速倒入此三口烧瓶中，在50℃、转速为200r/min的条件下，保持反应1h。所得的CaCO3产物经过滤，用去离子水和无水乙醇各洗涤2次后，放入80℃的真空干燥箱中干燥24h，得CaCO3纳米颗粒。
2％(W/V)的壳聚糖溶解于1％(V/V)的醋酸溶液共计100mL，加入CaCO3纳米颗粒2g，加入5倍体积食用油，加入2mL司班-80激烈搅拌。加入2mL 25％戊二醛，持续搅拌2小时，加入1g硼氢化钠反应2小时离心分离沉淀，并用丙酮、热水、冷水清洗数次，以除去残留在微球表面的油相及杂质。最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得到微黄色粉末，为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体。
上述黄色粉末混悬于100mL水，逐滴加入1L 1％(W/V)海藻酸钠溶液中，并激烈搅拌。离心分离沉淀，去离子水清洗数次，10％盐酸处理15分钟，离心，去离子水清洗数次，离心分离沉淀，最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得表面电荷改性的壳聚糖微载体。
下面对本实施例中所制得的致孔的交联壳聚糖微载体(碳酸钙及碱式碳酸镁混晶微载体)的性能进行验证，首先取亚硝化螺菌属(Nitrosospira multiformis ATCC 25196)及活跃硝化杆菌(Nitrobacter agilis ATCC 14123)混合培养物于改良的203号硝化菌培养基中混合培养。
改良的203号硝化菌培养基配方同实施例1。
将上述菌种培养1个月，至生物量不再显著增长，10％接种至250mL摇瓶，实验组加入微载体每瓶1g，对照组不加微载体。200rpm，30℃培养一个月后取1mL菌液，离心，去离子水洗两次，换入新鲜培养基，混悬30℃孵育2小时，测量氨氮变化量。结果显示如图1戊二醛交联-还原组。
实施例4
本实施例中所制备的微载体具体制备方法如下：配制0.2mol/L的Na2CO3溶液100mL，0.1mol/L的CaCl2溶液200mL，分别加入1.5g/L的PAA溶液15mL至Na2CO3溶液和CaCl2溶液中，低速搅拌0.5h。将SDS溶液只加入到装有Na2CO3和PAA的混合溶液的烧瓶中，SDS终浓度为20mM。调转速为200r/min，将CaCl2和PAA混合溶液快速倒入此三口烧瓶中，在70℃、转速为200r/min的条件下，保持反应1h。所得的CaCO3产物经过滤，用去离子水和无水乙醇各洗涤2次后，放入80℃的真空干燥箱中干燥24h，得CaCO3纳米颗粒。
4％(W/V)的壳聚糖溶解于1％(V/V)的醋酸溶液共计100mL，加入CaCO3纳米颗粒4g，加入4倍体积食用油，加入4mL司班-80激烈搅拌。加入2mL 25％戊二醛，持续搅拌2小时，加入4g乙酰基硼氢化钠反应2小时离心分离沉淀，并用丙酮、热水、冷水清洗数次，以除去残留在微球表面的油相及杂质。最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得到微黄色粉末，为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体。
上述黄色粉末混悬于100mL水，逐滴加入1L 1％(W/V)海藻酸钠溶液中，并激烈搅拌。离心分离沉淀，去离子水清洗数次，5％盐酸处理20分钟，离心，去离子水清洗数次，离心分离沉淀，最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得表面电荷改性的壳聚糖微载体。
下面对本实施例中所制得的致孔的交联壳聚糖微载体的性能进行验证，首先取亚硝化螺菌属(Nitrosospira multiformis ATCC 25196)及活跃硝化杆菌(Nitrobacteragilis ATCC 14123)混合培养物于改良的203号硝化菌培养基中混合培养。
改良的203号硝化菌培养基配方同实施例1。
将上述菌种培养1个月，至生物量不再显著增长，10％接种至250mL摇瓶，实验组加入微载体每瓶1g，对照组不加微载体。200rpm，30℃培养一个月后取1mL菌液，离心，去离子水洗两次，换入新鲜培养基，混悬30℃孵育2小时，测量氨氮变化量。结果显示使用微载体对新鲜培养基中氨基氮的亚硝化及硝化速率是对照组5倍以上。

Claims (9)

1.一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于采用以下方法制备：
(1)、分别配置Na2CO3溶液和CaCl2溶液；
(2)、在Na2CO3溶液中加入聚丙烯酸溶液并搅拌，得到混合溶液A，在CaCl2溶液中加入聚丙烯酸溶液并搅拌，得到混合溶液B；
(3)、在混合溶液A中加入十二烷基硫酸钠溶液，制得混合溶液C，混合溶液C中十二烷基硫酸钠的浓度为5～30mM，然后在搅拌条件下将混合溶液B倒入混合溶液C中进行反应，反应体系中CO3 2-离子与Ca2+离子的摩尔比为1：2～2:1，在30～90℃、维持搅拌的条件下进行反应至反应结束，反应结束后生成沉淀；
(4)、将反应产物过滤并洗涤后真空干燥，制得碳酸钙纳米颗粒；
(5)、将壳聚糖溶液溶解于醋酸溶液中，继续加入上步骤中的碳酸钙纳米颗粒、2-5倍体积食用油、司班-80后搅拌，所加入的壳聚糖、碳酸钙纳米颗粒及司班-80的质量比为1～5：0.5～5：0.5～5；
再加入京尼平至其终浓度为5～50mM，持续搅拌；或者加入戊二醛溶液，搅拌后继续加入硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐继续反应，所述碳酸钙纳米颗粒、戊二醛溶液、硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐之间的质量比为0.5～5：0.2～2：0.5～5；
将沉淀离心分离后并清洗，用丙酮脱水并晾干后，制得微黄色粉末，即为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体；
(6)、将上步骤中包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体混悬于水中，逐滴加入至海藻酸钠溶液中，搅拌，离心分离沉淀后清洗，再将沉淀放入质量浓度1～10％盐酸溶液中浸泡处理，处理完毕后离心分离并清洗，离心分离沉淀，最后用丙酮脱水并在室温下晾干，得表面电荷改性的壳聚糖微载体，即为提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体。
2.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(1)中Na2CO3溶液、CaCl2溶液的浓度均为0.1mol/L，且两者的体积相同。
3.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(2)中聚丙烯酸溶液的浓度为0.3～3g/L，所加入的聚丙烯酸溶液与Na2CO3溶液的体积比以及与CaCl2溶液的体积比均为1:8。
4.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(3)中搅拌速度为200r/min，反应时间为1h。
5.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(4)中将反应产物过滤后用去离子水和无水乙醇各洗涤2次后，放入80℃的真空干燥箱中干燥24h。
6.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(5)中壳聚糖-醋酸溶液中醋酸的体积浓度为1％；壳聚糖的浓度为10～50g/L。
7.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(5)中加入京尼平后持续搅拌24小时；或者加入戊二醛溶液后持续搅拌2小时，再加入硼氢化盐/乙酰基硼氢化盐后继续反应2小时。
8.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(5)中硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐具体为硼氢化钠、硼氢化钾、硼氢化锂或乙酰基硼氢化钠。
9.根据权利要求1所述的提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体，其特征在于：步骤(6)中将沉淀放入盐酸溶液中浸泡处理15分钟。
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