CN103255123B - 菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法 - Google Patents
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Abstract
菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，涉及一种环境生物工程混合菌丝球的方法，包括孢子悬液的制备、菌丝球的制备、光合细菌细胞悬液的制备及吸附法混合菌丝球的制备，得孢子悬液后进行菌丝球制备菌丝球液体培养基，培养菌丝球，成菌丝球后，制备光合细菌细胞悬液，光合细菌的富集培养，配制细菌液体培养基，将光合细菌打散、混匀，进行黑暗好氧培养；光合细菌细胞悬液的制备，将培养液于培养弃去上清液，配得光合细菌细胞悬液；将备用的菌丝球冲洗干净，用NaOH和HCl调节pH，黑暗好氧培养即得混合菌丝球。本发明提高了对有机废水的处理效果，对大规模利用光合细菌处理有机废水具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种环境生物工程混合菌丝球的方法，特别是涉及一种菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法。
背景技术
光合细菌（Photosynthetic bacteria，简称PSB）是一种在污水净化领域具有广阔应用前景的原始光能合成体系微生物。该类微生物具有随环境条件变化而灵活改变代谢类型的特性，可以在厌氧光照和好氧黑暗条件下对废水中有机物进行降解。此外，PSB还具有工艺设备简单、有机负荷高、菌体可回收利用、不造成二次污染等优良特性。基于此，近年来国内外学者对光合细菌进行了广泛应用和深入研究，并对食品加工、印染、焦化、养殖、制药等多种行业高浓度有机废水作了成功处理。
然而，光合细菌的细胞个体普遍十分微小，其中球状细菌的直径为0.3～0.6 μm，杆状为0.5～1.0μm×0.9～2.0μm。因此，直接利用游离态的光合细菌处理废水存在诸多不足，包括菌体细胞易被水中原生动物所吞噬，自然沉降困难，在有限的时间内固液分离效果不理想，菌体不易回收重复利用等问题，从而一方面造成了光合细菌细胞的流失，使得废水处理过程中需要不断添加新鲜菌体；另一方面导致处理后的废水携带有大量细胞，使出水具有一定色度，COD和BOD偏高，无法达到直接排放标准。光合细菌存在的这些问题，严重制约了其在有机废水处理过程中的推广应用。
要解决此类问题，可以考虑采用一定的物理或化学手段，如利用载体材料、包埋物质等，使光合细菌细胞通过人为作用将其限制在有限的空间区域中，同时保持细菌的生物活性，达到反复利用的目的，这就是固定化微生物技术。常见的固定化载体和包埋材料为聚乙烯醇、海藻酸钠、琼脂、明胶等。然而，利用这些化学载体固定化光合细菌常会出现抑制细胞的生物活性，降低体系的传质速率等问题，从而在一定程度上影响了其对有机废水的处理能力。因此，开发廉价、高效的新型载体成为固定化光合细菌发展的必然趋势。
菌丝球是由霉菌或放线菌在培养过程中自动聚集形成的具有一定机械强度和大小的球状颗粒物，它们是由菌丝缠绕而成，易于吸附其他颗粒物质。菌丝球具有诸多优点：(1) 具有一定的亲疏水平衡值，有利于细菌的附着；(2) 沉降性能良好，易于固液分离；(3) 菌丝球表面有很多空隙，传质扩散阻力小；(4) 成球和生长条件宽泛，生产成本低廉；(5) 具有一定的机械强度，能够抵抗较大的水流剪切力。菌丝球的这些优点也是作为菌体细胞附着生长的载体所应具备的特点，即具有一定的机械强度、优越的物理形状和传质性能，以及无毒性。
因此，可以利用菌丝球的吸附作用，将具有特殊降解功能的光合细菌固定在霉菌菌丝形成的纯生物质载体上，构建“混合菌丝球”。这样形成的“混合菌丝球”有望对有机废水具有高效的处理能力，将是今后废水处理领域研究的热点。而与此有关的研究国内外却尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，该方法提高了游离光合细菌处理有机废水时出水的水质，并利用化学载体固定时不抑制光合细菌的细胞生物活性，提高了体系的传质速率，在保证光合细菌生长活性的前提下，提高了对有机废水的处理效果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述方法包括孢子悬液的制备、菌丝球的制备、光合细菌细胞悬液的制备及吸附法混合菌丝球的制备，所述孢子悬液的制备是在生长的霉菌孢子使孢子脱落并悬浮于生理盐水中，置空气浴振荡器中震荡，使孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液；菌丝球制备，首先配制菌丝球液体培养基，取葡萄糖，KH2PO4，MgSO4·7H2O加入无菌去离子水中，用NaOH和HCl调节pH，搅拌均匀，即为菌丝球液体培养基；培养菌丝球，取培养基灭菌，配制、培养基含霉菌孢子振荡培养，成菌丝球后，保存在无菌生理盐水中备用；制备光合细菌细胞悬液，配制光合细菌液体培养基取葡萄糖，酵母膏、尿素、2SO4、蛋白胨，KH2PO4，K2HPO4，CaSO4，MgSO4·7H2O加入蒸馏水中，NaOH和HCl调节pH，搅拌均匀，即为光合细菌液体培养基；光合细菌的富集培养，配制细菌液体培养基，将光合细菌打散、混匀，进行黑暗好氧培养，培养后取出备用；光合细菌细胞悬液的制备，将培养液于培养弃去上清液，收集菌体，将菌体重新悬浮于无菌生理盐水中，配得光合细菌细胞悬液；吸附法制备混合菌丝球，将备用的菌丝球冲洗干净，装光合细菌细胞悬液的锥形瓶中，用NaOH和HCl调节pH，黑暗好氧培养即获得霉菌与光合细菌所形成的混合菌丝球。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述孢子悬液的制备：在无菌操作台上，用接种环轻刮斜面固体培养基上生长的霉菌孢子，使孢子脱落，用10毫升无菌生理盐水反复冲洗固体斜面，直至孢子悬浮于生理盐水中，用移液管将冲洗后的含有霉菌孢子的生理盐水移至100毫升锥形瓶中，添加无菌去离子水，使每毫升去离子水中含有孢子约108个，然后置于空气浴振荡器中震荡1小时，使孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述菌丝球的制备：配制菌丝球液体培养基，称取葡萄糖0.1~20克，蛋白胨0.1~20克，KH2PO4 0.1~10克，MgSO4·7H2O 0.01~10克加入到1000毫升无菌去离子水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 5.0~10.0，搅拌均匀，即为菌丝球液体培养基。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述菌丝球的制备：培养菌丝球，取100毫升菌丝球液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度为115 ℃或121 ℃，灭菌时间为30分钟，在无菌操作台上，用无菌移液管移取孢子悬液于灭菌冷却后的锥形瓶中，配制成每毫升液体培养基含霉菌孢子浓度约103~106个，将锥形瓶用无菌纱布封口后置于空气浴振荡器中进行振荡培养，其中振荡器转速为100~200 转/分钟，培养温度为20~35℃，培养2~5天待形成大小均匀且较为密实的菌丝球后，取出过滤，收集菌丝球，保存在无菌生理盐水中备用。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述葡萄糖为蔗糖，可溶性淀粉；蛋白胨为牛肉膏、酵母膏，马铃薯，NaNO3、尿素。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述光合细菌细胞悬液的制备：配制光合细菌液体培养基，称取葡萄糖0.1~10克，酵母膏0.1~20克，KH2PO4 0.1~10克，K2HPO4 0.1~5克，CaSO4 0.1~5克，MgSO4·7H2O 0.01~10克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 5.0~10.0，搅拌均匀，即为光合细菌液体培养基。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述葡萄糖为丙酸钠、乙酸钠、可溶性淀粉，酵母膏为牛肉膏，NaNO3、尿素、（NH4）2SO4、蛋白胨。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述光合细菌细胞悬液的制备：光合细菌的富集培养，配制100毫升光合细菌液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度为115 ℃或121 ℃，灭菌时间为30分钟，取出锥形瓶冷却至室温。用接种环移取1~5环固体培养基中保存的光合细菌至锥形瓶内，用无菌玻璃球将光合细菌打散、混匀，取出玻璃球，用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中进行黑暗好氧培养，其中振荡器转速为60~200 转/分钟，培养温度为10~60 ℃；培养2~5天后取出备用，即得光合细菌富集培养液。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述光合细菌细胞悬液的制备：将光合细菌富集培养液于培养温度为4℃，振荡器转速为6 000转/分钟的条件下高速离心10分钟，弃去上清液，收集菌体，将菌体细胞重新悬浮于无菌生理盐水中，使每毫升生理盐水含有光合细菌细胞约103~108个，即配得光合细菌细胞悬液。
所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述吸附法制备混合菌丝球：用无菌生理盐水将备用的菌丝球冲洗干净，然后按照1~30%的体积比加入装有100毫升光合细菌细胞悬液的锥形瓶中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 5.0~10.0，用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中黑暗好氧培养18~48 小时，培养温度为10~60℃，振荡器转速为60~200转/分钟，即获得霉菌与光合细菌所形成的混合菌丝球。
本发明的优点与效果是：
本发明以霉菌形成的菌丝球为生物质载体，通过菌丝球的吸附作用将光合细菌固定在菌丝球表面及内部孔隙中，形成“混合菌丝球”，从而达到固定化光合细菌的目的，克服了投加光合细菌游离细胞处理有机废水所存在的一系列问题。本发明以光合细菌的吸附率作为考察指标，表明霉菌所形成的菌丝球对光合细菌细胞显示出良好的吸附效果，且形成的“混合菌丝球”具有较好的沉降性能和机械强度。本发明在保证光合细菌生长活性的前提下，减少了光合细菌的菌体流失。相比其他包埋材料而言，提高了对有机废水的处理效果。此外，通过霉菌的吸附作用固定化光合细菌构建“混合菌丝球”的方法还具有操作简便、培养成本低、培养时间短、可重复使用等优点，对大规模利用光合细菌处理有机废水具有重要意义。
附图说明
图1为培养得到的“单一菌丝球”外观显微镜图；
图2为培养得到的“混合菌丝球”外观显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明所涉及的光合细菌是一株可降解邻氯苯酚的沼泽红假单胞菌PSB-1D（Rhodopseudomonas palustris PSB-1D），16SrDNA序列为GenBank Accession No. HM068966。该菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库均有保存。
本发明所涉及的霉菌为一株命名为DH-1的青霉菌(Penicillium sp.)。
本发明采用HZQ-C型空气浴震荡器作为微生物培养设备。
本发明的高压蒸汽灭菌采用LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器。
本发明采用的无菌水为经过高压蒸汽灭菌锅处理的去离子水，处理条件为温度121 ℃，压力0.105Mpa的条件下维持30分钟。
实施例1：
一、孢子悬液的制备
在无菌操作台上，用接种环轻刮斜面固体培养基上生长的青霉菌DH-1孢子，使孢子脱落。用10 mL无菌生理盐水反复冲洗固体斜面，直至孢子悬浮于生理盐水中。用移液管将冲洗后含有青霉菌DH-1孢子的生理盐水移至100毫升锥形瓶中，添加无菌去离子水，使每毫升去离子水中含有孢子约108个。然后置于空气浴振荡器中震荡1 小时，使孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液。
二、菌丝球的制备
1. 配制菌丝球液体培养基
称取葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2PO4 1克，MgSO4·7H2O 0.5克加入到1000毫升无菌去离子水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 7.0，搅拌均匀。即为菌丝球液体培养基。
2. 培养菌丝球
取100毫升菌丝球液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，其中，灭菌温度为115℃，灭菌实践为30分钟。在无菌操作台上，用无菌移液管移取孢子悬液于灭菌冷却后的锥形瓶中，配制成每毫升液体培养基含霉菌DH-1孢子浓度约106个。将锥形瓶用无菌纱布封口后置于空气浴振荡器中进行振荡培养，振荡器转速为130 转/分钟，培养温度为30℃。培养3天待形成大小均匀且较为密实的菌丝球后，取出过滤，收集菌丝球，保存在无菌生理盐水中备用。
三、光合细菌细胞悬液的制备
1. 配制光合细菌液体培养基
称取葡萄糖2克，酵母膏0.2克，KH2PO4 0.6克，K2HPO4 0.4克，CaSO4 0.2克，MgSO4·7H2O 0.3克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 7.0，搅拌均匀，即为光合细菌液体培养基。
2. 光合细菌的富集培养
配制100毫升光合细菌液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，其中，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30分钟。取出锥形瓶冷却至室温。用接种环移取3环固体培养基中保存的光合细菌PSB-1D至锥形瓶内，用无菌玻璃球将光合细菌打散、混匀。取出玻璃球，用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中进行黑暗好氧培养，培养温度为30℃，摇床转速为150转/分钟。培养4天后取出备用，即得光合细菌PSB-1D富集培养液。
3. 光合细菌细胞悬液的制备
将光合细菌PSB-1D富集培养液于培养温度4℃，转速6 000转/分钟的条件下高速离心10分钟，弃去上清液，收集菌体。将菌体细胞重新悬浮于无菌生理盐水中，使每毫升生理盐水含有PSB-1D细胞约106个，即配得光合细菌细胞悬液。
四、吸附法制备“混合菌丝球”
用无菌生理盐水将备用的菌丝球冲洗干净，然后按照10%的体积比加入装有100毫升光合细菌细胞悬液的锥形瓶中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 7.0。用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中黑暗好氧培养24 h，培养温度为30℃，振荡器转速为130转/分钟，即获得霉菌与光合细菌所形成的“混合菌丝球”。
对“混合菌丝球”采用“颜色浸润法”测其传质性能，与海藻酸钠固定化细胞PSB-1D制得的颗粒进行比较。结果表明，本实施方式制得的“混合菌丝球”其传质性能好于海藻酸钠固定化颗粒的传质性能。
通过测量吸附反应前后光合细菌细胞悬液吸光度OD490，计算菌丝球对光合细菌PSB-1D的吸附率E：
本实施方式下青霉菌DH-1对光合细菌PSB-1D的吸附率为91.3%。
本实施方式下制得的“混合菌丝球”降解邻氯苯酚，培养4天降解率为67.6%，而海藻酸钠固定化细胞PSB-1D培养4天对邻氯苯酚的降解率为55.7%。“混合菌丝球”固定化处理效果明显好于海藻酸钠。
实施例2：
一、孢子悬液的制备
在无菌操作台上，用接种环轻刮斜面固体培养基上生长的霉菌DH-1孢子，使孢子脱落。用10毫升无菌生理盐水反复冲洗固体斜面，直至孢子悬浮于生理盐水中。用移液管将冲洗后含有DH-1孢子的生理盐水移至100毫升锥形瓶中，添加无菌去离子水，使每毫升去离子水中含有孢子约108个。然后置于空气浴振荡器中震荡1小时，使孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液。
二、菌丝球的制备
1. 配制菌丝球液体培养基
称取可溶性淀粉5克，酵母膏0.5克，KH2PO4 0.5克，MgSO4·7H2O 1克加入到1000毫升无菌去离子水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 7.5，搅拌均匀，即为菌丝球液体培养基。
2. 培养菌丝球
取100毫升菌丝球液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，其中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30分钟。在无菌操作台上，用无菌移液管移取孢子悬液于灭菌冷却后的锥形瓶中，配制成每毫升液体培养基含霉菌DH-1孢子浓度约105个。将锥形瓶用无菌纱布封口后置于空气浴振荡器中进行振荡培养，振荡器转速为130 转/分钟，培养温度为30℃。培养4天待形成大小均匀且较为密实的菌丝球后，取出过滤，收集菌丝球，保存在无菌生理盐水中备用。
三、光合细菌细胞悬液的制备
1. 配制光合细菌液体培养基
称取乙酸钠2克，（NH4）2SO4、0.5克，KH2PO4 0.5克，K2HPO4 0.5克，CaSO4 0.3克，MgSO4·7H2O 0.5克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 7.5，搅拌均匀，即为光合细菌液体培养基。
2. 光合细菌的富集培养
配制100毫升光合细菌液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，其中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30分钟。取出锥形瓶冷却至室温。用接种环移取4环固体培养基保存的光合细菌PSB-1D至锥形瓶内，用无菌玻璃球将光合细菌打散、混匀。取出玻璃球，用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中进行黑暗好氧培养，培养温度为25℃，摇床转速为130转/分钟。培养5天后取出备用，即得光合细菌PSB-1D富集培养液。
3. 光合细菌细胞悬液的制备
将光合细菌PSB-1D富集培养液于培养温度为4℃，振荡器转速为6 000转/分钟的条件下高速离心10分钟，弃去上清液，收集菌体。将菌体细胞重新悬浮于无菌生理盐水中，使每毫升生理盐水含有PSB-1D细胞约107个，即配得光合细菌细胞悬液。
四、吸附法制备“混合菌丝球”
用无菌生理盐水将备用的菌丝球冲洗干净，然后按照15%的体积比加入装有100毫升光合细菌细胞悬液的锥形瓶中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 8.0。用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中黑暗好氧培养36 小时，培养温度为30℃，摇床转速为150转/分钟，即获得霉菌与光合细菌所形成的“混合菌丝球”。
该实施方式制得的“混合菌丝球”其传质性能好于海藻酸钠固定化细胞PSB-1D制得的颗粒。
通过测量吸附反应前后光合细菌细胞悬液吸光度OD490，计算菌丝球对光合细菌PSB-1D的吸附率E：
本实施方式下青霉菌DH-1对光合细菌PSB-1D的吸附率为92.4%。
本实施方式下制得的“混合菌丝球”降解邻氯苯酚，培养4天降解率为68.9%，而海藻酸钠固定化细胞PSB-1D培养4天对邻氯苯酚的降解率为55.7%。“混合菌丝球”固定化处理效果明显好于海藻酸钠。
实施例3：
一、孢子悬液的制备
在无菌操作台上，用接种环轻刮斜面固体培养基上生长的青霉菌DH-1孢子，使孢子脱落。用10毫升无菌生理盐水反复冲洗固体斜面，直至孢子悬浮于生理盐水中。用移液管将冲洗后含有DH-1孢子的生理盐水移至100毫升锥形瓶中，添加无菌去离子水，使每毫升去离子水中含有孢子约108个。然后置于空气浴振荡器中震荡1小时，使孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液。
二、菌丝球的制备
1. 配制菌丝球液体培养基
称取蔗糖8克，牛肉膏1克，KH2PO4 0.3克，MgSO4·7H2O 0.5克加入到1000毫升无菌去离子水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 8.0，搅拌均匀。即为菌丝球液体培养基。
2. 培养菌丝球
取100毫升菌丝球液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，其中，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30分钟。在无菌操作台上，用无菌移液管移取孢子悬液于灭菌冷却后的锥形瓶中，配制成每毫升液体培养基含霉菌DH-1孢子浓度约106个。将锥形瓶用无菌纱布封口后置于空气浴振荡器中进行振荡培养，振荡器转速为180 转/分钟，培养温度为35℃。培养4天待形成大小均匀且较为密实的菌丝球后，取出过滤，收集菌丝球，保存在无菌生理盐水中备用。
三、光合细菌细胞悬液的制备
1. 配制光合细菌液体培养基
称取可溶性淀粉5克，酵母膏5克，KH2PO4 0.5克，K2HPO4 0.5克，CaSO4 0.5克，MgSO4·7H2O 0.3克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 8.0，搅拌均匀，即为光合细菌液体培养基。
2. 光合细菌的富集培养
配制100毫升光合细菌液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，其中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30分钟。取出锥形瓶冷却至室温。用接种环移取3环固体培养基保存的光合细菌PSB-1D至锥形瓶内，用无菌玻璃球将光合细菌打散、混匀。取出玻璃球，用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中进行黑暗好氧培养，培养温度为35℃，摇床转速为160转/分钟。培养4天后取出备用，即得光合细菌PSB-1D富集培养液。
3. 光合细菌细胞悬液的制备
将光合细菌PSB-1D富集培养液于培养温度为4℃，振荡器转速为6 000转/分钟的条件下高速离心10分钟，弃去上清液，收集菌体。将菌体细胞重新悬浮于无菌生理盐水中，使每毫升生理盐水含有PSB-1D细胞约106个，即配得光合细菌细胞悬液。
四、吸附法制备“混合菌丝球”
用无菌生理盐水将备用的菌丝球冲洗干净，然后按照5%的体积比加入装有100毫升光合细菌细胞悬液的锥形瓶中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 9.0。用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中黑暗好氧培养24小时，培养温度为30℃，摇床转速为140转/分钟，即获得霉菌与光合细菌所形成的“混合菌丝球”。
该实施方式制得的“混合菌丝球”其传质性能好于海藻酸钠固定化细胞PSB-1D制得的颗粒。
通过测量吸附反应前后光合细菌细胞悬液吸光度OD490，计算菌丝球对光合细菌PSB-1D的吸附率E：
本实施方式下青霉菌DH-1对光合细菌PSB-1D的吸附率为89.5%。
本实施方式下制得的“混合菌丝球”降解邻氯苯酚，培养4天降解率为64.1%，而海藻酸钠固定化细胞PSB-1D培养4天对邻氯苯酚的降解率为55.7%。“混合菌丝球”固定化处理效果明显好于海藻酸钠。
Claims (4)
1.菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，所述方法包括孢子悬液的制备、菌丝球的制备、光合细菌细胞悬液的制备及吸附法混合菌丝球的制备，其特征在于，所述孢子悬液的制备是在生长的霉菌孢子使孢子脱落并悬浮于生理盐水中，置空气浴振荡器中震荡，使孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液；菌丝球制备，首先配置菌丝球液体培养基，取葡萄糖，KH2PO4，MgSO4·7H2O加入无菌去离子水中，用NaOH和HCl调节pH，搅拌均匀，即为菌丝球液体培养基；培养菌丝球，取培养基灭菌，配置、培养基含霉菌孢子振荡培养，成菌丝球后，保存在无菌生理盐水中备用；制备光合细菌细胞悬液，配置光合细菌液体培养基取葡萄糖，酵母膏、尿素、（NH4）2SO4、蛋白胨，KH2PO4、K2HPO4、CaSO4，MgSO4·7H2O加入蒸馏水中，NaOH和HCl调节pH，搅拌均匀，即为光合细菌液体培养基；光合细菌的富集培养，配置细菌液体培养基，将光合细菌打散、混匀，进行黑暗好氧培养，培养后取出备用；光合细菌细胞悬液的制备，将培养液于培养弃去上清液，收集菌体，将菌体重心悬浮于无菌生理盐水中，配得光合细菌细胞悬液；吸附法制备混合菌丝球，将备用的菌丝球冲洗干净，装光合细菌细胞悬液的锥形瓶中，用NaOH和HCl调节pH，黑暗好氧培养即获得霉菌与光合细菌所形成混合菌丝球；
所述菌丝球的制备：配制菌丝球体培养基，称取葡萄糖0.1-20克，蛋白胨0.1-20克，KH2PO4 0.1-10克，MgSO4·7H2O 0.01-10克加入到1000毫升无菌去离子水中，用质量分数为10%的NaOH和10%HCl调节pH5.0-10.0，搅拌均匀，即为菌丝球液体培养基；
所述菌丝球的制备，培养菌丝球，取100毫升菌丝球液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度为115℃或121℃，灭菌时间为30分钟，在无菌操作台上，用无菌移液管移取孢子悬液于灭菌冷却后的锥形瓶中，配制成每毫升液体培养基含霉菌孢子浓度约103-106个，将锥形瓶用无菌纱布封口后置于空气浴振荡器中进行振荡培养，其中振荡器转速为100-200转/分钟，培养温度为20-35℃，培养2-5天待形成大小均匀且较为密实的菌丝球后，取出过滤，手收集菌丝球，保存在无菌生理盐水中备用；
所述光合细菌细胞悬液的制备：配制光合细菌液体培养基，称取葡萄糖0.1-10克，酵母膏0.1-20克，KH2PO4 0.1-10克，K2HPO4 0.1-5克，CaSO4 0.1-5克，MgSO4·7H2O 0.01-10克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%HCl调节pH5.0-10.0，搅拌均匀，即为光合细菌液体培养基；
所述光合细菌细胞悬液的制备：光合细菌的富集培养，配置100毫升光合细菌液体培养基，倒入250毫升锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度为115℃或121℃，灭菌时间为30分钟，取出锥形瓶冷却至室温；用接种环移取1-5环固体培养基中保存的光合细菌至锥形瓶内，用无菌玻璃球将光合细菌打散、混匀，取出玻璃球用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中进行黑暗好氧培养，其中振荡器转速为60-200转/分钟，培养温度为10-60℃；培养2-5天后取出备用，即得光合细菌富集培养夜；
所述光合细菌细胞悬液的制备：将光合细菌腹肌培养液于培养温度为4℃，振荡器转速为6000转/分钟的条件下高速离心10分钟，弃去上清液，收集菌体，将菌体细胞重新悬浮于无菌生理盐水中，使每毫升生理盐水含有光合细菌细胞约103-108个，即配得光合细菌细胞悬液；
所述吸附法制备混合菌丝球：用无菌生理盐水将备用的菌丝球冲洗干净，然后按照1-30%的体积比加入装有100毫升光合细菌细胞悬液的锥形瓶中，用质量分数为10%的NaOH和10%HCl调节pH5.0-10.0，用黑布将锥形瓶周围包好，置于空气浴振荡器中黑暗好氧培养18-48小时，培养温度为10-60℃，振荡器转速为60-200转/分钟，即获得霉菌与光合细菌所形成的混合菌丝球。
2.根据权利要求1所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，其特征在于，所述袍子悬液的制备，在无菌操作台上，用接种环轻刮斜面固体培养基上声场的霉菌孢子，使孢子脱落，用10毫升无菌生理盐水反复冲洗固体斜面，直至孢子悬浮于生理盐水中，用移液管将冲洗后的含有霉菌孢子的生理盐水移至100毫升锥形瓶中添加无菌去离子水，使每毫升去离子水中含有孢子约108个，然后置于空气浴振荡器中震荡1小时，使孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液。
3.根据权利要求1所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，其特征在于，所述菌丝球的制备：所述葡萄糖为蔗糖，可溶性淀粉；蛋白胨为牛肉膏、酵母膏，马铃薯，NaNO3、尿素。
4.根据权利要求1所述的菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法，其特征在于，所述光合细菌细胞悬液的制备：所述葡萄糖为丙酸钠、乙酸钠、可溶性淀粉，酵母膏为牛肉膏，NaNO3、尿素、（NH4）2SO4、蛋白胨。
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