CN102703413B

CN102703413B - 一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法

Info

Publication number: CN102703413B
Application number: CN 201210189557
Authority: CN
Inventors: 董怡华; 冯治宇; 林静雯; 张玉革; 高丹
Original assignee: Shenyang University
Current assignee: Shenyang University
Priority date: 2012-06-11
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2032-06-11
Also published as: CN102703413A

Abstract

一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法，涉及环境生物工程，该方法包括为配制富集培养基；得光合细菌种子液；得孢子悬液；1～5的比例同时接种体积分数为1~25%的孢子悬液和体积分数为1~25%的光合细菌种子液，然后将锥形瓶置于温度15~40℃、转速60~200转/分钟的空气浴振荡器中培养2~7天，即获得青霉菌与光合细菌形成的混合菌丝球。由此达到通过青霉菌的自絮凝作用来固定光合细菌的目的。且具有良好的沉降性能和机械强度。此外，通过青霉菌的自絮凝作用来固定化光合细菌还具有操作简便、培养成本低、培养时间短、可重复使用等优点，对光合细菌的大规模有机废水处理应用具有重要意义。

Description

一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法

技术领域

本发明涉及环境生物工程，特别是涉及一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法。

背景技术

光合细菌（Photosynthetic bacteria，简称PSB）是具有原始光能合成体系的原核生物的总称，广泛分布于海洋、湖泊、土壤、水田等自然环境中。光合细菌不仅能在厌氧光照条件下以低级脂肪酸、多种二羧酸、醇类、糖类、芳香族化合物等低分子有机物作为光合作用的电子供体进行光能异养生长，而且能在黑暗有氧条件下以上述有机物为呼吸基质进行好氧异养生长。这种随生长条件变化而灵活地改变代谢类型的特性，决定了此类微生物是当今世界上最具发展前景的净化环境的生物制剂。

基于此，近年来国内外学者对光合细菌进行了广泛的应用和深入的研究，并对食品加工、石油加工、印染、农药制造、皮革加工等多种行业高浓度有机废水作了成功的处理。然而，尽管采用光合细菌法处理有机废水具有工艺设备简单、有机负荷高、耗能少、菌体可综合利用、无二次污染等许多优点，但也有其不足之处：光合细菌细胞普遍十分微小(细胞长0.5～1.0 μm)，大部分悬浮在废水中，易被水中原生动物捕食，自然沉降困难，在有限的时间内固液分离效果不理想，从而一方面造成了光合细菌菌体的流失，使得废水处理过程中需要不断添加新鲜菌体；另一方面导致处理后的废水带有大量菌体细胞，使出水具有一定色度，COD和BOD偏高，无法达到直接排放标准。光合细菌存在的这些问题，严重影响了其在实际有机废水处理过程中的推广应用。要解决此类问题，可以考虑采用一定的物理或化学手段使光合细菌细胞通过人为作用将其限制在有限的空间中，同时保持细菌的生物活性，这就是固定化微生物技术。常见的固定化载体和包埋材料为聚乙烯醇、海藻酸钠、琼脂、明胶等。然而，将光合细菌固定在这些化学载体中常会抑制细胞的生物活性，降低体系的物质传递速率，这些问题在一定程度上影响了光合细菌对有机废水的处理能力。于是，开发廉价、高效的新型载体就成为了固定化微生物技术发展的必然趋势。随着微生物在废水处理中的应用，人们发现某些微生物(主要是霉菌和放线菌)在液体培养过程中能自动聚集形成一定大小的球状颗粒物，这些颗粒物即为菌丝球，它们是由菌丝缠绕而成，易于吸附其他颗粒物质。菌丝球具有诸多优点：(1) 具有一定的亲疏水平衡值，有利于细菌的附着；(2) 沉降性能良好，易于固液分离；(3) 菌丝球表面有很多空隙，传质扩散阻力小；(4) 成球和生长条件宽泛，生产成本低廉；(5) 具有一定的机械强度，能够抵抗较大的水流剪切力。菌丝球的这些优点也是作为菌体细胞附着生长的载体所应具备的特点，即一定的机械强度、优越的物理形状和无毒性。因此，通过生物发酵手段，将菌丝球作为载体，与游离的、对有机废水具有特殊降解能力的光合细菌共同培养形成“混合菌丝球”，对于处理有机工业废水具有潜在的应用前景。然而与此有关的研究国内外却尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法，该方法解决了光合细菌直接处理有机废水时出水水质差，并克服了光合细菌固定在海藻酸钠、琼脂、明胶等传统载体中常会出现细胞的生物活性受到抑制、体系的物质传递速率较低等现象。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法，该方法包括如下具体步骤：

（1）将葡萄糖0.1~20克，蛋白胨0.1~20克，KH2PO4 0.1~10克，MgSO4·7H2O 0.01~10克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 5.0~10.0，搅拌均匀，即为富集培养基；

（2）配制100毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌115℃，30分钟，取出锥形瓶冷却至室温，用接种环移取2环实验室冰箱保存的光合细菌至锥形瓶内，用无菌玻璃球将光合细菌打散、混匀，取出玻璃球，用黑布将锥形瓶周围包好，将锥形瓶置于空气浴振荡器中进行好氧黑暗培养，培养3天后备用，即得光合细菌种子液；

（3）用无菌水冲洗长有青霉菌孢子的斜面固体培养基的表面，并用接种环轻刮斜面，将冲洗后的含有青霉菌孢子的悬浮液用移液管移至锥形瓶中，添加无菌水使得每毫升悬浮液中含有青霉菌孢子约106个，然后轻轻摇晃锥形瓶，使其中的孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液；

（4）配制50~100毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌115℃，30分钟，在冷却后的锥形瓶中按1：1～5的比例同时接种体积分数为1~25%的孢子悬液和体积分数为1~25%的光合细菌种子液，然后将锥形瓶置于温度15~40℃、转速60~200转/分钟的空气浴振荡器中培养2~7天，即获得青霉菌与光合细菌形成的混合菌丝球。

所述的一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法，所述葡萄糖为蔗糖，可溶性淀粉，乙酸钠，蛋白胨为酵母膏，马铃薯，NaNO3。

所述的一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法，所述培养温度控制在-10~60℃、空气浴振荡器转速控制在100~200 转/分钟。

由此达到通过青霉菌的自絮凝作用来固定光合细菌的目的。

本发明的优点与效果是：

本发明以青霉菌形成的菌丝球为生物质载体，通过光合细菌与青霉菌的混合培养使光合细菌吸附在菌丝球表面及内部孔隙中，获得“混合菌丝球”，达到使光合细菌固定化的目的，克服了单独投加光合细菌处理有机废水所存在的一系列问题。研究表明，青霉菌在形成菌丝球的同时对光合细菌细胞显示出良好的吸附作用，形成的“混合菌丝球”的传质性能高于海藻酸盐、琼脂等常规固定化材料，且具有良好的沉降性能和机械强度。此外，通过青霉菌的自絮凝作用来固定化光合细菌还具有操作简便、培养成本低、培养时间短、可重复使用等优点，对光合细菌的大规模有机废水处理应用具有重要意义。

附图说明

图1为“混合菌丝球”外观显微镜照片图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

本发明所提供的光合细菌是一株可降解2-氯苯酚的沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris），16SrDNA序列为GenBank Accession No. HM068966。该菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。

本发明所提供的能形成菌丝球的微生物为一株命名为DH-1的青霉菌(Penicillium)。

本发明采用HZQ-C型空气浴震荡器作为微生物培养设备。

本发明的高压蒸汽灭菌采用LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器。

本发明采用的无菌水为用电热压力蒸汽灭菌器处理的去离子水，处理条件为在温度121℃，压力0.105Mpa维持20~30min。

实施例1：

(1) 培养基的配制：

将葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2PO4 1克，MgSO4·7H2O 0.5克加入到1000毫升蒸馏水中，pH自然，搅拌均匀，即为富集培养基。

(2) 光合细菌的富集培养：

配制100毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌(115℃，30分钟)。取出锥形瓶冷却至室温。用接种环移取2环实验室冰箱保存的光合细菌至锥形瓶内，用无菌玻璃棒将光合细菌打散、混匀。用黑布将锥形瓶周围包好。将锥形瓶置于空气浴振荡器中进行好氧黑暗培养。培养3天后备用，即得光合细菌种子液。其中，培养温度控制在30℃、空气浴振荡器转速控制在130 转/分钟。

(3) 制备孢子悬液：

用无菌的蒸馏水冲洗长有青霉菌孢子的斜面固体培养基的表面，并用接种环轻刮斜面。将冲洗后的含有青霉菌孢子的蒸馏水用移液管移至锥形瓶中，添加无菌水使得每毫升悬浮液中含有青霉菌孢子约106个，然后轻轻摇晃锥形瓶，使其中的孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液。

(4) 同时接种：

配制80毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌(115℃，30分钟)。在冷却后的锥形瓶中按1：1的比例同时接种体积分数为10%的孢子悬液和体积分数为10%的光合细菌种子液。然后将锥形瓶置于温度30℃、转速130转/分钟的空气浴振荡器中培养2天，即获得此条件下青霉菌与光合细菌形成的“混合菌丝球”。

对“混合菌丝球”采用“颜色浸润法”测其传质性能，结果表明菌丝球的传质性能好于海藻酸钠固定化细胞PSB-1D形成的颗粒的传质性能。

“混合菌丝球”降解2-氯苯酚，降解率为62.1%，好于海藻酸钠固定化细胞PSB-1D降解2-氯苯酚的效果(55.7%)。

实施例2：

(1) 培养基的配制：

将蔗糖5克，尿素2克，KH2PO4 2克，MgSO4·7H2O 1克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 8.0，搅拌均匀，即为富集培养基。

(2) 光合细菌的富集培养：

配制100毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌(115℃，30分钟)。取出锥形瓶冷却至室温。用接种环移取2环实验室冰箱保存的光合细菌至锥形瓶内，用无菌玻璃棒将光合细菌打散、混匀。用黑布将锥形瓶周围包好。将锥形瓶置于空气浴振荡器中进行好氧黑暗培养。培养3天后备用，即得光合细菌种子液。其中，培养温度控制在25℃、空气浴振荡器转速控制在150 转/分钟。

(3) 制备孢子悬液：

(4) 同时接种：

配制70毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌(115℃，30分钟)。在冷却后的锥形瓶中按1：2的比例同时接种体积分数为10%的孢子悬液和体积分数为20%的光合细菌种子液。然后将锥形瓶置于温度35℃、转速160转/分钟的空气浴振荡器中培养4天，即获得此条件下青霉菌与光合细菌形成的“混合菌丝球”。

“混合菌丝球”降解2-氯苯酚，降解率为60.3%，好于海藻酸钠固定化细胞PSB-1D降解2-氯苯酚的效果(55.7%)。

实施例3：

(1) 培养基的配制：

将可溶性淀粉15克，NaNO33克，KH2PO4 1克，MgSO4·7H2O 0.5克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 6.0，搅拌均匀，即为富集培养基。

(2) 光合细菌的富集培养：

配制100毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌(115℃，30分钟)。取出锥形瓶冷却至室温。用接种环移取2环实验室冰箱保存的光合细菌至锥形瓶内，用无菌玻璃棒将光合细菌打散、混匀。用黑布将锥形瓶周围包好。将锥形瓶置于空气浴振荡器中进行好氧黑暗培养。培养3天后备用，即得光合细菌种子液。其中，培养温度控制在35℃、空气浴振荡器转速控制在110 转/分钟。

(3) 制备孢子悬液：

(4) 同时接种：

配制85毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌(115℃，30分钟)。在冷却后的锥形瓶中按1：2的比例同时接种体积分数为5%的孢子悬液和体积分数为10%的光合细菌种子液。然后将锥形瓶置于温度25℃、转速110转/分钟的空气浴振荡器中培养3天，即获得此条件下青霉菌与光合细菌形成的“混合菌丝球”。

“混合菌丝球”降解2-氯苯酚，降解率为61.3%，好于海藻酸钠固定化细胞PSB-1D降解2-氯苯酚的效果(55.7%)。

Claims

1.一种利用菌丝球作为生物载体固定化光合细菌的方法，其特征在于，该方法包括如下具体步骤：

（1）将葡萄糖0.1~20克，蛋白胨0.1~20克，KH2PO4 0.1~10克，MgSO4·7H2O 0.01~10克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10%的NaOH和10%的HCl调节pH 6~8，搅拌均匀，即为富集培养基；

（2）配制100毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌115℃，30分钟，取出锥形瓶冷却至室温，用接种环移取2环实验室冰箱保存的光合细菌至锥形瓶内，用无菌玻璃球将光合细菌打散、混匀，取出玻璃球，用黑布将锥形瓶周围包好，将锥形瓶置于空气浴振荡器中进行好氧黑暗培养，培养3天后备用，即得光合细菌种子液；其中，培养温度控制在25~35℃、空气浴振荡器转速控制在110~150 转/分钟；

（3）用无菌水冲洗长有青霉菌孢子的斜面固体培养基的表面，并用接种环轻刮斜面，将冲洗后的含有青霉菌孢子的悬浮液用移液管移至锥形瓶中，添加无菌水使得每毫升悬浮液中含有青霉菌孢子106个，然后轻轻摇晃锥形瓶，使其中的孢子呈均匀分散状态，即得孢子悬液；

（4）配制70~85毫升富集培养基，倒入250毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌115℃，30分钟，在冷却后的锥形瓶中按1：1～2的比例同时接种体积分数为5~10%的孢子悬液和体积分数为10~20%的光合细菌种子液，然后将锥形瓶置于温度25~35℃、转速110~160 转/分钟的空气浴振荡器中培养2~4天，即获得青霉菌与光合细菌形成的混合菌丝球；

所述光合细菌是一株可降解2-氯苯酚的沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris），16SrDNA序列为GenBank Accession No. HM068966。